Reseña Bibliográfica

Biotecnología Vegetal Vol. 3, No. 4: 211 - 221, octubre - diciembre, 2003

Aspectos relacionados con el ambiente físico y la caracterización molecular de la embriogénesis somática

Raúl Barbón Rodríguez

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: raul@ibp.uclv.edu.cu

RESUMEN

En el presente trabajo se realiza una breve reseña sobre la influencia del ambiente in vitro en el proceso morfogenético de la embriogénesis somática, específicamente el efecto que tienen determinados gases que se acumulan en la fase gaseosa de los frascos de cultivo como son el oxígeno, el dióxido de carbono y el etileno sobre la embriogénesis somática. Se hace referencia también a biomoléculas como las proteínas, isoenzimas, poliaminas y arabinogalactanoproteínas que están relacionadas con el proceso morfogenético de la embriogénesis somática.

Palabras clave: ambiente in vitro, Embriogénesis somática, embrión somático, marcadores moleculares

ABSTRACT

In the current work, a review on the influence of the in vitro environment in the morphogenetic process of the somatic embryogenesis is carry out, specifically the effect of certain gases accumulated in the gas phase of the culture vessel; such as oxygen, dioxide of carbon and ethylene on the somatic embryogenesis. A reference to biomolecules such as proteins, isoenzime, polyamine and arabinogalactano proteins which are related with the morphogenetic process of the somatic embryogenesis is also made.

Key words: in vitro environment, molecular markers, Somatic embryogenesis, somatic embryo

INTRODUCCIÓN

La embriogénesis somática in vitro fue desarrollada por primera vez a partir de callos de zanahoria (Daucus carota L.) por Reinert en 1958. Este hecho constituyó el punto de partida para que en los últimos 40 años se lograra inducir la embriogénesis somática en más de 200 especies de diferente origen filogenético, tanto de plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas.

La embriogénesis somática está llamada a ser dentro de poco tiempo la nueva vía de propagación masiva para diferentes especies de plantas porque brinda una serie de ventajas como es la obtención de vólumenes de producción superiores en un menor periodo de tiempo y a un costo más bajo con respecto a la propagación por organogénesis. Sin embargo, a pesar de haberse descrito la embriogénesis en un gran número de especies, todavía es necesario un mayor estudio básico de la embriogénesis somática y de las bases bioquímicas de la misma (Shimazu y Kurata, 1999) que permitan incrementar la eficiencia y repetibilidad de estos sistemas.

Continuamente se introducen nuevas especies de interés agrícola como modelos que contribuyen a profundizar aún más en la morfogénesis vía embriogénesis somática.

El estudio y la optimización de la embriogénesis somática se ha centrado en los últimos tiempos en los componentes fundamentales del medio de cultivo, prestándosele poca atención a la atmósfera gaseosa dentro del frasco de cultivo (Auboiron et al., 1990).

Dentro de las variables físicas que conforman el ambiente in vitro, el efecto del oxígeno disuelto en la multiplicación y diferenciación de suspensiones celulares embriogénicas ha sido el más estudiado en diferentes cultivos como Picea abies (Kvaalen y Arnold, 1991), Daucus carota (Jay et al.,1992; Shigeta et al., 1996; Shimazu y Kurata, 1999), Cyclamen persicum (Hohe et al., 1999), Oryza sativa L. (Okamoto et al., 1996), cafeto (Jiménez et al.,1995; de Feria, 2000). Sin embargo muy poca atención se le ha prestado a la influencia de otros componentes del ambiente físico in vitro sobre la embriogénesis somática como son el dióxido de carbono y el etileno.

Los estudios del efecto del CO2 en el cultivo in vitro se han concentrado en el mejoramiento y optimización de la propagación de plantas vía organogénesis en cultivos mixotróficos y autotróficos bajo condiciones controladas (Kozai et al., 1996; Niu et al., 1996). Los estudios que se comienzan sobre el efecto del CO2 sobre la embriogénesis somática se basan en la fisiología de los embriones cigóticos en la semilla botánica, donde hay una disminución paulatina del oxígeno y un aumento del dióxido de carbono (Miyoshi y Sato, 1997). Con el desarrollo de la embriogénesis somática en diferentes cultivos y las ventajas que esta brinda en relación con la organogénesis, se han comenzado los estudios sobre el efecto del CO2 (Hohe, 1999, Hohe et al., 1999) y otros gases como el etileno (Auboiron et al., 1990), con el objetivo de optimizar el proceso y aumentar la calidad de los embriones somáticos obtenidos.

El monitoreo y control de variables físico-químicas en los biorreactores ha permitido dilucidar aspectos positivos de la atmósfera gaseosa para optimizar procesos embriogénicos tanto de especies de interés agrícola como ornamentales (Preil et al., 1998; Hohe, 1999). Se han realizado pocos estudios sobre los sistemas de producción de embriones somáticos empleando biorreactores (Preil et al., 1988; Cazzulino et al., 1991; Gupta et al., 1991; Denchev et al.,1992; Harrell et al., 1994 y Ibaraki et al., 1995). Sin embargo, en estos sistemas al igual que en los frascos de cultivo el efecto de los diferentes factores del ambiente físico continúan sin investigarse profundamente.

El desarrollo de la bioquímica y la biología molecular en plantas ha permitido identificar moléculas relacionadas con los procesos de diferenciación celular (Van Engelen y de Vries, 1992; Samaj et al., 1999; Saare- Surminski et al., 2000) y se puede destacar el papel de poliaminas, isoenzimas y proteínas como las glicoproteínas y las arabinogalactanoproteínas (AGPs) en la inducción y regeneración de embriones somáticos (De Vries, 1988; Meijer et al., 1999).

El ambiente físico en el cultivo in vitro

El ambiente in vitro se caracteriza por alta humedad relativa, una temperatura constante, bajo nivel de densidad de flujo de fotones fotosintéticos, fluctuación en la concentración de CO2, alta concentración de azúcar, sales y reguladores del crecimiento en el medio de cultivo, la acumulación de sustancias tóxicas y la ausencia de microorganismos. Estas condiciones por lo general causan bajos niveles de transpiración, de absorción de agua, nutrientes y de CO2; pero un alto nivel de respiración en la oscuridad, lo que resulta en un pobre crecimiento celular. Kitaya et al. (1998) afirmó que un microambiente controlado promueve el crecimiento y desarrollo de plantas, reduce los desordenes morfológicos y fisiológicos, y estimula rápidamente el crecimiento de plantas vigorosas.

El ambiente físico influye en el crecimiento y desarrollo morfogénetico del tejido in vitro (Nguyen y Kozai, 1998; Kozai et al., 1996). La atmósfera gaseosa en el frasco de cultivo con determinado material vegetal en sus inicios está compuesto principalmente de N2 (78.0%), O2 (21.0%) y CO2 (0.035%). La composición del gas en el frasco de cultivo está influenciada por el volumen del vaso de cultivo y la magnitud de la ventilación. El etanol, los acetoaldehídos y el etileno, así como otros hidrocarburos son componentes adicionales de la atmósfera gaseosa in vitro (Ziv, 1995). Los factores más notables son el CO2, O2, etileno, temperatura y humedad relativa.

Papel del dióxido de carbono disuelto en el medio de cultivo

Debido a la limitación del intercambio gaseoso en los frascos de cultivo, la concentración de CO2 en los vasos de cultivo inoculados con tejidos clorofílicos decrece lentamente dos horas posteriores al comienzo del fotoperíodo, alcanza una concentración estable pero significativamente menor que la concentración de CO2 en condiciones normales (0.035%), pero es mucho mayor con respecto al punto de compensación (0.005-0.010% CO2) al final del fotoperiódo (Hayashi et al., 1993). La micropropagación fotoautotrófica tiene sólo efectos beneficiosos para el cultivo tejidos clorofílicos los cuales tienen un balance de CO2 positivo durante el fotoperiódo a una concentración de 0.035% o mayores (Jeong et al.,1993). Niu et al. (1996) y Niu y Kozai (1997) desarrollaron modelos para predecir el nivel de fotosíntesis y concentración de CO2 en los frascos de cultivo para plantas de Cymbidium y Solanum tuberosum L. Se ha observado el efecto positivo del CO2 sobre la morfogénesis vía organogénesis en algunos cultivos como Ipomea batatas (Heo y Kozai, 1999; Brasicca oleracea (Zobayed et al.,1999) y Solanum tuberosum L. (Niu et al., 1997).

En una mezcla homogénea, la presión parcial de dióxido de carbono en la fase líquida está en equilibrio con la fase gaseosa y puede ser, por lo tanto, fácilmente determinada en el gas de salida. Hace pocos años que se han comenzado a emplear electrodos esterilizables para determinar la presión parcial de CO2 en medios de cultivos líquidos en investigaciones con suspensiones celulares (Preil et al. 1998).

Los efectos del CO2 sólo están señalados principalmente para plantas in vitro bajo condiciones autotróficas, heterotróficas o mixotróficas Niu et al.,1996, (Kozai et al., 1997, Kitaya et al., 1998; Heo et al.,1999) y para cultivo de suspensiones celulares usadas para la producción de metabolitos secundarios (Buddendorf-Joosten y Woltering, 1994).

Todavía no hay suficiente información precisa sobre el papel del CO2 en la embriogénesis somática con el empleo de suspensiones celulares (Preil y Beck, 1991; Hohe, 1999). En experimentos con suspensiones no embriogénicas de Catharanthus roseus se llegó a la conclusión de que este cultivo es muy sensible al CO2 disuelto y el crecimiento celular se vio reducido a concentraciones por encima y por debajo de un intervalo óptimo (Hergarty et al., 1986). Se ha señalado que el CO2 es esencial para el crecimiento celular de las suspensiones y que la eliminación del mismo de la aireación es una causa fuerte que propicia la inhibición del crecimiento (Esashi, 1989).

Kranz (1988), observó que sólo las células derivadas de la fase estacionaria en un sistema de cultivo de suspensiones celulares cerrado de nabo (Brassica napus L.) fueron un inóculo adecuado para la inducción de la embriogénesis somática. Se estima que los requerimientos de CO2 que no están implicados con un proceso de fotosíntesis deben estar relacionados con alguna que otra vía metabólica en la biosíntesis de aminoácidos. Según Preil (1991), los altos resultados obtenidos en erlenmeyers con respecto a las biorreactores fue debido a la diferencia en la atmósfera gaseosa de ambos frascos de cultivo.

El papel del oxígeno en el cultivo in vitro

La concentración de oxígeno tiene un efecto sobre la fotorespiración de plantas C3. A concentraciones normales de O2, las plantas C3 ex vitro pierden hasta el 50.0% del CO2 fijado por fotosíntesis debido a la fotorespiración. Sin embargo esta pérdida de CO2 es suprimida a bajas concentraciones de O2.

La concentración de O2 en el frasco de cultivo decrece paralelamente con el incremento de la concentración de CO2 (Doi et al., 1989). En Caladium bicolor (C3) decrece la concentración de CO2 en el frasco de cultivo con el incremento del CO2, mientras que en Dendrobium phalaenopsis (CAM), decrece la concentración de oxígeno en mayor proporción que el incremento de la concentración de CO2. Esto indica que los cambios en el consumo y producción de CO2 dependen del tipo de fijación de CO2 de la planta en cuestión (Fujiwara y Kozai, 1995).

El etileno en el cultivo in vitro

Es conocido que el gas etileno (C2H4) causa numerosas influencias hormonales en las plantas. Las concentraciones de etileno y compuestos tóxicos (productos de la oxidación de fenoles) en la fase gaseosa de los frascos de cultivo poseen una tendencia al incremento durante el cultivo (Nguyen y Kozai, 1998). A diferencia del oxígeno y el CO2, el etileno es solamente liberado pero no absorbido por el tejido in vitro y por lo tanto, pudiera ser liberado del frasco de cultivo una vez acumulado. La vía para resolver este problema es incrementar el número de intercambios gaseosos del frasco de cultivo o el empleo de una ventilación forzada (Fujiwara y Kozai, 1995).

El ambiente físico in vitro y la embriogénesis somática

Muchos de los efectos del CO2, O2 y C2H4 han sido descritos para el crecimiento de plantas in vitro (Buddendorf-Joosten y Woltering, 1994), pero poco se conoce sobre la influencia de la atmósfera gaseosa sobre el proceso de embriogénesis somática (Shimazu y Kurata, 1999).

El O2 y el CO2 son de importancia tanto para la embriogénesis cigótica como para la embriogénesis somática en algunas especies (Kvaalen y von Arnold, 1991). Hace más de 30 años, Kessel y Carr (1972) demostraron que en suspensiones celulares de zanahoria existía un desarrollo de la embriogénesis si la presión parcial de O2 (pO2) disminuía, mientras que la embriogénesis del cultivo de anteras podía ser inducida con elevadas concentraciones de CO2. Este gas a pesar de su conocido efecto positivo en la fotosíntesis de las plantas, también promueve el crecimiento en suspensiones celulares heterotróficas de Caranthus roseus (Ducos et al., 1993).

Según Johansson y Eriksson (1984) es posible que se promueva la fijación en la oscuridad del CO2 a elevadas concentraciones y mejore por esta vía el desarrollo de la embriogénesis somática en microsporas de Papaver. Señalaron también que en la especie Clematis venticela se estimuló la embriogénesis somática en cultivos de anteras cuando el tejido fue incubado a una concentración de dióxido de carbono de 2.0%, y se obtuvo un mayor rendimiento del número de embriones somáticos por explantes en medio de cultivo semisólido, al mantener el material vegetal durante 60 días bajo el efecto del CO2 con respecto a otros explantes incubados durante un menor tiempo de cultivo. Según Ziv (2000) los requerimentos de CO2 en procesos no fotosisntéticos como es la embriogénesis somática, pudiera estar involucrado en determinadas vias metabólicas como es la biosintésis de aminoásido.

Algunos autores plantean que es posible que la presión parcial de CO2 estimule el crecimiento del tejido embriogénico (Kvaalen y von Arnold, 1991). Mientras que Ma et al.(1998) demostraron que la fijación de CO2 en la oscuridad en callos de Nicotiana tabacum conduce a la acumulación de malato, el cual se cree juega un papel en la osmorregulación en la expansión celular entre las sucesivas divisiones celulares.

Experiencias realizadas por Hohe et al. (1999) demostraron un mejor crecimiento de suspensiones celulares de Cyclamen persicum en biorreactores a bajas concentraciones de dióxido de carbono, mientras que la obtención de embriones somáticos mejoró con altas concentraciones de CO2 en la mezcla gaseosa.

El proceso de inducción y diferenciación de embriones somáticos está muy vinculado con el comportamiento de los pH del medio de cultivo y la concentración de CO2 en el frasco de cultivo. Según George (1993) esto podría deberse a que:

- La concentración de CO2 modifica el pH del medio de cultivo e influye sobre el proceso de embriogénesis somática.

-  El CO2 actúa como estimulador del proceso de embriogénesis somática a determinadas concentraciones y por tanto hay mayor consumo nitrogéno en forma de amonio lo que hace disminuir el pH.

- Pudiera existir una combinación de las hipótesis anteriores.

Al estimular el CO2 el proceso de diferenciación celular, pudiera existir una preferencia por el nitrógeno en forma de amonio en un medio de cultivo enriquecido con nitrógeno en forma de amonio y nitrato. Por su parte, George (1993), explica que a medida que el pH es menos ácido esta fuente de nitrógeno (NH4+) es más asimilable por los cultivos en suspensión y su consumo implica la liberación al medio de cultivo de protones H+ lo que provoca una disminución en los valores de pH, condición esta (acidez del medio de cultivo) que favorece la absorción del nitrógeno en forma de nitrato, resultando en una liberación de iones (OH)- al medio de cultivo y en consecuencia un gradual incremento en los niveles del pH, momento este que coincidió además con la formación de los primeros embriones somáticos en etapa globular. Comportamientos similares del pH han sido descritos para la fase de diferenciación suspensiones celulares de Daucus carota L. (Archambault et al., 1995) y de Coffea arabica L. cv. Catimor (de Feria, 2000).

Smith y Krikorian (1990), al trabajar la diferenciación de células de zanahoria, pero en un medio de cultivo semisólido libre de reguladores del crecimiento, obtuvieron que con un pH cercano a 4.0 se mantuvo la proliferación y multiplicación de proembriones y sólo cuando el pH fue ajustado a un valor de 5.80, se observaron las restantes etapas de la embriogénesis somática para este cultivo.

También con el cultivo de la zanahoria Jay et al. (1994), observaron que a pH 4.30 los embriones somáticos no se desarrollaron más allá de la etapa de corazón, mientras que, a valores de 5.80 los embriones somáticos maduraron y dieron lugar a plantas más desarrolladas con grandes raíces y cotiledones verdes individualizados.

Es muy discutido el por qué de esa típica variación del pH. También Chen y Kao (1997) y Hvoslef-Eide (2000) plantearon que la acidificación del medio de cultivo en los biorreactores fue debido a la asimilación de amonio al comienzo del cultivo y un posterior incremento del pH por la activación de la enzima nitratoreductasa la cual produce la reducción del anión nitrato. Mientras que Preil et al. (1996), observaron que cuando el pH disminuyó en suspensiones celulares de Cyclamen persicum, la concentración de iones amonio y nitratos se mantenía alta (78 y 79%) y disminuían paralelamente. Según Sakano et al. (1997), la disminución del pH podría ser debido a la asimilación de iones potasio y la inducción de las enzimas malatosintetasa y citratosintasa, lo cual provoca cambios en el pH citoplasmático lo cual conduce a la activación de la bomba de protones y la liberación de protones hacia el medio de cultivo e incorporación de iones potasio al interior celular.

La diferenciación y germinación de los embriones somáticos parecen ser inhibidos por el etileno (Biddington, 1992; Merkle et al., 1995). De hecho, la adición de inhibidores de la síntesis de etileno, como cobalto, níquel (Roustan et al., 1989), y el ácido salicílico (Roustan et al., 1990), activan la embriogénesis somática en Daucus carota L. Sin embargo, en el caso de Medicago sativa L., la maduración de los embriones somáticos requiere de la presencia de etileno (Merkle et al., 1995).

La embriogénesis somática puede ocurrir bajo diferentes regímenes de luz y/o oscuridad (Thorpe, 1988); una intensidad luminosa alta es esencial para obtener embriones somáticos en Nicotiana tabacum L. Sin embargo, la embriogénesis somática se favorece generalmente mediante incubación en la oscuridad continua (Ammirato, 1987); en Daucus carota L. (Ammirato y Steward, 1971) y Manihot sculenta Crantz (Szabados et al., 1993) se emplea la oscuridad para el desarrollo y maduración normal de los embriones somáticos.

Por otra parte, durante la germinación, es necesario el control de la intensidad de luz y el fotoperiodo.

Los pretratamientos con frío pueden ser beneficiosos para la embriogénesis somática (Thorpe, 1988), y se han empleado rutinariamente para estimularla en cultivos de anteras en Juglans regia L. y Vitis spp. (Nitsch,1974).

Aspectos moleculares de la embriogénesis somática

De la embriogénesis somática se han estudiado sus aspectos morfológicos y algunos físiológicos pero los mecanismos moleculares que determinan y controlan el proceso son poco conocidos. Se ha determinado que ocurren cambios en la expresión de lo genes al inducirse el desarrollo embriogénico, como es la síntesis de proteínas específicas del embrión somático (Sung y Okimoto, 1981), incremento en la actividad descarboxilasa orgánica (Montague, 1999), incremento en la actividad enzimática en la vía pirimidínica (Ashihara et al., 1981) y en el desarrollo de la capacidad para inactivar ciclohexamidas (Sung et al., 1981). Después de iniciada la embriogénesis somática por factores externos como la presencia de 2,4-D, ocurre la reprogramación de la expresión génica. Este proceso génico es responsable de la ocurrencia normal de esta vía de desarrollo en las plantas. Una clasificación de los genes involucrados en la embriogénesis de acuerdo con las etapas del proceso fue realizado por Dure (1985):

-  Genes que se expresan durante el desarrollo o constitutivos.

-  Genes que se expresan sólo en embriones o específicos de embriones.

- Genes que se expresan durante la embriogénesis temprana.

- Genes que codifican para proteínas de semilla sin madurar.

- Genes que se expresan durante la embriogénesis tardía antes de germinar la semilla. Según de Vries et al. (1988), no existen en explantes de zanahoria (Daucus carota L.) células competentes para formar embriones. Estas adquirieron la competencia 19 días después de iniciado el proceso de cultivo en un medio de cultivo que contenía 2,4-D. El óptimo de la capacidad embriogénica fue adquirido después de 50 días de iniciado el cultivo. La adquisición del potencial embriogénico en cultivos en frescos es acelerada adicionando al medio de cultivo un medio condicionado libre de células o cocultivo para establecer cultivos embriogénicos (Veisseire et al., 1994 y Meijer et al., 1999). El análisis del medio condicionado ha revelado que proteínas extracelulares son secretadas por células embriogénicas en el medio de cultivo, las cuales actúan como marcadores moleculares para distinguir entre cultivos embriogénicos y no embriogénicos.

Proteínas

En los últimos años se han reconocido algunos marcadores moleculares que indican la transición de células somáticas a células embriogénicas; además de alrededor de 21 genes específicos o relacionados con la embriogénesis han sido clonados a partir de embriones somáticos (Zimmerman, 1993). En 1987, Choi et al. describieron el aislamiento de genes los cuales se expresaban durante la embriogénesis somática, así como el conocimiento de su función mediante técnicas de biología molecular. Estos genes son los denominados LEA (Late Embryogenesis Abundant), los que se regulan por la vía metabólica del ácido abscísico y se expresan durante la embriogénesis tardía, así como el caso de dc3 y EMB-1 (Wurtele et al., 1993) y dc8 (Hatzapoulos et al., 1990). También se ha aislado el gen ep1, exclusivo de células no embriogénicas (Van Engelen et al., 1991).En cultivos celulares de Medicago sativa L. se encontraron dos proteínas análogas a la ep-1 que disminuyen considerablemente su concentración al eliminar el 2,4-D el medio de cultivo (Poulsen et al., 1996). Otro gen aislado es el ep2, el cual codifica para una proteína que transfiere lípidos específicos de células embriogénicas de zanahoria (Sterk et al., 1991), este gen codifica para una proteína no glicosilada de 10 kD, transportadora de monómeros de cutina a la cutícula (que se forma tan pronto aparece la protodermis del embrión), cuya función es prevenir el alargamiento celular en el ambiente hipotónico lo cual limita la entrada de agua en la célula; dichos monómeros pueden ser esterificados, una vez en la cutícula, para el crecimiento de la misma. La ep-2 se ha utilizado como indicador de la embriogénesis somática, además de en zanahoria, en uva (Contos-Thevenot et al., 1992), alfalfa (Poulsen et al., 1996) y Saccharum spp. (Rodríguez et al., 1999).

Se ha confirmado la presencia de proteínas de 32 kD análogas a ep-3, también relacionadas con la capacidad embriogénica en diversas especies, Coffea canephora P. , Coffea arabica L. (Cevallos, 2000) y Saccharum sp (Rodríguez, et al., 1999). En estas últimas especies se ha obtenido un anticuerpo policlonal (a-PE32) para la proteína análoga a ep-3 de caña de azúcar (PE-32) (Rodríguez et al. 1996), que también detecta proteínas de 32 kD asociadas a la embriogénesis somática en Coffea canephora P . y Coffea arabica L. (Cevallos, 2000).

Relacionado con la competencia embriogénica se ha aislado el gen ep-5, el cual codifica para una peroxidasa catiónica de 38 kD, que recupera la competencia embriogénica de cultivos celulares bloqueada por tunicamicina antes de la adquisición del etapa globular de los embriones somáticos, y que podría actuar en el proceso embriogénico reduciendo la extensibilidad de la pared celular (Cordewener et al., 1991).

Recientemente se han aislados otros genes en zanahoria, muchos de los cuales se encuentran todavía en estudio, como el gen chb1 que se expresa en todas las etapas de la embriogénesis , el gen chb2 que se inhibe su expresión con la adición de 2,4-D, los genes chb4 y chb5 que se expresan en la etapa de torpedo y participan en la formación del hipocótilo y la raíz, y el gen 21d7 asociado a la división celular (Komamine, 1998); así como el gen que codifica para la proteína de los cuerpos lipídicos que conforman la membrana celular (Kawara y Komamine, 1995).

Se ha sugerido que la capacidad embriogénica de los tejidos en cultivo in vitro depende de su contenido en poliaminas libres (Beranger-Novat et al., 1990). Se ha señalado en varios cultivos la posible importancia de los niveles de poliaminas (PAs) (Berros, 1996; Yadav y Radam, 1998) sobre inducción embriogénica en explantes, aunque tal dependencia podría estar relacionada con el tipo de tejido empleado como explante, puesto que la capacidad embriogénica de secciones foliares de Solanum melongena L. parece depender del contenido de PAs (Yadam y Rajav, 1998). También parece ser un prerrequisito general para la embriogénesis somática el incremento de PAs durante la inducción embriogénica a partir de explantos o callos (Albrechtová et al.,1994), aunque tal correlación puede ser inversa en algún sistema experimental como ocurre en callos nucelares de Manguifera indica L. (Litz y Schaffer, 1987), e incluso no existir en la embriogénesis a partir de cotiledones de Solanum melongena L.

Isoenzimas

De acuerdo con Moss (1982) se define como isoenzimas a las múltiples formas moleculares de una misma enzima que ocurren de una misma especie, como resultado de la presencia de más de un gen codificando para cada una de ellas

La definición de las isoenzimas como marcadores moleculares ha sido controvertida, ya que algunos las denominan marcadores bioquímicos (Gepts, 1994) mientras que otros, considerando propiamente su base genética, las incluyen entre los marcadores moleculares (León, 1998). La utilidad de las isoenzimas como marcadores se encuentra bien documentada y las variantes genéticamente definidas de las isoenzimas han demostrado su importancia en la evaluación de la variabiliadad de especies como arroz, maíz, frijol, papa, ajo, trigo y soya entre otras (Sánchez, 1999).

Las isoenzimas desempeñan una misma actividad catalítica, pero presentan diferentes movilidades electroforéticas, dadas por las diferencias en secuencias de aminoácidos y, en última instancia, como el resultado de las variaciones a nivel de las secuencias de ADN que codifican estas enzimas. Por ello se asume que estas diferencias poseen base genética y son heredables (Murphy et al., 1990).

La caracterización de las estructuras embriogénicas y no embriogénicas es útil y necesaria para el establecimiento de diferencias bioquímicas, moleculares e histológicas entre ellas. Este paso es imprescindible para obtener un cultivo de células homogéneo, que permita futuras manipulaciones en las suspensiones celulares (Noualle y Periart, 1988; Gananapragasam y Vasil, 1992).

Uno de los principales enfoques experimentales abordados ha sido el establecer puntos de comparación entre los tipos celulares en una suspensión. Se han hallado diferencias al comparar células embriogénicas y no embriogénicas en cultivos celulares de zanahoria (Wurtele et al., 1988). El contenido de almidón ha sido mayor en las células embriogénicas, lo que sugiere la posibilidad de que sea degradado más rápidamente en las células no embriogénicas. Otro ejemplo es la G-ADP fosforilasa, aunque su actividad resulta similar en ambos tipos de células, los resultados señalan que se trata de isoenzimas distintas, ya que su movilidad e hibridación fueron diferentes para los tejidos embriogénicos y no embriogénicos. En la etapa globular y corazón hay un aumento en la síntesis de lípidos, ocurriendo también cambios en el contenido de ácidos grasos en las etapas tempranas del desarrollo del embrión somático (Thompson y Thorpe, 1989).

El aspecto bioquímico estudiado como posible marcador de la embriogénesis somática es el patrón electroforético de proteínas, antes y durante el desarrollo del embrión somático (Slay et al., 1989; Kioyosue et al., 1991). Aún cuando difieren los resultados, está claro que existen diferencias notables en algunos casos entre los tejidos embriogénicos y los que no lo son, para diferentes enzimas. Se ha determinado para el maíz, la glutamato hidrogenasa y la esterasa, como marcadores para distiguir callos embriogénicos y no embriogénicos (Everette et al., 1985); esta última también sirve para diferenciar entre dos tipos de tejidos en Soya (Stejskal y Griga, 1985). En zanahoria, una peroxidasa de pI 7.6 parece ser un buen marcador de la embriogénesis somática, la cual actúa en la complementación, restableciendo la embriogénesis somática de un cultivo inhibido con Tunicamicina (Joersbo et al., 1989; Cordewever et al., 1991).

Un aumento de la actividad peroxidasa (Px), al igual que otras diferencias en los patrones isoenzimáticos de callos E y NE fueron detectadas por Kochba et al. (1987), citados por Lukse et al. (1997) en callos de naranja (Citrus sinensis L.).

La determinación de la actividad peroxidasa en diferentes subcultivos de callos de caña de azúcar en condiciones de laboratorio, permitieron comprobar que resulta mayor en los callos potencialmente embriogénicos (subcultivo 3) en comparación con los NE o poco embriogénicos (subcultivo 8) (Lukse et al., 1997).

Las arabinogalactanoproteínas (AGPs)

Las arabinogalactanoproteínas (AGPs) pertenecen a la familia de los proteoglicanos, los cuales están ampliamente distribuidos en el reino vegetal (Fincher et al., 1983). Se encuentran fundamentalmente en la membrana plasmática, pared celular y espacios intercelulares de las células (Komalavilas et al., 1991; Serpe y Nothnagel, 1995). Las AGPs son una mezcla de grupos de proteoglicanos que forman parte de macromoléculas ricas en hidroxiprolina. Estas son distinguidas por su alta relación de carbohidratos a proteína, predominando residuos de galactosa y arabinosa y en menor cantidad otros azúcares como ácido urónico. Típicamente la proteína está conformada por gran proporción de los aminoácidos

hidroxiprolina, serina, alanina, glicina y treonina (Du et al. 1996; Kreuger y van Holst, 1996). En estudios de clonación de algunas arabinogalactanoproteínas se ha dilucidado que la secuencia primaria varía, sin embargo se presentan dominios homólogos.

Las arabinogalactanoproteínas son proteínas tejido-específico en las plantas y en las suspensiones celulares son secretadas las AGPs en el medio de cultivo, variando en dependencia de la edad del cultivo y del potencial embriogénico (Kreuger y van Holst, 1995). Mediante el empleo de anticuerpos monoclonales que reconocen a AGPs se ha demostrado la regulación del desarrollo de algunos AGP-epitopos en órganos y embriones somáticos (Knox, 1997). Se ha encontrado que estas moléculas son importantes para la embriogénesis somática en zanahoria, por el hecho de que la adición de extractos de AGPs de semillas a suspensiones celulares subcultivadas durante dos años y suspensiones de líneas celulares no embriogénicas conllevó a la reinducción del potencial embriogénico (Kreuger y Van Holst, 1993). Estos autores caracterizaron los anticuerpos ZUM 18 y ZUM 15, empleando la base de la especificidad de los epitopos de dos AGPs, los cuales pueden mejorar (fracción de AGP ZUM 18) o inhibir (fracción de AGP ZUM 15) la embriogénesis somática (Kreuger y van Holst, 1995). Sin embargo, Toonen et al. (1997) demostraron que la fracción ZUM 18 añadida a líneas celulares embriogénicas no tiene ningún efecto en la frecuencia y morfología de los embriones somáticos.

Las AGPs reaccionan también con el reactivo de Yariv, molécula sintética que contiene fenil-β-glucósidos (Yariv et al., 1962). Este reactivo ha sido muy utilizado en la detección, cuantificación y aislamiento de las arabinogalactanoproteínas en tejidos de plantas y cultivos celulares (Zhu et al. 1993). En el reactivo de Yariv es necesario que el enlace glicosídico esté en la conjugación β-anomérica para que reaccione con las AGPs reconocido como el reactivo (β-D-Glc)3 Yariv. Existen otros reactivos de Yariv, los cuales no reaccionan con AGPs como el reactivo (β-D-Man)3 Yariv y el reactivo (-D-Galc)3 Yariv. Estos reactivos pueden servir como controles para distinguir efectos relacionados con los AGPs de efectos no específicos al emplearse el reactivo (β-D-Glc)3 Yariv en sistemas biológicos (Ding et al., 1997).

Es conocido que las AGPs juegan un papel importante en el proceso de embriogénesis somática (Knox, 1997; Nothnagel, 1997). La mayoría de los estudios se han realizado en la especie Daucus carota L, con el empleo de microscopía de inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos que reconocen AGPs , como es el epitopo JIM 4 el cual se encuentra en mayor proporción en la superficie de células periféricas de masas proembriogénicas de Daucus carota L.y en la dermis de proembriones (Knox,1997). Además, durante el desarrollo de embriones somáticos en etapa cotiledonal, estos epitopos pueden ser encontrados en el tejido provascular y en el hipocotilo (Stacey et al., 1990). Por otro lado, el anticuerpo MAC 207 reconoce su epitopo dentro de todas las células de masas proembriogénicas. Otros epitopos de AGPs reconocidos por el anticuerpo JIM 8 fueron originalmente descritos como un marcador transicional de las células que rodean a las masas proembriogénicas de suspensiones celulares embriogénicas de zanahoria (Pennell et al., 1992). Se demostró que los embriones somáticos desarrollan células sin el epitopo JIM18 (Toonen et al., 1996) y la fracción de AGPs que contenía este epitopo tenia un efecto inhibitorio sobre la frecuencia de embriones desarrollados a partir de células simples (Toonen et al., 1997). Como en zanahoria, la fracción ZUM18 mejoró el potencial embriogénico de suspensiones celulares de Cyclamen por incremento de la frecuencia de aparición de masas proembriogénicas (Kreuger et al., 1995) y la fracción extracelular de AGPs estimuló el desarrollo completo de los embriones somáticos de abeto (Picea abies) (Egertsdotter y Arnold, 1995). Mc Cabe et al. (1997) refirieron que JIM 8 representa una señal soluble liberada por células no embriogénicas y es reconocida por las célula embriogénicas y es regulada por la densidad celular en suspensiones celulares de zanahoria.

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