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Artículo científico Biotecnología vegetal Vol. 3, No. 1: 13-18, enero-marzo 2003
Caracterización in vitro de la respuesta al NaCl en callos en las fases de multiplicación y regeneración de varios genotipos de arroz
Pedro Orellana Pérez1* y Pablo Leandro Peña González2. * Autor para correspondencia.
1 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní Km. 5 ½ Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e-mail: porellana@ibp.uclv.edu.cu
2 Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro Universitario de Las Tunas. Ave. Carlos J. Finlay s/n. CP 75200. Las Tunas, Cuba. e-mail: pablolpg@yahoo.com
RESUMEN
En el presente trabajo se determinó la respuesta en diferentes fases del desarrollo in vitro de cuatro somaclones de arroz para tolerancia a la salinidad, a distintas concentraciones de NaCl. Los somaclones utilizados para el estudio fueron: IAC-25´, IAC-26´, R-13-K1-1-10´, R-20-K1-1-2´, como control tolerante a la salinidad se empleó la variedad Pokkali´ y como susceptible la variedad MI-48´. Se encontró una respuesta diferencial para la tolerancia a la salinidad entre los genotipos tolerantes y susceptibles en dependencia de la concentración de NaCl en el crecimiento del callo y la regeneración de plantas. De acuerdo con el comportamiento en los experimentos realizados, el somaclon más tolerante en niveles hasta 1.5% in vitro de NaCl en ambas fases de desarrollo, fue el IAC-25´, con un comportamiento similar a la variedad Pokkali. El resto de los somaclones, presentaron bajos niveles de tolerancia en comparación con la variedad resistente. En la fase de multiplicación del callo se requirieron dos subcultivos consecutivos en el medio de cultivo que contenía NaCl para obtener una clara expresión diferencial entre genotipos tolerantes y susceptibles a esta sal.
Palabras clave: callo, salinidad, niveles, somaclones, regeneración
ABSTRACT
This paper present the in vitro response in two different development stages of four rice somaclons for the salt tolerance using five NaCl concentrations. The evaluated somaclons were: IAC 25, IAC 26, R 13 - K1 - 1- 2 and R 20 - K1 -1 2. The varieties Pokkali and Mi 48, were used as resistant and susceptible controls, respectively. It was find a differential reaction for tolerants and susceptibles genotypes for the salt tolerance in dependence of the NaCl concentration in the callus growing and regeneration stages. The regeneration stage showed higher sensibility to NaCl concentration. According with these results, the somaclon IAC 25 like the Pokkali variety, expressed salt tolerance until 1.5% of NaCl in both development stages. The others somaclons presented low salt tolerance levels compared with the resistant variety. In the multiplication stage of the callus two continuous subcultures on the culture media with NaCl are necessary in order to express a clear differential reaction between tolerant and susceptible genotypes to this sal.
Key words: callus, levels, regeneration, salinity, somaclons
INTRODUCCIÓN
La salinización de los suelos constituye una de las principales problemáticas de la producción arrocera de Cuba, provocando una notable reducción de los rendimientos y disminución creciente de las áreas productivas.
Existen en el país alrededor de 100 000 hectáreas dedicadas al cultivo del arroz, de las cuales más del 60% se encuentran afectadas por diferentes grados de salinización, de ellas unas 33 000 hectáreas con alto grado, localizadas en las zonas arroceras de las provincias de Granma, Pinar del Río, Santi Spíritus y Matanzas (Labrada, 1999). Es por ello que disponer de variedades de arroz con un mayor grado de tolerancia a la salinidad reviste gran importancia.
La mejora y selección genética de este carácter ha sido difícil mediante el uso de los métodos clásicos en los programas de mejoramiento genético. Una de las vías para el mejoramiento de este carácter lo constituye el empleo de técnicas biotecnológicas. Adkins (1992) planteó que la variación somaclonal puede ser una forma para generar variabilidad genética, la que unida a la selección in vitro puede resultar una poderosa herramienta para la obtención de variedades tolerantes a diferente estrés abióticos. Resultados de investigaciones sobre obtención de líneas celulares o somaclones tolerantes a la salinidad han sido publicados desde hace varios años, entre ellos González (1987); Krishnaraj y Screerangasamy (1993); González (1993) y Flowers y Yeo (1995). El empleo de la ingeniería genética y nuevos métodos de selección han propiciado avances más rápidos en la obtención de genotipos tolerantes (Singh et al., 2002; Omokawa y Aonuma, 2002).Las correlaciones parciales utilizando la prueba de Pearson con el programa SPSS.
Por otra parte, se ha trabajado en la determinación de marcadores morfológicos, fisiológicos y moleculares en variedades de arroz con respecto a tolerancia a la salinidad (Bohnert y Jensen, 1996; Winicov y Bastola, 1997), lo cual permite una estimación aceptable de la posible explicación genética de la tolerancia de genotipos al estrés salino.
El objetivo del presente trabajo fue determinar la posibilidad de identificar genotipos de arroz tolerantes al efecto tóxico del NaCl en las fases de multiplicación y regeneración de callos y la posible relación para la respuesta en ambas fases.
MATERIALES Y MÉTODOS
Técnicas y procedimientos generales
Para este estudio se utilizaron cuatro somaclones de arroz: IAC-25, IAC-26, R-13-K1-1-10 y R-20-K1-1-2, obtenidos desde cultivo de anteras de la variedad de arroz Perla. Las variedades usadas como controles fueron la `Pokkali´ como tolerante a la salinidad y la `MI-48´ como susceptible. Todos los genotipos pertenecen a la especie Oryza sativa L. y a la subespecie índica, excepto la variedad Pokkali que pertenece a la subespecie japónica. Las semillas fueron obtenidas en la Estación Territorial de Investigación del Arroz, Vado del Yeso, Granma.
A todas las variables analizadas se les realizó la prueba de bondad de ajuste a la distribución normal (procesamiento no paramétrico de Kolmogorov-Smirnov) y la prueba de homogeneidad de varianza de Cochran. Se aplicó un análisis de varianza simple y prueba de rangos múltiples de Duncan al 5% de significación; en algunos casos el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal- Wallis. Se determinaron
Variables evaluadas
Se evaluó el crecimiento de los callos cada 96 horas según la escala propuesta por Santana (1982) hasta los 20 días, tomándose este parámetro como un indicador de tolerancia a la salinidad.
Estudio del crecimiento de los callos en un medio de cultivo con diferentes concentraciones de NaCl durante la fase de multiplicación
Desinfección del explante:
Como explantes iniciales se utilizaron semillas maduras y sin la cubierta (cáscara). Para la desinfección de estas se procedió al descascarado manual. Luego se llevó a cabo el procedimiento referido por González (1987). Por último se enjuagaron tres veces en agua destilada estéril.
Inducción de callos:
Para la inducción de callos se empleó el medio de cultivo basal compuesto por las sales, vitaminas y sacarosa de Murashige y Skoog (1962) en estado semisólido y la adición de 2.0 mg.l-1 de 2,4-D.
Se utilizaron como explantes 100 semillas por somaclon o variedad, colocándose dos semillas por tubo de ensayo de 15 x 1.5 cm, cada tubo contenía 5 ml del medio de cultivo. Para la obtención de callos los explantes se mantuvieron durante 21 días en ausencia de luz a una temperatura de 27 ± 2 ºC.
Multiplicación de los callos:
Al cabo de los 21 días los callos formados se subdividieron, colocando 15 callos por frasco. Cada frasco contenía 25 ml del mismo medio de cultivo y se mantuvieron en la oscuridad durante el mismo período de tiempo y a la misma temperatura señalada. Después de dos subcultivos de multiplicación, se seleccionaron los callos más compactos y friables y se seccionaron en segmentos de 3 a 4 mm para ser evaluados en el medio de cultivo con el NaCl. Se utilizaron cinco tratamientos con el mismo medio de cultivo basal con diferentes concentraciones de NaCl, incluyendo un tratamiento sin la sal (Tabla 1).
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Del total de callos con grado tres o superior en la escala de Santana (1982), el 50% fueron sometidos a un segundo subcultivo en medio selectivo con la misma concentración de NaCl, determinándose igualmente el valor del crecimiento del callo.
Regeneración de plantas a partir de callos tratados con diferentes concentraciones de NaCl en la fase de multiplicación
El 50% de los callos provenientes de los que crecieron en las diferentes concentraciones de NaCl, en el primer subcultivo, fueron transferidos a un medio de cultivo para la regeneración de plantas (medio de cultivo MS suplementado con 1.5 mg.l-1 de BAP) y llevados a una cámara de crecimiento de luz solar indirecta, con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos que osciló entre 48.0-62.5 µ mol. m-2. s-1. El 100% de los callos con crecimiento superior a tres en la escala de Santana (1982) durante el segundo subcultivo de multiplicación fueron también transferidos al mismo medio de cultivo de regeneración. Para estos experimentos se emplearon tres frascos por tratamientos y 15 callos por frasco para cada subcultivo. Después de 20 días, en cada concentración de NaCl se evaluó el porcentaje de callos que regeneraron plantas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudio del crecimiento de los callos en un medio de cultivo con diferentes concentraciones de NaCl durante la fase de multiplicación
Crecimiento de los callos durante el primer subcultivo
El crecimiento de los callos en la fase de multiplicación se redujo en la medida que se incrementó la concentración de NaCl, mostrando la mayor afectación en la concentración de 2% (Tabla 2). Entre los genotipos se obtuvo la mejor respuesta para el somaclón IAC-25´ y la variedad Pokkali´ (control tolerante a la salinidad), que no mostraron diferencias entre sí para ninguna concentración. En el resto de los genotipos el comportamiento fue muy similar al genotipo susceptible(Mi 48). Los resultados mostraron que hasta el nivel de 1.5% de NaCl en el medio de cultivo se presentan diferencias entre los genotipos que pueden estar relacionadas con el nivel de tolerancia, pero el comportamiento fue similar al nivel de 2% donde no se produjo crecimiento de los callos. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Marassi y Rapela (1989) empleando iguales concentraciones de NaCl.
Crecimiento de los callos durante dos subcultivos consecutivos en NaCl
Al analizar el comportamiento de los callos que crecieron en las mismas concentraciones de NaCl durante dos subcultivos consecutivos (Tabla 3), se observó la misma tendencia observada en el primer subcultivo, pero las diferencias entre genotipos se encontraron a partir de la concentración de 1.0% de NaCl. Los somaclones IAC 25 y el R-20-K1-1-2 fueron los de mejor comportamiento al compararse con el control resistente, no difiriendo de este en las mayores concentraciones de NaCl. En los genotipos donde el crecimiento fue sensiblemente afectado desde 1.5% de NaCl (IAC 26, R-13-K1-1-10 y Mi 48) este quedó prácticamente inhibido.
En los dos experimentos analizados el cultivar Mi 48 susceptible presentó el menor crecimiento del callo, difiriendo significativamente del control tolerante (Pokkali) y del somaclón IAC 25, lo cual indicó que este último presentó tolerancia al NaCl en esta fase del crecimiento celular.
Los resultados indicaron que al cultivar los callos en dos subcultivos consecutivos en la fase de multiplicación con NaCl, las diferencias entre genotipos tolerantes y susceptibles se expresaron de forma más evidente. Este comportamiento pudo deberse al efecto de la selección continua durante los dos subcultivos, donde las células más tolerantes presentan mayores posibilidades para multiplicarse. Estos resultados sugieren la necesidad de realizar, al menos, dos subcultivos en el medio de cultivo con el agente selectivo para que se exprese más claramente la respuesta diferencial al NaCl en esta fase y utilizar como concentración máxima, 1.5% de este agente selectivo.
El aspecto de los callos que presentaron crecimiento en el medio de cultivo sin NaCl fue de color amarillento y de características friables. Los que fueron colocados en el medio de cultivo con NaCl y no crecieron, se tornaron de pardos oscuros a negros, debido a que el tipo y grado de pigmentación está marcadamente influenciado por factores nutricionales y ambientales. En los de mayor tasa de crecimiento (mayor que tres en la escala de Santana, 1982), se observó la formación de grupos celulares nuevos de color más blanco y friables.
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Suenaga et al. (1982) encontraron que el crecimiento de los callos de arroz fue fuertemente retardado en concentraciones de NaCl de 1.0 a 1.5% y severamente dañado a 2.0%, no observándose crecimiento de callos a 3.0%, por lo que recomendaron utilizar la concentración de 1.5% para la selección de líneas de callos mutantes tolerantes a la salinidad.
Según Reddy y Vaidyanath (1986) las líneas resistentes a la salinidad en condiciones salinas, son capaces de mantener una relación hídrica favorable para enfrentarse a los iones potencialmente tóxicos y obtener los nutrientes requeridos a pesar del predominio de otros iones en el medio. Este fundamento, también referido por Golldack et al. (2003), pudiera explicar el comportamiento de la variedad Pokkali y el somaclon IAC 25 en este estudio. Un mecanismo a esta respuesta puede ser el que refieren Chattopadhayay et al. (2002), quienes descubrieron que las plantas de la variedad Pokkali acumulan poliaminas superiores tales como espemidina y espermina en respuesta al estrés salino, mientras que el genotipo Mi 48 es incapaz de mantener esos niveles en similares condiciones.
Los resultados obtenidos evidenciaron que la tolerancia a la salinidad se expresa a nivel celular. Meredith (1984) realizando estudios intergenéricos, interespecíficos e intraespecíficos detectó diferencias en cuanto a la tolerancia a la salinidad que se reflejaban a este nivel.
Regeneración de plantas a partir de callos tratados con diferentes concentraciones de NaCl en la fase de multiplicación
En callos con un subcultivo en la fase de multiplicación
En el primer subcultivo se encontró que la concentración salina influyó en la capacidad regenerativa, observándose una gran diferencia entre los callos tratados con NaCl y los no tratados. La capacidad regenerativa de los callos se redujo en la medida que se incrementó la concentración de NaCl, mostrando una alta afectación aun en la concentración más baja (Tabla 4). Entre los genotipos se obtuvo la mejor respuesta para el somaclón IAC-25´ y la variedad Pokkali´ (control tolerante a la salinidad), que no mostraron diferencias entre sí para ninguna concentración, seguidos por el somaclón IAC 26 con un porcentaje de regeneración inferior. Los resultados mostraron que para esta fase de desarrollo hasta el nivel de 1.5% de NaCl en el medio de cultivo, se presentan diferencias en los genotipos que parecen estar relacionadas al grado de tolerancia, pero el comportamiento es similar al nivel de 2% donde no se produjo la regeneración de plantas en ningún genotipo.
En callos con dos subcultivos consecutivos en el medio de cultivo de multiplicación
Al analizar el comportamiento de la regeneración de callos procedentes de dos subcultivos en las mismas concentraciones de NaCl (Tabla 5), se observó un comportamiento muy similar a los callos provenientes de un subcultivo, tanto en la afectación por la presencia del NaCl en el medio de cultivo, como por la respuesta de los genotipos IAC 25 yPokkali. Como diferencia en el comportamiento de los callos con un subcultivo, se observó que la afectación fue más drástica a partir de la concentración de 1.0% de NaCl, donde la capacidad regenerativa fue prácticamente inhibida en todos los genotipos. Para este caso, en todos los tratamientos, incluyendo el que no contenía NaCl, el porcentaje de regeneración fue relativamente más bajo al compararse con los valores obtenidos en los callos del primer subcultivo. Este comportamiento puede explicarse por la pérdida de la capacidad regenerativa de los callos en la medida que se aumenta el número de subcultivos en muchas especies (Pérez et al., 1998), lo cual se hace más notable en los callos bajo el estrés salino.
Los resultados indicaron que el NaCl, aun a bajas concentraciones en la fase de multiplicación del callo, afectó notablemente la capacidad regenerativa de estos aun en los genotipos tolerantes a este agente, por lo cual no es recomendable emplear la evaluación de la capacidad regenerativa como criterio de selección de tolerancia al NaCl en arroz, no obstante se encontró, que los genotipos que presentaron mayor crecimiento del callo mostraron también el mayor porcentaje de regeneración. Una correlación positiva y altamente significativa con un valor de b = 0.826** , se encontró para la respuesta al estrés salino en ambos estados de desarrollo del callo.
Afectaciones en la disminución de la regeneración de brotes con el incremento de las concentraciones salinas han sido obtenidas por Marassi y Rapela (1989) y González (1993). Labrada (1999) recomendó que concentraciones de NaCl entre 4 mM y 10 mM pueden ser adecuadas para la obtención de callos en genotipos tolerantes y la posterior regeneración in vitro de plantas de arroz.
Al igual que en la fase de multiplicación del callo, el cultivar susceptible Mi 48 fue el más afectado, presentando el menor porcentaje de regeneración de sus callos, difiriendo significativamente del control resistente(Pokkali) y del somaclón IAC 25, lo cual ratifica la tolerancia de este somaclon al NaCl.
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De los callos que no regeneraron, una baja frecuencia presentó emisión de raíces sin brotes meristemáticos foliares y la mayor parte murieron. También se presentaron casos aislados de vástagos carentes de clorofila (albinos). Krishnaraj y Screerangasamy (1993) seleccionaron líneas de arroz tolerantes a la salinidad a partir de cultivo de anteras y encontraron que con el incremento de las concentraciones salinas disminuyó la sobrevivencia de los callos y aumentó la frecuencia de plantas albinas, indicando que muchas de estas variaciones fueron de carácter epigénetico.
CONCLUSIONES
El crecimiento de callos durante dos subcultivos consecutivos en medios de cultivo de multiplicación que contengan hasta 2.0% de NaCla, permitió obtener una expresión diferencial para la tolerancia a esta sal entre genotipos tolerantes y susceptibles.
El somaclon IAC-25´ presentó tolerancia al efecto tóxico de NaCl, al compararse con la variedad resistente Pokkali´ y la susceptible Mi 48.
La fase de regeneración de callos en medios de cultivo que contenían NaCl, fue fuertemente afectada aun a bajas concentraciones tanto en genotipos tolerantes como susceptibles a esta sal.
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