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ISSN 2074-8647, RNPS: 2154 (Versión electrónica)
ISSN
1609-1841, RNPS: 0397 (Versión impresa)
Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai contra Mycosphaerella fijiensis Morelet
In vitro antagonism of Trichoderma harzianum Rifai against Mycosphaerella fijiensis Morelet
Mayra Acosta-Suárez1, Tatiana Pichardo1, Berkis Roque1, Mileidy Cruz-Martín1, Eilyn Mena1, Michel Leiva-Mora1, Rosa Castro2, Yelenys Alvarado-Capó1
1Instituto
de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las
Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba.
CP 54 830
2Facultad
de Recursos Naturales. Departamento de Fitopatología. Escuela Superior
Politécnica de Chimborazo. Panamericana Sur km 1 ½. Riobamba. Ecuador.
CP 06-01-4703
RESUMEN
Se evaluó el antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum frente Mycosphaerella fijiensis, patógeno foliar de plátanos y bananos. Los ensayos se efectuaron mediante el método de cultivo dual. La competencia por espacio y nutrientes, la capacidad antagónica y las formas e intensidad del antagonismo se determinaron tomando en cuenta la invasión de la superficie de la colonia, colonización y esporulación de T. harzianum sobre M. fijiensis a los siete días de inoculación. Finalmente se evaluó el efecto de metabolitos volátiles de T. harzianum. Los resultados mostraron que existió antagonismo in vitro de T. harzianum sobre M. fijiensis por competencia tanto por espacio como por los nutrientes del medio de cultivo. Trichoderma creció sobre la colonia del patógeno con hiperparasitismo e intensidad elevada. Además, cubrió totalmente la superficie del medio de cultivo. T. harzianum no inhibió el crecimiento de M. fijiensis por metabolitos volátiles. Se observaron daños en la integridad de la pared celular de las hifas de M. fijiensis y salida del contenido celular al exterior. El empleo de hongos antagonistas, pudiera contribuir al diseño de estrategias para el manejo integrado de esta enfermedad.
Palabras clave: bananos y plátanos, biocontrol, mecanismos de acción
ABSTRACT
The in vitro antagonism of Trichoderma harzianum against Mycosphaerella fijiensis, foliar pathogen of banana and plantain, was evaluated. The assays were performed using the dual culture method. Competition for space and nutrients, the antagonistic capacity and forms and intensity of antagonism were determined considering the invasion of the surface of the colony, colonization and sporulation of T. harzianum on M. fijiensis after seven days of inoculation. Finally, the effect of volatile metabolites of T. harzianum was evaluated. The results showed in vitro antagonism of T. harzianum against M. fijiensis by competition for space and nutrients of the culture medium. Trichoderma grew over the pathogen colony with hyperparasitism and high intensity. Also, it completely covered the surface of the culture medium. T. harzianum not inhibited the growth of M. fijiensis by volatile metabolites. Damage was observed in the integrity of the cell wall of M. fijiensis hyphae and the cell content exit. The use of antagonistic fungi, could contribute to the design of strategies for integrated management of this disease.
Key words: banana and plantain, biocontrol, mechanisms of action
INTRODUCCIÓN
Mycosphaerella fijiensis Morelet es un patógeno fúngico que ocasiona la enfermedad conocida como Raya negra de la hoja o Sigatoka negra (Marín et al., 2003). Aunque se han desarrollado numerosos estudios sobre la interacción entre la planta y el patógeno en aras de diseñar mejores estrategias de control y se aplican sistemas de manejo integrado, aún sigue siendo la enfermedad más perjudicial para este cultivo (Churchill, 2010).
La aplicación de fungicidas de origen químico es el método de control más efectivo para combatir esta enfermedad, sin embargo, el costo total de su inversión para la protección de plantaciones de bananos ha sido muy elevado. Por ello, se requieren estrategias de manejo integrado más eficientes y menos dañinas al medio ambiente entre las cuales pudiera estar el control biológico si se identifican microorganismos con alta capacidad antagonista (Guzmán, 2012).
Entre las especies más ampliamente estudiadas y aplicadas como agentes de control biológico, se encuentran las del género Trichoderma. Se han descrito diferentes mecanismos de acción que le permite el control de los hongos fitopatógenos. Entre estos se encuentran: competencia por el sustrato, micoparasitismo, antibiosis, desactivación de enzimas del patógeno y resistencia inducida. Mientras mayor cantidad de mecanismos posea un aislamiento de Trichoderma, más eficiente y duradero será el control sobre el agente fitopatógeno que se desee controlar; aspectos que no poseen los plaguicidas químicos (Howell, 2003; Infante et al., 2009).
Estudios previos realizados por Arzate-Vega et al. (2006) informaron del antagonismo in vitro y en casa de cultivo de dos cepas nativas (México) de Trichoderma frente a M. fijiensis aunque no se especificaron los mecanismos por los cuales se inhibía el crecimiento del patógeno. La identificación de cepas de Trichoderma con potencial para el control de este patógeno foliar podría contribuir al manejo de la enfermedad. Este trabajo tuvo como objetivo determinar in vitro la capacidad antagónica de una cepa de Trichoderma harzianum frente a M. fijiensis.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se emplearon las cepas de Trichoderma harzianum CCIBP-T4 y M. fijiensis CCIBP-Mf83 pertenecientes a la Colección de Cultivos Microbianos del IBP. Ambos microorganismos se enfrentaron mediante cultivo dual en placas de Petri de 90mm de diámetro con medio de cultivo agar papa y dextrosa (PDA). Se colocó en un extremo de la placa un disco de 7mm de diámetro de micelio del patógeno (tomado del crecimiento en placa de Petri inoculada con suspensión micelial en medio de cultivo PDA) y en el extremo opuesto otro disco de 7mm con micelio del antagonista con 50mm de separación entre ellos (Howell, 2003). Los cultivos se incubaron a 30°C y oscuridad y cada 24 horas se midió el crecimiento radial del micelio de los hongos hasta los siete días de inoculados.
Además, se evaluó la capacidad antagónica de T. harzianum según escala propuesta por Bell et al. (1982) (Tabla 1) y las formas e intensidad del antagonismo por los criterios propuestos por Davet et al. (1981). Como formas de antagonismo se consideraron: el antagonismo físico donde las hifas de los dos hongos forman un relieve en la zona de contacto, antagonismo químico en el cual las hifas dan origen al fenómeno de lisis en la zona de contacto, antagonismo por hiperparasitismo que implica que las hifas del antagonista recubren las del parásito entrelazando o entrecruzándose con estos y ocupando el espacio vital y antagonismo físico-químico donde las hifas de los dos hongos no alcanzan a tomar contacto, dando origen a un espacio vacío. La intensidad del antagonismo se catalogó como elevado (evidente, el patógeno es inhibido en el crecimiento más del 25%), intermedio (el patógeno es inhibido en el crecimiento menos del 25%) o escasa (el patógeno no es inhibido en el crecimiento por el antagonista).
Además, se determinó el tipo de interacción entre las hifas (enrollamiento, penetración, vacuolización o lisis) mediante microcultivos (Riddel, 1950) donde se inocularon el patógeno y el antagonista de conjunto. Para las observaciones se utilizó un microscopio Olympus (400x).
Finalmente, se comprobó si el antagonismo era producido por metabolitos volátiles de T. harzianum. Para esto se siguió el protocolo propuesto por Dennis y Webster (1971). En una tapa de una placa Petri de 90mm de diámetro se añadió medio de cultivo PDA mezclado con una suspensión de micelio de M. fijiensis (5.0x105 fragmentos de micelio. ml-1). En la tapa de otra placa Petri se añadió medio de cultivo PDA con un disco de micelio de 7mm de diámetro de Trichoderma harzianum. Se colocaron las dos tapas una frente a la otra y se sellaron con Parafilm®. Las placas se incubaron a 28ºC durante siete días. Pasado el tiempo de incubación se observó el crecimiento de la suspensión de micelios de M. fijiensis y se comparó con el control en ausencia del antagonista.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se observó antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum CCIBP-T4 frente a M. fijiensis CCIBP-Mf83. M. fijiensis es un hongo filamentoso de crecimiento lento en condiciones in vitro y sus colonias son compactas y aterciopeladas (Meredith y Lawrence, 1969). En el cultivo dual se comprobaron estas características con muy poco cambio en el diámetro de la colonia al término del periodo de evaluación. Sin embargo, ya a los cuatro días de enfrentamiento, el antagonista alcanzó un crecimiento radial de 70mm, cubrió la totalidad del medio de cultivo y sobrecreció la colonia de M. fijiensis (Figura 1). Ello evidenció una mayor velocidad de crecimiento, competencia por espacio y por los nutrientes del medio de cultivo.
La capacidad antagónica de Trichoderma harzianum sobre M. fijiensis fue de grado 1 ya que sobrecreció completamente la colonia del patógeno y además, el micelio cubrió la superficie del medio de cultivo en toda la placa de Petri. Por otra parte, la forma del antagonismo fue por hiperparasitismo, las hifas del antagonista recubrieron las del patógeno entrelazando o entrecruzándose con este y ocuparon todo el espacio vital aunque no se observó enrollamiento ni penetración. La intensidad del antagonismo fue elevada porque se inhibió en un 100% el crecimiento de M. fijiensis y además, se observó esporulación T. harzianum sobre el micelio de M. fijiensis (Figura 1).
En presencia de Trichoderma harzianum, se observaron daños en la integridad de la pared celular de las hifas de M. fijiensis con ruptura y derrame del contenido celular (Figura 1). Se comprobó, además, la utilidad del cultivo dual mediante microcultivos ya que la interacción de ambos hongos filamentosos se pudo observar directamente sin necesidad de tomar muestras de la zona de contacto de las hifas.
Los resultados de las observaciones microscópicas sugieren la posible presencia de enzimas extracelulares del antagonista con actividad lítica sobre las hifas del patógeno. Sobre lo anterior, diferentes investigaciones han mostrado evidencias de la producción de enzimas por especies de Trichoderma entre las que se mencionan quitinasas, glucanasas y proteasas que contribuyen a la degradación de las paredes celulares de los microorganimos patógenos (Neves et al., 2010).Se requieren otros estudios para profundizar en este aspecto e identificar las enzimas que pueden estar presentes en esta interacción de T. harzianum y M. fijiensis.
La presencia de metabolitos volátiles producidos por la cepa de T. harzianum no inhibió el crecimiento de M. fijiensis.
Los resultados de esta investigación se corresponden con los informados por otros autores sobre el antagonismo in vitro de T. harzianum sobre hongos fitopatógenos. En este sentido, Suárez et al. (2008) comprobaron mayor competencia por los nutrientes y el espacio vital de T. harzianum frente a Fusarium solani (Mart) y asociaron este fenómeno con la velocidad de crecimiento, una mayor intensidad metabólica así como una mayor tasa de incorporación y asimilación de nutrientes. Por su parte, Osorio-Hernández et al. (2011) evaluaron el efecto antagonista in vitro de 31 cepas de Trichoderma frente a Phytophthora capsici Leonian. Los resultados indicaron que el 97% de las cepas mostraron competencia y cubrieron la placa completamente.
Se ha considerado que el antagonismo de Trichoderma es variable. Este depende de diferentes factores entre los cuales se encuentran la especificidad de la cepa y sus mecanismos de acción. Por tanto, pueden existir aislamientos que sean más eficientes para el control de un patógeno que otro. Por tal motivo, la especificidad debe ser evaluada (Martínez et al., 2008).
El empleo de hongos antagonistas, como Trichoderma harzianum pudiera contribuir al diseño de estrategias para el manejo integrado de esta enfermedad.
CONCLUSIONES
Se comprobó la capacidad antagónica de Trichoderma harzianum contra M. fijiensis en condiciones in vitro. Ello se evidenció a través de competencia tanto por el espacio vital como por los nutrientes del medio de cultivo. Además, se observó hiperparasitismo con intensidad elevada, ruptura de los extremos de las hifas y derrame del contenido celular.
REFERENCIAS
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Recibido: 19-07-2013
Aceptado: 20-09-2013
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