no. 1, 2002.p65 
Artículo científico                                                                      Biotecnologia vegetal vol. 2: 15-19, enero-marzo 2002

 

 

Inducción de callos y regeneración de plantas en Tectona grandis L.

Marcos Daquinta*, Luis Ramos, Iris Capote, Yarianne Lezcano, Romelio Rodriguez, Maritza Escalona. *Autor para correspondencia.

Laboratorio de Cultivo de Celulas y Tejidos, Centro de Bioplantas, Universidad de Ciego de Ávila. Carretera Moron km 9, CP 69450. Cuba. Tele/fax 53 33 266340. e-mail: mdaquinta@bioplantas.cu

RESUMEN

El trabajo con especies de interés comercial constituye una de las líneas prioritarias de la biotecnología, como herramienta básica en el apoyo al mejoramiento de árboles élites. La teca (Tectona grandis L.), es un forestal de alto interés comercial y ecológico por su rápido crecimiento y la calidad de su madera. Es una especie que tiene graves problemas para la propagación por la alta variabilidad genética de las plantas producidas por semillas. El objetivo de este trabajo fue establecer una metodología para la regeneración de plantas de esta especie forestal con vistas a utilizarla en los programas de mejoramiento genético. Se utilizaron como explantes ápices y botones florales de árboles adultos y cotiledones de semillas. Las semillas se desinfectaron con HgCl2 al 0.2% durante 10 minutos. para el establecimiento in vitro de los cotiledones. Se evaluaron diferentes concentraciones de Thidiazuron en los explantes antes señalados, con el objetivo de lograr la formación de callos y diferentes niveles de Bencilaminopurina y Kinetina para la emisión de brotes. Se logró la formación de callos en todos los explantes empleados. Se formaron callos nodulares a partir de los segmentos de ápices, cotiledones y botones florales y se regeneraron brotes en los callos provenientes de ápices.

Palabras clave: cultivo de tejidos, organogénesis, teca

ABSTRACT

The rescue of commercial species is a priority for biotechnology to increase multiplication rate and develop reforestation. Such programmes can be carried out simultaneously with the development of the country to mantain the ecosystem natural equilibrium. Teak (Tectona grandis L.) is a forest tree of high commercial and ecological value because of its rapid growth and wood quality. Teak is a specie with problems in the propagation as a result of its high genetic variability. For this reason, alternatives to produce propagules have been developed. With the aim to obtain plants regeneration from this were used shoot tips and flowers immature of mature tree explants and cotyledons from seed. Different thidiazuron concentrations was tested for callus formation and cytokinins for plants regeneration. Nodular calli was obtained from shoot tips, cotyledons and flowers immature. The shoots regeneration was achieved in calli from shoot tips.

Key words: organogenesis, teak , tissue culture

INTRODUCCIÓN

La biotecnología es una herramienta que contribuye, tanto a la conservación de la biodiversidad genética, como a la innovación de procedimientos tecnológicos. La producción de plantas con el empleo de esta vía es una alternativa para el rescate y la preservación de los recursos filogenéticos de los bosques tropicales y de esta forma se puede mantener la dinámica y el equilibrio del ecosistema forestal y así el medio ambiente.

La Teca (Tectona grandis L.), especie forestal tropical introducida, es originaria de la India, Tailandia y Laos. Esta planta rápidamente ha ganado un puesto preferencial en el mercado mundial por lo vistoso de la madera y la resistencia a enfermedades, entre otras razones. Su cultivo en Cuba procede de semillas introducidas desde Trinidad y Tobago. Es un forestal que se proyecta a ocupar un lugar muy importante en las exportaciones de la Isla (Betancourt, 1987).

La micropropagación de la Teca vía organogénesis directa mediante el desarrollo y enraizamiento de brotes axilares ha sido descrita con éxito por Nadgauda et al. (1997), Monteuuis et al. (1998) y recientemente por Daquinta et al. (2001), como una herramienta para la propagación masiva, reemplazando en un elevado porcentaje a los sistemas de propagación tradicional. De esta manera se podrán producir plantas de genotipo deseado con una alta estabilidad genética provenientes de bancos y jardines clonales. Sin embargo, no se cuenta con un método de regeneración indirecta que pueda ser empleado en los programas de mejoramiento genético.

Teniendo en cuenta estos antecedentes el presente trabajo se propuso el siguiente objetivo: Evaluar la capacidad de diferentes explantes de Teca en la formación de callos y la regeneración de plantas a partir de estos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Evaluación de diferentes niveles de Thidiazuron (TDZ) en la formación de callos en ápices, entrenudos, cotiledones y botones florales

Para evaluar el TDZ en la inducción de callos se utilizaron ápices y entrenudos de brotes provenientes de plantas in vitro obtenidas a partir de árboles plus según Daquinta et al. (2001), así como cotiledones de semillas y botones florales de árboles, los cuales fueron previamente desinfectados con bicloruro de mercurio (HgCl2) a 0.2% durante 10 minutos y después enjuagados varias veces con agua destilada estéril.

Tanto los ápices y entrenudos de los brotes así como los cotiledones y botones florales fueron establecidos en los tratamientos siguientes:

--MS (Murashige y Skoog, 1962) al que se adicionó 0.0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg.l-1 TDZ.

Se utilizó un diseño completamente al azar con 10 repeticiones por tratamiento. Cada frasco constituyó una repetición, con siete explantes por frasco. Los cultivos se mantuvieron en la cámara de luz artificial con un flujo de fotones fotosintéticamente activos de 26 µmol.m-2.s-1. A las seis semanas se evaluó el número de explantes que formaron callos, así como las características de los mismos.

Inducción de brotes a partir de callos de ápices de Teca

Para inducir la regeneración de brotes se emplearon 200 mg de callos obtenidos a partir de ápices de Teca en medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) con 2.0 mg.l-1de TDZ y se subcultivaron en los siguientes medios de cultivo:

--MS

--MS +0.5 mg.l-1 BAP +0.25 mg.l-1 Kin

--MS +0.25 mg.l-1 BAP +0.12 mg.l-1 Kin

Se incubaron en condiciones de luz artificial con un flujo de fotones fotosintéticamente activo de 26 µmol.m-2.s-1. Se utilizó un diseño completamente al azar con 10 repeticiones por tratamiento. Cada frasco constituyó una repetición, con siete explantes por frasco. A las seis semanas se evaluó el número de callos que regeneraron plantas.

Para el procesamiento estadístico se empleó el análisis de varianza simple y se realizó la prueba de Duncan, mediante el procesador estadístico SPSS. Los datos en porcentaje se transformaron según la ecuación X= 2arc sen √X/100.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación de diferentes niveles de TDZ en la formación de callos en ápices, entrenudos, cotiledones y botones florales

En la tabla 1 se presenta el comportamiento del TDZ en la formación de callos a partir de diferentes explantes de Teca.

Como se observa la formación de callos a partir de ápices de plantas in vitro aumentó con el incremento de las concentraciones de TDZ en el medio de cultivo. La mayor respuesta en la formación de callos se obtuvo con 2.0 mg.l-1. De igual modo, se encontraron diferencias en la respuesta con 0.5 y 1.0 mg.l-1 del producto. La menor respuesta se obtuvo con 0.1 y 0.25 mg.l-1 de TDZ, sin diferencias entre estos niveles, con un comportamiento por debajo de la dosis intermedia, pero sin diferencias estadísticas.

Murthy et al. (1998) señalaron que la aplicación del TDZ inducía diversas respuestas, desde la inducción de callos hasta la formación de embriones somáticos. Estos autores continuaron señalando que el TDZ puede actuar a través de la modulación de los reguladores del crecimiento endógenos en las plantas, ya sea de forma directa o como resultado del estrés inducido.

Existe relativamente poca información disponible concerniente al tipo de callo inducido por el TDZ. Sin embargo, a bajas concentraciones, el TDZ, generalmente, tiende a fomentar la formación de callos nodulares verdes y compactos (Murthy y Saxena, 1998). En el presente trabajo se obtuvieron callos con estructuras similares a las señaladas por estos autores.

El TDZ está entre las sustancias con actividad como citoquinina más usada para el cultivo de tejidos de plantas maderables. A concentraciones mayores de 0.2 mg.l-1 puede estimular la formación de callos, brotes adventicios o embriones somáticos (Huetteman y Preece, 1993).

Al analizar la tabla 1, se observa que los entrenudos presentaron 100% de formación de callos en todas las concentraciones de TDZ evaluadas. Hay que señalar que estos callos fueron pequeños, compactos y duros, características propias de callos no morfogénicos. Por otra parte, en los cotiledones se logró la formación de callos en todos los niveles de TDZ. Con el medio de cultivo MS con la adición de 0.1 mg.l-1 de TDZ se alcanzó el mayor porcentaje de formación de callos, sin diferencias estadísticas con el porcentaje de callos formados en las concentraciones mayores (1.0 y 2.0 mg.l-1 de TDZ).

Los efectos del TDZ sobre la formación de yemas y brotes a partir de segmentos de hipocotilos de Liquidambar styraciflua (especie forestal) fueron evaluados por Kim et al. (1997a), logrando, a bajas concentraciones de TDZ (0.1 mg.l-1), estimular la producción de brotes. Sin embargo, en este trabajo se logro la inducción de callos en cotiledones con concentraciones iguales a las señaladas por estos autores.

Aunque las respuestas en este tipo de explante están por debajo de las obtenidas en los entrenudos, es de destacar que los callos obtenidos en cotiledones fueron friables, nodulares, con buenas características.

Al continuar el análisis de la tabla 1, se puede observar que los entrenudos presentaron la mayor respuesta a la formación de callo en todas las concentraciones de TDZ. En Xanthosoma sagittifolium, Nyochemdeny y Gaston (1998) encontraron que el TDZ aumentó la producción de callo conjuntamente con el Dicamba y que, resultó más favorable en pecíolos que en otro tipo de explantes. Por lo que, el explante utilizado es un elemento importante para la obtención de callos en una determinada especie. Es de destacar que los callos obtenidos en este trabajo, a partir de entrenudos fueron compactos y muy duros.

A diferencia de los explantes de ápice, la respuesta en los botones florales fue menor. Se encontró respuesta a la formación de callos solo en los medios de cultivo con 0.25 y 0.5 mg.l-1 de TDZ, sin diferencias estadísticas entre estos (Figura 1)

En Teca, los mejores resultados en los ensayos con segmentos de botones florales cultivados con TDZ se lograron con 0.5 mg.l-1, pero si estos resultados se comparan con otros tipos de explantes, los mismos fueron inferiores y por tanto, los explantes menos utilizados. Sin embargo, no dejan de ser explantes interesantes para los trabajos de cultivo de tejidos, por sus características juveniles y una alta actividad meristemática favorables para los procesos de embriogénesis somática.

El uso de tejidos originarios de brotes florales y tejidos embrionarios constituyen una alternativa para la regeneración in vitro de Anacardium occidentale y Theobroma cacao (Bueno et al., 1997 y López-Baez et al., 1998). Carini et al. (1998) señalan la formación de callos embriogénicos en diferentes variedades de Citrus sinensis utilizando como explantes estilo, estigma y óvulos maduros. La formación de callos en botones florales de Teca no está señalada en la literatura por lo que estos resultados son de gran interés.

Los tejidos de flores e inflorescencias han sido usados como explantes para la iniciación de cultivos embriogénicos en plantas maderables, vía embriogénesis somática indirecta (Merkle et al., 1999). Estos investigadores continúan señalando que el uso de tales explantes ofrece una importante ventaja para el mejoramiento de árboles forestales, lo que hace posible la clonación de árboles lo suficientemente maduros para ser evaluados por su crecimiento superior y otras cualidades. Prakash y Chand (1998), con vista a solucionar los problemas de la micropropagación a partir de explantes colectados de árboles adultos de Boswellia serrata , especie forestal, seleccionaron ovarios no polinizados para los estudios in vitro.

Por otra parte, Merkle y Battle (2000) señalaron que la inducción de embriogénesis en Liquidambar styraciflua (una de las especies forestales más importantes de los EE.UU), fue influenciada por el tipo de explante; con flores masculinas se producen hasta cinco veces más embriones que con las inflorescencias femeninas. Las secciones florales de Teca dan lugar a callos grandes, duros y compactos, con apariencias de glóbulos y callos más pequeños, nodulares y con buenas características morfológicas.

Inducción de brotes a partir de callos de ápices de Teca

En la figura 2 se observa el comportamiento de la regeneración de brotes a partir de los callos obtenidos de ápices

Solo se logró la inducción de brotes en el medio de cultivo MS suplementado con 0.5 mg.l-1 de BAP y 0.25 mg.l-1 Kin (Figura 2). Cuando se redujo a la mitad la concentración de estas citoquininas la regeneración fue nula, al igual que en el medio de cultivo sin reguladores del crecimiento.

En Fraximus pensylvanica, Kim et al. (1997b), lograron la formación de brotes con 10 mg.l-1 de BAP. Esta citoquinina ha sido usada exitosamente para inducir brotes adventicios a partir de explantes de hojas de manzana por Sarwar y Skirvin (1997). Al-Juboory et al. (1998) obtuvieron brotes más grandes a partir de hojas de gardenia (Gardenia jasminoides), cuando subcultivaron en medios de cultivo MS con 0.5 mg.l-1 de BAP o 2IP. En Teca, Kushalkar y Sharon (1996) lograron la formación de embriones somáticos a partir de callos de yemas apicales en el medio MS suplementado con 0.1 mg.l-1 de BAP y 0.01 mg.l-1 de ANA. Sin embargo, los callos iniciados a partir de yemas axilares fueron incapaces de formar embriones somáticos sobre medio MS semi-sólido con diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento.

En todos los casos se logró solamente la regeneración de brotes y nunca hubo regeneración de raíces en los mismos, por lo que es necesaria la transferencia de éstos para otros medios con vistas a lograr la formación de raíces.

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