Vol. 12, No.2, 2012.pmd 
Artículo científico                                                        Biotecnología Vegetal Vol. 12, No. 2: 67-76, abril-junio, 2012


 ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)

Identificación de cultivares de tomate con resistencia a begomovirus utilizando marcadores moleculares tipo SCAR y CAPS

Aragón O Erwin,* RojasAldo, Laguna Tomas *Autor para correspondencia

Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria. Colonia Centroamérica, Contiguo al Distrito 5, Policía Nacional-Apartado Postal 1247, Managua, Nicaragua. e-maill earagon17@hotmaiilcom

RESUMEN

El Virus del encrespamiento amarillo del tomate (TYLCV) es un begomovirus trasmitido por la mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.) y es uno de los principales factores que limita la producción de tomate en áreas tropicales y subtropicales del mundo. Se han descrito los genes Ty-1, Ty-2 y Ty-3 relacionados con la resistencia a begomovirus y estos son empleados en los programas de mejoramiento genético en tomate. El presente trabajo se enfocó en identificar cultivares de tomate con genes de resistencias a begomovirus. Se evaluaron 22 accesiones colectadas en seis regiones nicaragüenses y 10 cultivares procedentes de Taiwán, tres cultivares de Cuba y una variedad comercial. Se utilizaron siete marcadores moleculares ligados a los genes de resistencia. Para el gen Ty-1 se utilizaron dos marcadores ttpo CAPS y para el gen Ty-2, se emplpó un marcadortipo SCAR (diferente tamaño) y un marcadortipo CAP. Para el gen Ty-- 3s esaron tres marcadores tipo SCAR (uno tipo presencia/ausencia y dos de diferentes tamaño). Se lograron identificar únicamente seis cultivares introducidos de Taiwán con la presencia del gen Ty-1, no así en los colectados en fincas de productores. En el caso del gen Ty-2, con el marcador SCAR se lograron identificar nueve cultivares procedentes de Taiwán con el gen de resistencia, pero de los colectados a nivel nacional únicamente un genotipo presentó el mismo gen, la misma respuesta se encontró para el marcador CAPS con los cultivares introducidos, no así para los colectados a nivel nacional, el cual logro identificar dos cultivares con presencia del mismo gen. Para el gen Ty-3, únicamente siete cultivares procedentes de Taiwán presentaron el gen, no así los cultivares nacionales, que no presentaron el gen.

Palabras clave: CAPS, Genes de Resistencia, Genotipo, SCAR, TYLCV

ABSTRACT

Tomato Yellow leaf curl virus (TYLCV) is a begomovirus transmitted by whitefly (Bemisia tabaci Genn), this virus is a limited factortotomato yield in tropical and subtropical areas. Nowadays, the genes Ty-1, Ty-2, and Ty-3 are related to begomovirus resistance, which have been used in tomato plant breeding. This study is parr of the regional effort, which tries to find genotypes with those genes related to begomovirus resistances. In the present study 22 accessions collected in Nicaraguan farms and 14 genotypes introduced from Cuba and Taiwán were evaluated. A total of 7 molecular markers linked to begomovirus resistance were used. Two CAPS makers were used to identify Ty-1 gen, identifying only 6 genotypes introduced from Taiwan. Ty-2 gen was identified using a SCAR marker (different sizes) and a CAPS marker. With SCAR and CAPS maker were identified 9 genotypes from Taiwan with Ty-2 gene, SCAR marker was capable to identity one accession and CAPS two accessions from Nicaraguan farmerfor Ty-2 gene. Ty-3 gene presented only 7 genotypes from Taiwan using SCAR marker.

Key word: CAPS, Genotype, Resistance Gene, SCAR, TYLCV

INTRODUCCIÓN

La productividad del cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) se ve limitada por la incidencia de microorganismos fitopatógenos, siendo el Virus del encrespamiento amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) uno de los patógenos más agresivos para la hortaliza a nivel mundial (Dueñas et al., 2001).

Una alternativa para contrarrestar estas enfermedades, es la búsqueda de fuentes de resistencia a estos patógenos, para su incorporación en las variedades comerciales (Morales, 2000).

Hasta la fecha se han identificado tres genes relacionados con la resistencia al TYLCVes, estas son: Ty-1, Ty-2 y Ty-3.

-  El gen Ty-1, fue el primer gen mapeado y presenta una mayor dominancia incompleta. Fue introgresado del tomate silvestre Solanum chítense LA1969 y mapeado en el cromosoma 6(Zamirefa/., 1994).

-  El gen Ty-2, fue introgresado del tomate silvestre S. habrochaites y mapeado en el brazo largo del cromosoma 11 (Hanson et al., 2000).

- El gen Ty-3 el cual fue mapeado en el brazo largo del cromosoma 6 (Jensen etal., 2007).

Este gen fue derivado de S. chítense (LA2779 y LA1932), S. habrochaites, S. peruvianum, y está asociado a la resistencia y/o tolerancia al Virus del enerespamiento amarillo del tomate {TYLCV) y Virus del mosaico del tomate {ToMoV).

Con el avance de las técnicas moleculares, se han desarrollado marcadores moleculares tipo CAPS (del inglés, Cleaved amplified polymorphic sequences) y SCAR (del inglés, Sequence characterized amplified regions) que permiten la identificación y selección de cultivares de tomate con la presencia de estos genes, que pueden ser usados en programas de mejoramiento genético. El presente trabajo tuvo como objetivo identificar genes de resistencia en cultivares de tomate procedentes de Nicaragua, Taiwán y Cuba, para su empleo en programas de mejoramiento genético.

MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) y condiciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se tomó aproximadamente 1 cm2 de hoja de cada material vegetal (Tabla 1 y 2). Para la extracción de ADN de las muestras en estudio se usó el protocolo CTAB (Doyle y Doyle, 1990). El ADN se resuspendió en 100 ul de tampón TE y se mantuvo a -20°C hasta su uso.

Condiciones para PCR

Se utilizaron siete marcadores moleculares, los cuales se describen en la tabla 3.

Para el marcador REX-1, asociado al gen Ty-1, se usaron las condiciones de PCR descrita por Pérez de Castro etal. .2007), ,ue consisten enn 30 ciclos de 94°C por 30 s, 55°C por 30 s y 72°C por 1 min, seguido por un paso de extensión de 72°C por 10 min. Luego, el producto de PCR se incubó a 65°C por dos horas con la enzima de restricción TAqI. Finalmente, el producto PCR se incubó a 65°C por dos horas con la enzima de restricción TAqI.

Las condiciones de PCR para los marcadores asociados al gen Ty-2, se establecieron según el protocolo descrito por García et al. (2007) que consiste en 94°C por 5 min, 35 ciclos de 94°C por30s, 55°C por 1 min y 72°C ppr 2 min, seguidos de un paso de extensión de 5 min a 72°C.

Para los marcadores asociados al gen Ty-3, se empleó el protocolo descrito por Jesen et al. (2007) de 94°C por 3 min 35 ciclos de 94°C por 30s, 50-60°C por 45 segundos dependiendo del marcador, y 72°C por 1 min seguidos de un paso de extensión de 10 min a 72°C.

En el caso del marcador FLU-W25, se usó el programa de PCR descrito por Saluset al. (2007) de 94°C por 3 min, 34 ciclos de 94°C por 30 s, 53°C por 1 min, 72°C por 1 min, seguido por un paso de extensión de 10 min.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Gen Ty-1

Con el empleo del REX-1, se observó la presencia de un alelo de 750 pb (Figura 1) en todos los cultivares analizados. Sin embargo, una vez realizada la digestión enzimática, se observó que los cultivares 1m, 2m, 3m, 7m, 8m y 9m presentaron tres alelos que se ubicaron en un rango de 150 a 350 pb, no así el resto de cultivares que presentaron un alelo de 750 pb. De acuerdo con Pérez de Castro et al. (2007) y García et al. (2007), el marcador REX-1 presenta estos tres alelos cuando un genotipo posee resistencia a TYLCV. Estos seis cultivares fueron obtenidos por mejoramiento en AVRDC e introducido dicho gen.

En estudios previos, se ha determinado que el gen Ty-1 presenta un efecto de dominancia incompleta y que la mayoría de los cultivares comerciales de tomate con resistencia a TYLCV, poseen dicho gen (Pérez de Castro etal., 2007).

Se comprobó que para el marcador TG231, este gen (Figura 2), presentó un alelo homocigoto de 750 pb, para todos los cultivares, una vez realizada la digestión enzimática (Figura 3). Los cultivares 1m, 2m, 3m, 7m, 8m y 9m con presencia del gen Ty-1 conservaron el mismo alelo, no así el resto de los cultivares que presentaron un alelo diferente con un aproximado de 450 pb.

Gen Ty-2

Con el marcador T0302 (Figura 4), de las líneas introducidas de Taiwán, únicamente la accesión 7m no presentó el alelo ligado a resistencia. Las demás líneas presentaron un alelo homocigoto con 950 pb. De los cultivares colectados en Nicaragua, solo el 11.1 s presentó dos alelos, incluyendo el alelo de resistencia a begomovirus (950 pb). En estudios previos, García et al. (2007), informaron que para el marcador T0302, alelos de 950 pb para las líneas resistentes a begomovirus (H24 y S. habrochaites LA0386). En el mismo estudio, se hace referencia al híbrido TyQueen como resistente con un perfii heterocigoto con,dos alelos, incluyendo el alelo con 950 pb.

Se ha descrito que el gen Ty-2 está ligado a la resistencia o tolerancia TYLCV. Fue introgresado de S. habrochaites, a través del uso de marcadores RFLP en el cromosoma 11, entre el marcador TG36 (84 cM) y TG393 (103 cM) en la línea H24 (Hanson etal., 2000). En el AVRCD se está incorporando el alelo Ty-2 a las nuevas líneas comerciales de tomate.

El gen Ty-2, es efectivo contra algunas formas monopartitas de geminivirus, no así contra los bipartitas que prevalecen en América y parte deAsia(AVRDC, 2005).

Por otra parte, con el marcador TG-105A (Figura 5), se encontró un alelo homocigoto para todos los cultivares evaluados. Sin embargo, con digestión enzimática del producto amplificado (Figura 6), se apreció que dos cultivares colectados en Nicaragua (11.1 s y 11.2 s) poseían un alelo de 350 pb, que coincidió con el encontrado en los cultivares con resistencia a TYLCV proveniente de Taiwán. De acuerdo con García etal. (2007), el marcador T0302 es más preciso que TG-105A al identificar el gen Ty-2. Esto se debe a que el marcador TG-105A puede erróneamente identificar el gen 12, asociado a la resistencia a Fusaríum, dado a que ambos genes se encuentran en el cromosoma 11 con una distancia de 1.5 cM entre ambos, por lo cual, se podría implicar la presencia del gen 12 en el genotipo 11.2 s.

Gen Ty-3

Para la identificación del gen Ty3, con el marcador FLU-W25 (Figura 8), se obtuvieron dos tipos de alelos, con 650 pb para los cultivares 1 m, 3m, 4m, 5m, 6m y 7m y 500 pb para el resto. Resultados presentados por Salus et al. (2007), para cultivares resistentes (Gh25, 228-1 y Gc43) mostraron el alelo de resistencia con 600 pb.

El gen Ty-3, fue mapeado en los intervalos 20 cM y 27 cM del cromosoma 6, el cual es uno de los principales locus, responsable de la resistencia a TYLCV. Al mismo tiempo, contribuye a una resistencia parcial al ToMoV (Jensenefa/,,2007).

El marcador P169 (Figura 9) es del ltpo presencia/ ausencia. De los materiales mejorados únicamente CLN3070F1-10-88-8-13-0 (Procedente de Taiwán), AMALIA (Procedente de Cuba) y BUTTER no presentaron presencia del gen Ty-3 para este marcador. En este caso, se observó la poca efectividad de este marcador para detectar dicho gen. En cuanto a los materiales vegetales colectados en las diferentes regiones de Nicaragua, no se presentó el alelo de resistencia.

Con el marcador P6-25 (Figura 9), los materiales vegetales mejorados 1m, 2m, 3m, 4m, 5m, 6m y 7m se comportaron con un perfil heterocigoto, en el cual, el alelo con la presencia del gen tuvo un tamaño de 450 pb aproximadamente. Los demás fueron homocigotos, sin presencia del alelo con un tamaño aproximado 320 pb. Datos similares presentaron Jensen etal. (2007), para el mismo marcador.

CONCLUSIONES

El uso marcadores tipo de SCAR y CAPS para selección asistida en programa de mejoramiento genético, permitió encontrar cultivares (con procedencia del AVRDC de Taiwán, Cuba y Nicaragua) con presencia y ausencia de los genes Ty1, Ty2 y Ty3, que confieren resistencia a TYLCV, los cuales podrían ser incluidos como parentales en programas de mejora genética del cultivo de tomate.

Agradecimientos

El presente trabajo fue realizado gracias al apoyo financiero del programa Fontagro, así como al apoyo brindado por el laboratorio de virología del CIAT-Colombia.

REFERENCIAS

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(Recibido 16-12-2011; Aceptado 1-12-12)



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