Vol. 12, No.2, 2012.pmd
Artculo cientfico                                                        Biotecnologa Vegetal Vol. 12, No. 2: 67-76, abril-junio, 2012


 ISSN 2074-8647 (Versin electrnica)

Identificacin de cultivares de tomate con resistencia a begomovirus utilizando marcadores moleculares tipo SCAR y CAPS

Aragn O Erwin,* RojasAldo, Laguna Tomas *Autor para correspondencia

Instituto Nicaragense de Tecnologa Agropecuaria. Colonia Centroamrica, Contiguo al Distrito 5, Polica Nacional-Apartado Postal 1247, Managua, Nicaragua. e-maill earagon17@hotmaiilcom

RESUMEN

El Virus del encrespamiento amarillo del tomate (TYLCV) es un begomovirus trasmitido por la mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.) y es uno de los principales factores que limita la produccin de tomate en reas tropicales y subtropicales del mundo. Se han descrito los genes Ty-1, Ty-2 y Ty-3 relacionados con la resistencia a begomovirus y estos son empleados en los programas de mejoramiento gentico en tomate. El presente trabajo se enfoc en identificar cultivares de tomate con genes de resistencias a begomovirus. Se evaluaron 22 accesiones colectadas en seis regiones nicaragenses y 10 cultivares procedentes de Taiwn, tres cultivares de Cuba y una variedad comercial. Se utilizaron siete marcadores moleculares ligados a los genes de resistencia. Para el gen Ty-1 se utilizaron dos marcadores ttpo CAPS y para el gen Ty-2, se emplp un marcadortipo SCAR (diferente tamao) y un marcadortipo CAP. Para el gen Ty-- 3s esaron tres marcadores tipo SCAR (uno tipo presencia/ausencia y dos de diferentes tamao). Se lograron identificar nicamente seis cultivares introducidos de Taiwn con la presencia del gen Ty-1, no as en los colectados en fincas de productores. En el caso del gen Ty-2, con el marcador SCAR se lograron identificar nueve cultivares procedentes de Taiwn con el gen de resistencia, pero de los colectados a nivel nacional nicamente un genotipo present el mismo gen, la misma respuesta se encontr para el marcador CAPS con los cultivares introducidos, no as para los colectados a nivel nacional, el cual logro identificar dos cultivares con presencia del mismo gen. Para el gen Ty-3, nicamente siete cultivares procedentes de Taiwn presentaron el gen, no as los cultivares nacionales, que no presentaron el gen.

Palabras clave: CAPS, Genes de Resistencia, Genotipo, SCAR, TYLCV

ABSTRACT

Tomato Yellow leaf curl virus (TYLCV) is a begomovirus transmitted by whitefly (Bemisia tabaci Genn), this virus is a limited factortotomato yield in tropical and subtropical areas. Nowadays, the genes Ty-1, Ty-2, and Ty-3 are related to begomovirus resistance, which have been used in tomato plant breeding. This study is parr of the regional effort, which tries to find genotypes with those genes related to begomovirus resistances. In the present study 22 accessions collected in Nicaraguan farms and 14 genotypes introduced from Cuba and Taiwn were evaluated. A total of 7 molecular markers linked to begomovirus resistance were used. Two CAPS makers were used to identify Ty-1 gen, identifying only 6 genotypes introduced from Taiwan. Ty-2 gen was identified using a SCAR marker (different sizes) and a CAPS marker. With SCAR and CAPS maker were identified 9 genotypes from Taiwan with Ty-2 gene, SCAR marker was capable to identity one accession and CAPS two accessions from Nicaraguan farmerfor Ty-2 gene. Ty-3 gene presented only 7 genotypes from Taiwan using SCAR marker.

Key word: CAPS, Genotype, Resistance Gene, SCAR, TYLCV

INTRODUCCIN

La productividad del cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) se ve limitada por la incidencia de microorganismos fitopatgenos, siendo el Virus del encrespamiento amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) uno de los patgenos ms agresivos para la hortaliza a nivel mundial (Dueas et al., 2001).

Una alternativa para contrarrestar estas enfermedades, es la bsqueda de fuentes de resistencia a estos patgenos, para su incorporacin en las variedades comerciales (Morales, 2000).

Hasta la fecha se han identificado tres genes relacionados con la resistencia al TYLCVes, estas son: Ty-1, Ty-2 y Ty-3.

El gen Ty-1, fue el primer gen mapeado y presenta una mayor dominancia incompleta. Fue introgresado del tomate silvestre Solanum chtense LA1969 y mapeado en el cromosoma 6(Zamirefa/., 1994).

-  El gen Ty-2, fue introgresado del tomate silvestre S. habrochaites y mapeado en el brazo largo del cromosoma 11 (Hanson et al., 2000).

- El gen Ty-3 el cual fue mapeado en el brazo largo del cromosoma 6 (Jensen etal., 2007).

Este gen fue derivado de S. chtense (LA2779 y LA1932), S. habrochaites, S. peruvianum, y est asociado a la resistencia y/o tolerancia al Virus del enerespamiento amarillo del tomate {TYLCV) y Virus del mosaico del tomate {ToMoV).

Con el avance de las tcnicas moleculares, se han desarrollado marcadores moleculares tipo CAPS (del ingls, Cleaved amplified polymorphic sequences) y SCAR (del ingls, Sequence characterized amplified regions) que permiten la identificacin y seleccin de cultivares de tomate con la presencia de estos genes, que pueden ser usados en programas de mejoramiento gentico. El presente trabajo tuvo como objetivo identificar genes de resistencia en cultivares de tomate procedentes de Nicaragua, Taiwn y Cuba, para su empleo en programas de mejoramiento gentico.

MATERIALES Y MTODOS

Extraccin de cido desoxirribonucleico (ADN) y condiciones de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Se tom aproximadamente 1 cm2 de hoja de cada material vegetal (Tabla 1 y 2). Para la extraccin de ADN de las muestras en estudio se us el protocolo CTAB (Doyle y Doyle, 1990). El ADN se resuspendi en 100 ul de tampn TE y se mantuvo a -20°C hasta su uso.

Condiciones para PCR

Se utilizaron siete marcadores moleculares, los cuales se describen en la tabla 3.

Para el marcador REX-1, asociado al gen Ty-1, se usaron las condiciones de PCR descrita por Prez de Castro etal. .2007), ,ue consisten enn 30 ciclos de 94°C por 30 s, 55°C por 30 s y 72°C por 1 min, seguido por un paso de extensin de 72°C por 10 min. Luego, el producto de PCR se incub a 65°C por dos horas con la enzima de restriccin TAqI. Finalmente, el producto PCR se incub a 65°C por dos horas con la enzima de restriccin TAqI.

Las condiciones de PCR para los marcadores asociados al gen Ty-2, se establecieron segn el protocolo descrito por Garca et al. (2007) que consiste en 94°C por 5 min, 35 ciclos de 94°C por30s, 55°C por 1 min y 72°C ppr 2 min, seguidos de un paso de extensin de 5 min a 72°C.

Para los marcadores asociados al gen Ty-3, se emple el protocolo descrito por Jesen et al. (2007) de 94°C por 3 min 35 ciclos de 94°C por 30s, 50-60°C por 45 segundos dependiendo del marcador, y 72°C por 1 min seguidos de un paso de extensin de 10 min a 72°C.

En el caso del marcador FLU-W25, se us el programa de PCR descrito por Saluset al. (2007) de 94°C por 3 min, 34 ciclos de 94°C por 30 s, 53°C por 1 min, 72°C por 1 min, seguido por un paso de extensin de 10 min.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Gen Ty-1

Con el empleo del REX-1, se observ la presencia de un alelo de 750 pb (Figura 1) en todos los cultivares analizados. Sin embargo, una vez realizada la digestin enzimtica, se observ que los cultivares 1m, 2m, 3m, 7m, 8m y 9m presentaron tres alelos que se ubicaron en un rango de 150 a 350 pb, no as el resto de cultivares que presentaron un alelo de 750 pb. De acuerdo con Prez de Castro et al. (2007) y Garca et al. (2007), el marcador REX-1 presenta estos tres alelos cuando un genotipo posee resistencia a TYLCV. Estos seis cultivares fueron obtenidos por mejoramiento en AVRDC e introducido dicho gen.

En estudios previos, se ha determinado que el gen Ty-1 presenta un efecto de dominancia incompleta y que la mayora de los cultivares comerciales de tomate con resistencia a TYLCV, poseen dicho gen (Prez de Castro etal., 2007).

Se comprob que para el marcador TG231, este gen (Figura 2), present un alelo homocigoto de 750 pb, para todos los cultivares, una vez realizada la digestin enzimtica (Figura 3). Los cultivares 1m, 2m, 3m, 7m, 8m y 9m con presencia del gen Ty-1 conservaron el mismo alelo, no as el resto de los cultivares que presentaron un alelo diferente con un aproximado de 450 pb.

Gen Ty-2

Con el marcador T0302 (Figura 4), de las lneas introducidas de Taiwn, nicamente la accesin 7m no present el alelo ligado a resistencia. Las dems lneas presentaron un alelo homocigoto con 950 pb. De los cultivares colectados en Nicaragua, solo el 11.1 s present dos alelos, incluyendo el alelo de resistencia a begomovirus (950 pb). En estudios previos, Garca et al. (2007), informaron que para el marcador T0302, alelos de 950 pb para las lneas resistentes a begomovirus (H24 y S. habrochaites LA0386). En el mismo estudio, se hace referencia al hbrido TyQueen como resistente con un perfii heterocigoto con,dos alelos, incluyendo el alelo con 950 pb.

Se ha descrito que el gen Ty-2 est ligado a la resistencia o tolerancia TYLCV. Fue introgresado de S. habrochaites, a travs del uso de marcadores RFLP en el cromosoma 11, entre el marcador TG36 (84 cM) y TG393 (103 cM) en la lnea H24 (Hanson etal., 2000). En el AVRCD se est incorporando el alelo Ty-2 a las nuevas lneas comerciales de tomate.

El gen Ty-2, es efectivo contra algunas formas monopartitas de geminivirus, no as contra los bipartitas que prevalecen en Amrica y parte deAsia(AVRDC, 2005).

Por otra parte, con el marcador TG-105A (Figura 5), se encontr un alelo homocigoto para todos los cultivares evaluados. Sin embargo, con digestin enzimtica del producto amplificado (Figura 6), se apreci que dos cultivares colectados en Nicaragua (11.1 s y 11.2 s) posean un alelo de 350 pb, que coincidi con el encontrado en los cultivares con resistencia a TYLCV proveniente de Taiwn. De acuerdo con Garca etal. (2007), el marcador T0302 es ms preciso que TG-105A al identificar el gen Ty-2. Esto se debe a que el marcador TG-105A puede errneamente identificar el gen 12, asociado a la resistencia a Fusarum, dado a que ambos genes se encuentran en el cromosoma 11 con una distancia de 1.5 cM entre ambos, por lo cual, se podra implicar la presencia del gen 12 en el genotipo 11.2 s.

Gen Ty-3

Para la identificacin del gen Ty3, con el marcador FLU-W25 (Figura 8), se obtuvieron dos tipos de alelos, con 650 pb para los cultivares 1 m, 3m, 4m, 5m, 6m y 7m y 500 pb para el resto. Resultados presentados por Salus et al. (2007), para cultivares resistentes (Gh25, 228-1 y Gc43) mostraron el alelo de resistencia con 600 pb.

El gen Ty-3, fue mapeado en los intervalos 20 cM y 27 cM del cromosoma 6, el cual es uno de los principales locus, responsable de la resistencia a TYLCV. Al mismo tiempo, contribuye a una resistencia parcial al ToMoV (Jensenefa/,,2007).

El marcador P169 (Figura 9) es del ltpo presencia/ ausencia. De los materiales mejorados nicamente CLN3070F1-10-88-8-13-0 (Procedente de Taiwn), AMALIA (Procedente de Cuba) y BUTTER no presentaron presencia del gen Ty-3 para este marcador. En este caso, se observ la poca efectividad de este marcador para detectar dicho gen. En cuanto a los materiales vegetales colectados en las diferentes regiones de Nicaragua, no se present el alelo de resistencia.

Con el marcador P6-25 (Figura 9), los materiales vegetales mejorados 1m, 2m, 3m, 4m, 5m, 6m y 7m se comportaron con un perfil heterocigoto, en el cual, el alelo con la presencia del gen tuvo un tamao de 450 pb aproximadamente. Los dems fueron homocigotos, sin presencia del alelo con un tamao aproximado 320 pb. Datos similares presentaron Jensen etal. (2007), para el mismo marcador.

CONCLUSIONES

El uso marcadores tipo de SCAR y CAPS para seleccin asistida en programa de mejoramiento gentico, permiti encontrar cultivares (con procedencia del AVRDC de Taiwn, Cuba y Nicaragua) con presencia y ausencia de los genes Ty1, Ty2 y Ty3, que confieren resistencia a TYLCV, los cuales podran ser incluidos como parentales en programas de mejora gentica del cultivo de tomate.

Agradecimientos

El presente trabajo fue realizado gracias al apoyo financiero del programa Fontagro, as como al apoyo brindado por el laboratorio de virologa del CIAT-Colombia.

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(Recibido 16-12-2011; Aceptado 1-12-12)



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