Evaluación de riesgos de la Transferencia Génica Horizontal en bacterias contaminantes de los cultivos  in vitro  de la caña de azúcar

Leonardo J. Moreno-Bermúdez; José Machado-Rodríguez; Yelenys Alvarado-Capó; Miledy Cruz-Martín

Vol. 12, No.2, 2012.pmd

Art�culo cient�fico                                                       Biotecnolog�a Vegetal Vol. 12, No. 2: 99- 106, abril-junio, 2012 


ISSN 2074-8647 (Versi�n electr�nica)

Evaluaci�n de riesgos de la Transferencia G�nica Horizontal en bacterias contaminantes del cultivo in vitro de ca�a de az�car

L. J. Moreno-Berm�dez*, J. Machado-Rodr�guez, Y. Alvarado-Cap�, M. Cruz-Mart�n. *Autor para correspondencia

Instituto de Biotecnolog�a de las Plantas Universidad Central �Marta Abreu� de Las Villas Carretera a Camajuan� km 5.5, Santa Clara, Villa Clara. CP 54 830. e-mail: ljmoreno@ibp.co.cu

RESUMEN

La transferencia g�nica horizontal es un fen�meno que debe tenerse en cuenta al realizar las evaluaciones de riesgo en plantas gen�ticamente modificadas, ya que estas pudieran transmitir por esta v�a los transgenes incorporados artificialmente a otros organismos con los que est�n en estrecho contacto en el ambiente y afectarlos de alguna manera El objetivo del presente trabajo fue evaluar los riesgos de la transferencia g�nica horizontal en especies bacterianas contaminantes del cultivo in vitro de ca�a de az�car (Saccharum spp. h�brido) no transg�nica que en algunos casos coinciden con especies endof�ticas y/o habitantes de la rizosfera (de plantas transg�nicas). Se determin� la capacidad de transformaci�n natural de catorce _rPnas de bactpria<� con un pl�=;mirlo que conten�a genes que confieren re<�i<�tencia a lo<� antibi�tirn<� AmoiciNna EsS Sanas v*apartirdel calculeTd^as frecuencias dV^ansfo^ riesgo^Seobt^ Escherich%^ delasbacteriasestudiadas havan TE emolearse^ eZf�ticas o asociadas a la hzL realizarla!levSSones d^tesg^adSs plantas modincadas gen�ticamente, Palabras clave: Evaluaci�n de riesgos, Transferencia G�nica Horizontal

ABSTRACT

The horizontal gene transfer is a phenomenon that must be taken into account when performing risk evaluation ofgeneticallymodifiedplants, becausetheseonescouldtransmit bythis methodtheartificially incorporated transgenes to other organisms with those they are in strait contact in the environment and affect them somehow. The aim of this study was to evaluate the risks of horizontal gene transfer in contaminant bacterial species of in vitro non-transgenic sugarcane cultivations (Saccharum spp. hybrid), which in some cases coincide with endophytic species and/or residents of the rhizosphere of transgenic plants. It was determined the capacity of natural transformation of fourteen bacterial strains with a plasmid containing genes that confer resistance to antibiotics Ampicillin, Streptomycin and Spectinomycin, used as a vector for plant genetic transformation, and from the calculationof transformation frequenciesofeach species the risks were assessed. Transformed and non transformed bacterias were obtained, the lowerfrequency was obtained for Escherichia coli (0.09 x 10⁹) and the highest for Pseudomonas stutzeri (266.6 x 10⁹). The fact that some of the studied bacterias were naturally transformable is a risk factor for them, and they can be used as a model to study horizontal gene transfer, in case to be found as endophytic or associated with the rhizosphere of plants that have been genetically modified when conducting risks assessments to such plants.

Key words: Risks evaluation, Horizontal Gene Transfer

INTRODUCCI�N

La modificaci�n gen�tica de plantas se lleva a cabo desde finales de la d�cada de los a�os 70 del siglo XX (Collazo, 2007) con el prop�sito de atenuar los problemas que se presentan en la agricultura y la alimentaci�n a nivel mundial. La ingenier�a gen�tica permite obtener variedades transformadas al insertar en estas plantas genes de otras, o de organismos muy alejados de ellas desde el punto de vista evolutivo. En muchos casos se han utilizado genes bacterianos que confieren resistencia a antibi�ticos como genes marcadores para la selecci�n de las plantas transformadas (Mercer etal., 1999).

Lo anterior ha propiciado el debate entre cient�ficos de si la nueva variedad pudiera constituir un riesgo para los organismos con los cuales se relaciona en el ambiente, al transmitir por v�a horizontal los transgenes incorporados, o afectarlos directamente mediante las prote�nas codificadas por estos (Nielsen y Townsend, 2004).

Es necesario entonces, antes de introducir en la naturaleza una planta gen�ticamente modificada, realizarle evaluaciones de riesgo y un fen�meno que se tiene muy en cuenta en estos casos es la Transferencia G�nica Horizontal (TGH), que ha sido estudiada con mayor profundidad en las bacterias (Friesen etal., 2006).

Ser�a beneficioso contar con especies bacterianas que se puedan utilizar como modelo al evaluar los riesgos de la TGH a partir re plantas transg�nicas. Adem�s, tambi�n podr�a ser �til que al realizar las evaluaciones en bacterias endof�ticas y/o habitantes de la rizosfera de plantas gen�ticamente modificadas, ya se conociera el nivel de riesgo al que est�n nometidas algunas especies por estudios previos sobre TGH efectuados en ellas.

Teniendo en cuenta lo anterior este trabajo tuvo como objetivo evaluar los riesgos de la Transferencia G�nica Horizontal en especies bacterianas contaminantes de los cultivos �n vitro de la ca�a de az�car (Saccharum spp. h�brido) no transg�nica, que en algunos casos coinciden con especies endof�ticas y/o habitantes de la rizosfera de plantas transg�nicas.

MATERIALES Y M�TODOS

Obtenci�n del ADN plasm�dico

Para verificar la capacidad de transformaci�n natural de las bacterias seleccionadas para este estudio, se utiliz� el pl�smido pHCG 59 proveniente de una cepa bacteriana de Escherichia coli, XL-1 Blue, con genes de resistencia a los antibi�ticos Ampicilina, Estreptomicina y Espectinomicina. La cepa se inocul� en una placa de Petri de 90 mm de di�metro con medio de cultivo LB (Luria-Bertani) (Sambrook y Rusel, 2001) al que fueron incomorados los antibi�ticos en las siguientes concentraciones: Ampicilina (50 Ijgml-¹) 30 mI, Estreptomicina y Espectinomicina (100 ugmM) 15 Mi respectivamente.

Para multiplicar y aislar los pl�smidos se utiliz� el Protocolo de aislamiento de ADN plasm�dico (minialcalino) descrito porSambrooky Rusel (2001)) la presencia e integridad de los mismos se comprob� mediante electroforesis en geles de agarosa al 0.8% y la concentraci�n fue eeterminada porespectrofotometr�a (BioPhotometer, Eppendor�), de luz UV a 260 nm (precisi�n fotom�trica: 1.5%, error sistem�tico fotom�trico ±1%).

Cepas bacterianas

Las cepas bacterianas empleadas, identificadas como contaminantes del cultivo in vitro de ca�a de az�car (Alvarado-Cap�, 2003) pertenecientes a la Colecci�n de Cultivos Microbianos del lnstituto de Biotecnolog�a de las Plantas (IBP), fueron las siguientes:

� CCIBP-Sp105: Bacillus licheniformis (Weigmann 1898)

� CCIBP-M65: Bacillus pumilus (Meyer y Gottheil1901)

� CCIBP-M27: Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835)

� CCIBP-E556: Burkholderia cepacia (PallariniyHolmes1981)

� CCIBP-ER25: Corynebacterium spp. (LehmannyNeuman1896)

� CCIBP-E523: Klebsiella pneumoniae (Schroeter1886)

� CCIBP-M29: Ochrobactrum antropii (Holmes1988)

� CCIBP-E267: Pseudomonas aeruginosa (Schroeter1872)

� CCIBP-E437: Pseudomonas stutzeri (LehmannyNeuman1896)

� CCIBP-E658: Serratia ficaria (Grimont, GrimontyStarr1979)

� CCIBP-E419: Stenotrophomonas maltophilia (Palleroni y Bradburry 1993)

Pruebas de susceptibilidad a antibi�ticos en las bacterias

Se analiz� la susceptibilidad de cada cepa bacteriana frente a Ampicilina, Espectinomicina y Estreptomicina por el m�todo de difusi�n en agar (Bauerefa/., 1966).

Se tomaron fragmentos de colonias de las bbcteriaa crecidas en medio de cultivo LB por 24 h y se realizaron suspensiones que se ajustaron al 0.5 de Mc Farland. Posteriormente se inocularon 200 ul en placas de Petri (9 cm de di�metro) con medio de cultivo LB con esp�tula de Drjigalsky. Una vez seco el medio de cultivo se incorporaron sobre �l tres discos de antibiograma (Whatman 3MM)) cada uno con uno de los antibi�ticos en la siguiente concentraci�n: Ampicilina (10 ug), Estreptomicina (7.83 ug) y Espectinomicina (10 ug), seg�n lo recomendado por Gavan (1974). Las placas fueron incubadas a 37°C durante 24 a 48 h para luego evaluar el halo de inhibici�n. La incubaci�n se realiz� a la temperatura mencionada ya que se utilizaron como controles las cepas bacterianas: Escherichia coli ATCC 10145 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 11775.

En el caso de que algunas cepas presentaran resistencia natural frente a alg�n/os antibi�tico/ s, no se evalu� la adquisici�n de resistencia a estos por TGH en dichas cepas.

TGH de los pl�smidos a las bacterias

Con el objetivo de transferir los pl�smidos a las bacterias se utiliz� el m�todo de Brataas et al. (2006) descrito brevemente a continuaci�n:

Concentraci�n de c�lulas bacterianas

La concentraci�n de c�lulas necesarias (aproximadamente 1x10⁷c�lulas/ul de soluci�n salina fisiol�gica (SSF) al 0.85%) se obtuvo por espectrofotometr�a a una DO₆₀₀, luz visible. Para ello se realizaron precultivos de las bacterias en medio de cultivo LB a partir de colonias crecidas. Los precultivos se mantuvieron en agitaci�n durante 18 h a 37°C y luego se centrifugaron a 1500 g y se colect� el sedimento de bacterias, que se diluy� con 500 ul de SSF y se tomaron al�cuotas para cuantificar en el espectrofot�metro.

Concentraci�n de pl�smidos

El valor de la concentraci�n del pl�smido pHCG 59 se obtuvo por lectura directa en el espectrofot�metro UV a 260 nm. Se realiz� la diluci�n tambi�n con SSF al 0.85% hasta alcanzar de 0.13 a 0.27 ug de ADN/ul.

Procedimiento de la TGH

Se mezclaron 75 |jl de soluci�n con el pl�smido y soluci�n bacteriana respectivamente, y se adicion� el volumen total en el centro de una membrana de papel de filtro de 2.25 cm de radio con di�metro de poros 0.22 um (Millipore), incorporado en una placa de Petri sobre el medio de cultivo LB, para lograr el crecimiento de las bacterias en contacto con los pl�smidos. Las placas se incubaron 24 h a 37°C sin ser volteadas.

Como controles positivo y negativo se utiliz� una cepa de E.coli, XL-1-Blue, (sin el pl�smido pHCG 59) con conocida capacidad para adquirir ADN for�neo por transformaci�n. Para cada control se utiliz� la misma cantidad de c�lulas mencionadas en el volumen de 75 ul de SSF, en el caso del control negativo los 75 ul de soluci�n restantes no conten�an los pl�smidos a diferencia del positivo que s� lo conten�an en la cantidad requerida.

Posterior a la incubaci�n los filtros fueron trasladados al interior de tubos de 50 ml de volumen con 4 ml de SSF al 0.85%. Para desprender las bacterias crecidas sobre el papel de filtro Millipore se utiliz� el v�rtex durante 30 segundos, y a partir de la suspensi�n obtenida se hicieron diluciones seriadas base 10(10¹ hasta 10⁷).

Para determinar el n�mero de bacterias transformadas se transfirieron 100 ul de los 4 mi de la suspensi�n obtenida a partir de las bacterias crecidas junto al pl�smido, a tres placas de Petri cada una con uno de los antibi�ticos incorporado al medio de cultivo LB en la siguiente concentraci�n: Ampicilina, 50 ug/ mi; Estreptomicina, 100 ug/ml y Espectinomicina 100 ug/ml. Se us� la esp�tula de Drigalsky para diseminar la soluci�n y las placas se incubaron durante 72 h a 37°C para luego contar las colonias crecidas.

Para determinar el n�mero de bacterias totales en los 4 ml de SSF al 0.85% se adicionaron 100 ul de la diluci�n 10⁷ en una placa con medio LB sin antibi�ticos. Fue utilizado el m�todo anterior para diseminar la soluci�n y se mantuvieron las mismas condiciones de incubaci�n.

La frecuencia de transformaci�n de cada especie se calcul� mediante la siguiente ecuaci�n:

Frecuencia de transformaci�n = N�mNe^yo^d?5^?das/^tJl

Incorporaci�n de pl�smidos completos por TGH por parte de las bacterias

Con el objetivo de determinar si las bacterias incorporaron el pl�smido completo, de cada placa de Petri utilizada para contar el n�mero de bacterias transformadas y con uno solo de los antibi�ticos incorporado al medio de cultivo, se seleccionaron tres colonias aisladas (en caso de haber ocurrido transformaci�n), y fragmentos de cada una se inocularon en placas con los otros dos antibi�ticos por separado, en las concentraciones mencionadas y se incubaron a 37°C durante 24 h.

En el caso de haberse observado crecimiento de colonias bacterianas en presencia de los otros dos antibi�ticos, se tomaron fragmentos de la colonia original y se inocularon en una placa de Petri, con los tres antibi�ticos incorporados a la vez en el medio de cultivo LB en las mismas concentraciones. La incubaci�n se reallz� a 37°C durante 24 h.

Posteriormente se seleccionaron dos colonias crecidas sobre el medio de cultivo con los tres antibi�ticos, y se realizaron precultivos para aislar el ADN plasm�dico mediante el protocolo mencionado. La presencia de los pl�smidos se comprob� mediante electroforesis en geles de agarosa al 0.8% y se tom� como marcador el plásmido pHCG 59 aislado de la cepa de Eco//XL-1 Blue.

Evaluaci�n de riesgos de la TGH de ADN plasm�dico en las especies bacterianas estudiadas

La evaluaci�n se reallz� de forma cualltativa sobre la base de los resultados a partir del c�lculo de la frecuencia de transformaci�n de cada cepa.

RESULADOS Y DISCUSI�N

Pruebas de susceptibilidad a antibi�ticos en las bacterias

En la Figura 1 se muestran los resultados de las pruebas de susceptibilidad a antibi�ticos en algunas especies. Se observ� resistencia de forma natural frente a Ampicilina y Espectinomicina en Bacillus pumilus (CCIBP-M65) (Fig. 2a), frente a Estreptomicina en E coli ATCC (Fig. 2b), Pseudomonas aeruginosa ATCC (Fig. 2c) y Ochrobactrum antropii (CCIBP-M29) que tambi�n fue resistente a Espectinomicina. Los dem�s aislados presentaron susceptibilidad intermedia y/o sensibilidad frente a los tres antibi�ticos con di�metros de inhibici�n desde 10 mm hasta 55 mm (Fig. 2d). Todos los resultados de las pruebas de susceptibilidad se muestran en la tabla 1.

TGH de los pl�smidos a las bacterias

Se observ� crecimiento de las bacterias en contacto con los pl�smidos en todos los casos. Al evaluar el crecimiento de cada cepa en presencia de cada antibi�tico luego de haber propiciado la transformaci�n, algunas cepas se transformaron y otras no. La mayor�a de las especies transformadas lo hicieron indistintamente para uno u otro antibi�tico, solamente S. maltophilia (CCIBP-E419) no se transform� para ninguno, no sucedi� as� con B. subtilis (CCIBP-M27) y P. aeruginosa (CCIBP-E267) que adquirieron secuencias g�nicas que les confirieron resistencia a los tres. Los resultados de las frecuencias de transformaci�n calculadas para cada especie pueden observarse en la tabla 2. La mayor frecuencia se obtuvo para P. stutzeri (CCIBP-E437) y la menor para el control positivo de E. coli (XL-1-Blue).

Incorporaci�n de pl�smidos completos por TGH por parte de las bacterias

Solamente seis colonias crecieron en presencia de los otros dos antibi�ticos diferentes a aquel para el cual se transformaron. Estas colonias fueron: dos de B. subtilis (CCIBP-M27) crecidas en las placas con Espectinomicina y Ampicilina respectivamente, dos de K. pneumoniae (CCIBP-E523) crecidas en la placa con Estreptomicina y dos de la placa donde crec�a E. coli ATCC con Espectinomicina.

En la electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con las muestras de ADN plasm�dico aislado de estas seis colonias, se observaron diferentes patrones de bandas en el gel (Fig. 3) que en algunos casos coincidieron con los patrones de bandas del control (pl�smido pHCG 59) y en otros no (ejemplo: Fig. 2D).

El hecho de que algunas bacterias se transformaran y otras no como es el caso de S. maltophilia (CCIBP-E419), adem�s de a sus capacidades individuales de transformaci�n, pudo deberse a que la transformaci�n natural por la cual puede ocurrir la TGH es un fen�meno que ocurre al azar (De Vries y Wackernagel, 2004). Esta explicaci�n tambi�n es v�lida para la adquisici�n de secuencias g�nicas de resistencia a uno u otro antibi�tico indistintamente en las cepas transformadas.

La transformaci�n de especies bacterianas en la naturaleza tiene lugar a frecuencias bajas (Gebhard y Smalla, 1999), menores de 1x10⁷transformantes por recipientes seg�n Nielsen y Townsend (2004). Tambi�n en condiciones de laboratorio se obtienen bajas frecuencias de transformaci�n en organismos procariotas (Kay etal., 2002). Si se tiene en cuenta todo lo anterior las frecuencias de transformaci�n obtenidas en el presente estudio para cada cepa bacteriana pueden considerarse bajas.

La no correspondencia entre las bandas de ADN plasm�dico del patr�n utilizado y las bandas de ADN plasm�dico de las colonias mencionadas, pudo deberse a que el pl�smido una vez en el interior de las c�lulas transformadas, al adoptar la isoforma circular haya perdido secuencias g�nicas, lo cual pudo afectar su tama�o original (Tortora, 1997).

Evaluaci�n de riesgos de la TGH de ADN plasm�dico en las especies bacterianas estudiadas

Aunque las cepas bacterianas estudiadas se hayan transformado a frecuencias bajas, existen riesgos para ellas ya que pueden adquirir porTGH secuencias de ADN for�neo y luego transmitirlo a otros organismos con los que puedan interactuar.

pudieran emplear para la transformaci�n gen�tica de plantas.

Este trabajo muestra la posibilidad que existe de liberar hacia el campo, junto a las plantas transg�nicas, una microbiota ya transformada en el caso de las que coinciden con las endof�ticas. Sin 4embargo, debe tenerse en cuenta que esta investigaci�n fue llevada a cabo con un vector artificial, el cual puede facilitar la aceptaci�n del ADN por las bacterias llamadas naturalmente competentes (Bensasson et al 2004) y en condiciones in vitro �ptimas para el proceso donde no influyen los factores del ambiente natural en el que se desarrollan las plantas gen�ticamente modificadas, por tal raz�n los rieqnos para las esnpcipq estudiadas pudieran variar

CONCLUSIONES

Las posibilidades de transformaci�n natural que presentan las cepas estudiadas fueron bajas, no obstante, la capacidad que presentan algunas de estas bacterias para incorporar ADN for�neo, constituye un factor de riesgo en caso de que se relacionen con plantas gen�ticamente modificadas tanto en el cultivo in vitro como en el campo por la posible transmisi�n, a otros microorganismos, de transgenes que puedan adquirir por TGH.

Especies como Bacillus licheniformis y Corynebacterium spp. al ser habitantes de la rizosfera de plantas transg�nicas seg�n Siciliano y Germida (1999) y comportarse como transformantes naturales en este trabajo, pueden ser tomadas como base para fundamentar la medidas de bioseguridad en plantas modificadas gen�ticamente que tengan asociadas de una u otra forma a estas especies. Aunque los autores citados no identifican especies particulares del g�nero Pseudomonas que sean endof�ticas o rizosf�ricas los resultados con las especies de este g�nero tambi�n pueden ser tomados en consideraci�n, mayormente rnn P ttut7(^r� que mostr� la frecuencia de transformaci�n m�s elevada y que ha sirlo tambipn estiirliarla nnr Lorenz \i WackernageKI^

Tambi�n constituye un factor de riesgo el hecho de que algunas cepas hayan podido incorporar el pl�smido de forma completa, si se considera que este vector presenta genes de resistencia a tres antibi�ticos, y que vectores semejantes se

REFERENCIAS

Alvarado-Cap�, Y (2003) Incidencia, ,dentificaci�n n estrategias para la prevenci�n y el control de contaminantes bacterianos en el cultivo in vitro dd la ca�a de az�car (Saccharum spp. h�brido). Tesis presentada en opci�n al grado cient�fico de Doctor en Ciencias Agr�colas. Universidad Central �Marta Abreu� de Las Villas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Instituto de Biotecnolog�a de las Plantas, 98 pp

Bauer, AW, Kirby WM, Sherris JC, Truck M (1966) Antibioticsusceptibilitytestingbystandardized single disk method. Am. J. Clln. Patholl 45: 6-493 Benssason, D, Boore JL, Nielsen KM (2004) Genes withoutfrontiers?Heredity. 92: 483-489

Brataas, IO, Eggert J, Gronsberg IM, Ray JL, Jacobsen CC, Nielsen KM, Nordgaard L, Quist D, UtnessA(2006)HollsticfoundationsforAssessment and Regulation of Genetic Engineering and Genetically Modified Organisms - A Laboratory Manual. University of Tromso Editorial, Tromso, Noruega, 45 pp

Collazo Oduardo, F (2007) La modificaci�n gen�tica de los cultivos: �un nuevo paradigma para la agricultura? En: publicaci�n: Bolet�n Electr�nico ISRI no. 17. ISRI, Instituto Superior de Relaciones Internacionales Ra�l Roa Garc�a, La Habana, Cuba: Cuba

De Vries, J, Wackernagel W (2004) Microbial horizontal gene transfer and the DNA rel�ase from transgenic crop plants. Plant and Soil. 266: 91-104

Friesen, TL, Stuckenbrock EH, Liu Z, Meinhardt S, Ling H, Faris JD, Asmussen JB, Solomon PS, McDonald BA, Oliver RP (2006) Emergence of a new disease as a result of interspecific virulence gene transfer. Natur. Gen. 38(16): 953-956

Gavan, T (1974) Prueba in vitro de susceptibilidad antimicrobiana. Clin. Med. Nort. Amer. 58: 493-504

Gebhard, F y Smalla K (1999) Monitoring field releases of genetically modified sugar beets for persistence of transgenic plant DNA and horizontal gene transfer. FEMS Microbiol. Ecol. 28: 261-272

Kay, E, Vogel TM, Bertolla F, Nalin R, Simonet P (2002) In situ transfer of antibiotic resistance genes from transgenic (transplastomic) tob�ceo plants to bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 68(12): 3345-3351

Lorenz, MQ Wackernagel W(1994) Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol. Rev 58: 563-602

MercerD, ScottK, Bruce-JohnsonA, GloverLy Flint H. (1999) Fate of free DNA and transformation ofthe oral bacterium Streptococcus gordonii DL1 by plasmid DNA in human saliva. Applied and Environmental Microbiology65(1): 6-10

Nielsen, KM y Townsend JP (2004) Monitoring and modeling horizontal gene transfer. Nat. Biotechnol. 22(9): 1110-1114

Sambrook, J, Rusell DW (2001) Ap�ndice 2: Media; Cap�tulo 1: Plasmids and their usefulness in molecular cloning. En: Molecularcloning.Alaboratorymanual. Third Edition. Cold Spring Harbor, New York

Siciliano, SD, Germida J (1999) Taxonomic diversity of bacteria associated with the roots of field-grown transgenic Brassica napus cv Quest, compared to the non-transgenic B. napus cv. Excel and B. rapa cv. Parkland. FEMS Microb. Ecol. 29: 263-272

Tortora, GJ (1997) Microbiology: an introduction. Six Edition pp 232-237. Benjamin/Cummings Pub. Co., Menlo Park, California

(Recibido 4-1-2012; Aceptado 28-2-2012)

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