Vol. 12, No.2, 2012.pmd
Artculo cientfico                                                    Biotecnologa Vegetal Vol. 12, No. 2: 107- 112, abril-junio, 2012



 ISSN 2074-8647 (Versin electrnica)

Respuesta in vitro de plantas papa frente al filtrado de cultivo de Alternara solani Sor. obtenidos en diferentes medios de cultivo

N. Veita*, LR. Garca, I. Bermdez, M.Acosta-Surez, Y. Alvarado-Cap, D. Torres, Y. Padrn.

*Autor para correspondencia

Instituto de Biotecnologa de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu' de Las Viilas. Carretera a Camajuan km 5.5. Santa Clara. Villa Clara Cuba. CP 54 830 e-mail: novisel@ibp.co.cu

RESUMEN

El presente trabajo se desarroll con el objetivo de determinar la respuesta in vitro de plantas de papa frente al filtrado de cultivo de Alternaria solani Sor. obtenido en dos medios de cultivo. Para la obtencin del filtrado de cultivo se emple el aislado CCIBP-VAs4 y los medios de cultivo utilizados fueron Fries y Richard. La fitotoxicidad de los filtrados se evalu en plantas cultivadas in vitro susceptibles (cv Desire) y resistente (especie S. chacoense tipo Pi 275136) por inmersin de las races de las plantas. Los resultados mostraron que los filtrados obtenidos en ambos medios de cultivo fueron fitotxicos sobre los dos materiales vegetales. Sin embargo, los filtrados de cultivo que se produjeron en el medio de cultivo Richard permitieron una mejor diferenciacin entre las plantas de papa cv. Desire (suceptible) y las de la especie silvestre Solanum chacoense tipo Pi 275136 (resistente). Esto se correspondi con que en este medio de cultivo se produjo un mayor crecimiento del hongo.

Palabra clave: diferenciacin in vitro, medios de cultivo Fries y Richard, Solanum tuberosum L.

ABSTRACT

This work was developed in order to determine the in vitro response of potato plants against the culture filtrate of Alternaria solani Sor. obtained in two culture media. To obtain filtrate culture were used CCIBP-VAs4 isolate and Fries and Richard culture media. The phytotoxicity of the filtrates was evaluated on in vitro plants susceptible (cv. Desire) and resistant (the specie S. chacoense type Pi 275136) by immersion the roots of plants. The results showed that the filtrates obtained in both culture media were phytotoxic on both plant materials. However, culture filtrates that produced in Richard culture medium gave a better differentiation between potato plants cv. Desiree (susceptible) and those of the wild species Solanum chacoense PI 275136 (resistant). This result was corresponded with the higher growth of the fungus in this culture medium.

Keywords: in vitro differentiation, Fries and Richard culture medium, Solanum tuberosum L

INTRODUCCIN

Como parte de programas de mejoramiento gentico de plantas para la resistencia a patgenos fngicos se emplean mtodos de seleccin in vitro. Estos permiten evaluar un gran nmero de plantas antes de realizar los experimentos a nivel de casa de cultivo y campo. Como agentes selectivos se utilizan estructuras infectivas del patgeno, filtrados del cultivo de estos, extractos crudos, toxinas y componentes de la pared celular.

En el caso de Alternara solani Sor., agente causal del tizn temprano en papa (Solanum tuberosum L.), se ha descrito que produce toxinas no hospedero especficas tanto in vivo como in vitro (Chaerani y Voorrips, 2006). Entre ellas, el cido alternrico, zinniol, antraquinonas, solanapironas A, B y C y alternasol A son las principales responsables de la accin fitotxica. En general, este tipo de toxina no son determinantes primarios de la enfermedad, pero actan como un factor de virulencia, e intensifican los sntomas (Thoma, 2003). Sobre esta base, se ha evaluado la respuesta de plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) y papa frente a los filtrados de cultivo (Chaerani y Voorrips, 2006).

La diferenciacin in vitro de genotipos susceptibles y resistentes en papa con el empleo del filtrado de cultivo de A. solani ha sido estudiado por varios autores (Lynch et al., 1991; Hernndez et al., 1993; Martnez y Mantell, 1994). Sin embargo, pocos han sido las investigaciones en las que se tenga en cuenta las condiciones bajo las cuales estos son producidos. Es por ello, que el presente trabajo se realiz con el objetivo determinar la respuesta in vitro de plantas de papa frente al filtrado de cultivo de Alternaria solani Sor. obtenido en dos medios de cultivo.

MATERIALES Y MTODOS

Material vegetal

Plantas cultivadas in vitro de papa en fase de multiplicacin, de Solanum tuberosum L. cv. Desire (susceptible al Tizn temprano) y Solanum chacoense tipo Pi 275136 (especie silvestre, resistente al Tizn temprano).

Aislado de A. solani

Se emple el aislado CCIBP-VAs4 de la Coleccin de Cultivos Microbianos del Instituto de Biotecnologa de las Plantas.

Respuesta de plantas in vitro de papa al filtrado de cultivo

Los filtrados de cultivo obtenidos en cada medio de cultivo despus de 30 das de incubacin se aplicaron por inmersin de races (Hernndez etal., 1993) sobre plantas de papa cv. Desire (susceptible) y la especie S. chacoense tipo Pi 275136 (resistente) cultivadas in vitro. Para ello, se emple la dilucin 1:1 (v/v) (filtrado del cultivo concentrado: agua destilada estril). Como controles se incluyeron los medios de cultivo Fries y Richard sin inocular con el hongo, pero incubados y concentrados y agua destilada estril.

Se emplearon 15 plantas in vitro de cada material vegetal por medio de cultivo empleado para la obtencin del filtrado del cultivo. Las plantas fueron colocadas en cmaras de cultivo a 22 ±2oC, luz artificial con una densidad de flujo de fotones fotosintticos (FFF) de 62 uE.rrr2 .s1 y un fotoperodo de 16 horas luz, durante 72 horas hasta la evaluacin de las afectaciones.

Obtencin de los filtrados de cultivo

Para obtener el filtrado del cultivo a partir del aislado CCIBP-VAs4 de A. solan,, se emplearon erlenmeyers de 500 ml de volumen que contenan 200 ml de los medios de cultivo lquido Fries (Lorenzo etal., 1992) y Richard (Martnez y Mantell, 1994). El pH de cada medio de cultivo se ajust a 5.6. Estos recipientes de cultivo se inocularon con un disco de micelio de 1.0 cm de dimetro tomado de los bordes de las colonias crecidas en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) (durante 7 das a 26±2 0C y oscuridad constante). Posteriormente se incubaron por un perodo de 30 das a 28oC en condiciones de cultivo esttico y oscuridad constante. Se emplearon cuatro erlenmeyers por medio de cultivo. Pasado este perodo de tiempo se separ el estroma y se filtr el cultivo a travs de papel de filtro Whatman No. 4. El filtrado del cultivo se concentr diez veces el volumen inicial por rotoevaporacin al vaco a 40oC Posteriormente se filtr por un filtro de porcelana para "'eliminar posibles restos de mirplio y nnr ltimo nnr un filtro de f) 77 nm

(MHHpore).

Las afectaciones provocadas por el filtrado del cultivo obtenido en ambos medios de cultivo fueron evaluadas mediante la escala descriptiva de grados propuesta por Veita et al. (2001) (Tabla 1). A partir de los grados de afectacin presentados por cada material vegetal (susceptible o resistente) en cada medio de cultivo, se calcul la diferencia entre estos. Con estos valores se determin la intensidad de afectacin mediante la frmula propuesta porTowsend y Heuberger (1943) que se describe a continuacin:

Donde: I significa la intensidad de afectacin (%); n, total de plantas por grado de la escala; v, grado respectivo de la escala; N, total de plantas evaluadas e i, grado mximo de la escala (i=7).

Adems, se midi el pH del filtrado del cultivo del aislado de A. solani obtenido en cada medio de cultivo y se determin la masa seca (g) del micelio. Para esto ltimo, el micelio se coloc en estufa a 65.0oC hasta que el peso se mantuvo constante.

Los datos de los grados de afectacin, los valores de intensidad de afectacin, pH y masa seca del micelio, fueron analizados estadsticamente mediante la prueba de Mann Whitney previa comprobacin de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza a travs de paquete estadstico Statistical Pakcage for social Science (SPSS) versin 13.0 sobre Windows.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Respuesta de plantas in vitro de papa al filtrado de cultivo

Se comprob a travs de este estudio que la respuesta de las plantas cultivadas in vitro de papa vari en dependencia de la fitotoxicidad del filtrado del cultivo que se produjo en los medios de cultivo Fries y Richard.

Con los filtrados del cultivo del aislado CCIBP-Vas4 que se produjeron tanto en el medio de cultivo Fries como en Richard se logr diferenciar las plantas de papa cv. Desire (susceptible) de las de la especie silvestre S. chacoense (resistente). Sin embargo, el que se obtuvo en el medio de cultivo Richard, produjo los mayores valores en el grado de afectacin en los dos genotipos de papa (Figura 1).

Los controles, medio de cultivo Richard sin inocular y el agua destilada estril no provocaron sntomas en ninguno de los genotipos evaluados. Por el contrario, el medio de cultivo Fries sin inocular (control), produjo afectaciones sobre las plantas de papa cv. Desire. Estas presentaron un valor promedio del grado de afectacin de 0.26 (cuatro plantas con clorosis ligera en el centro de las hojas de la zona inferior, esta sintomatologa se correspondi con el grado 1).

Los porcentajes de intensidad de afectacin del filtrado del cultivo de A. solani (CCIBP-VAs4) calculados a partir de la diferencias entre los grados de afectacin presentados por el cultivar susceptible y la especie resistente fueron mayores en medio de cultivo Richard en comparacin con los obtenidos en medio de cultivo Fries (Figura 2). Este resultado indic que el medio de cultivo influy en la fitotoxicidad de los filtrados del cultivo de A. solani, lo cual permiti una mejor diferenciacin entre ellos. De igual forma se comprob que el crecimiento in vitro del aislado CCIBP-VAs estuvo relacionado con el tipo de medio de cultivo utilizado y fue en Richard donde se obtuvieron los mayores valores de masa seca Ca) (Tabla 2) y (Figura 3 a y b) Esto puede estar asociado a la composicin qumica del medio de cultivo Por ejemplo el medio de cultivo Richard posee mayor concentracin de la fuente de carbono y de nitrgeno en tres variantes del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) utilizados para la obtención de filtrado del cultivo a partir de un aislado de A solani y utilizaron como control medio de cultivo Richard. Estos autores plantearon que el pH del medio de cultivo cambia en el tiempo debido al metabolismo microbiano por concepto de degradación de compuestos y excreción de metabolitos al medio. Los valores de pH en el medio de cultivo Richard en el presente trabajo coinciden con los descritos por estos autores al emplear este mismo medio de cultivo como control.

Otro elemento importante fue la modificacin del pH de los medios de cultivo. Se encontr un incremento en el medio de cultivo Richard y una disminucin en el de Fries (Tabla 1).

Se ha comprobado que los microorganismos ocasionan variaciones en el pH de los medios de cultivo durante su crecimiento in vitro y esto puede estar relacionado con los procesos metablicos que tienen lugar segn la composicin qumica del tipo de medio de cultivo empleado. Por ejemplo, Prez (1997) estudi el pH inicial, la temperatura y el tiempo de incubacin que pudieran potenciar la toxicidad de los filtrados crudos de A solani y observaron poca influencia del pH inicial en la fitotoxicidad sinembargo el pH de los medios de cultivo inoculados vari en el tiempo.

De igual forma, Capote et al. (2001), ,nformaron Estos resultados demuestran que el tipo de sobre las variaciones observadas del pH final medio de cultivo utilizado tiene una importancia

significativa para la obtencin del filtrado del cultivo de A. solani y corroboran evidencias experimentales descritas por otros investigadores acerca de la relacin entre el crecimiento del microorganismo en el medio de cultivo y su capacidad de producir metabolitos txicos. As, Moriseau et al. (1999) en Alternara alternata observaron una similitud en la dinmica del crecimiento y la produccin de toxinas en el medio de cultivo y Sutherlan y Pegg (1995) encontraron una correspondencia entre el crecimiento in vitro de Fusarium oxysporum var. lycopersici\N.C. Snydery H.N. Hansen y la fitotoxicidad de su filtrado del cultivo sobre protoplastos de tomate.

Para la obtencin de filtrados del cultivo de Alternara solani se han empleado varios medios de cultivo tales como: medio de cultivo Richard (Lorenzo et al., 1993; Martnez y Martell, 1994; Capote etal., 2001),

medio de cultivo Fries (Lorenzo et al., 1992; Bernal etal., 2002), medio de cultivo Sachs (Prez, 2003) y medio de cultivo MS con 50 g l1 de sacarosa y 1.0 g l1 de levadura (Capote et al., 2001). Teniendo en cuenta la variabilidad de esta especie uno u otro medio de cultivo podra ser til en dependencia del aislado con que se cuente lo cual ha sido corroborado con el estudio realizado por Prez (2003) el cual evalu un grupo de aislados de A. solani en tres medios de cultivo y no todos los filtrados de cultivo obtenidos a partir de diferentes aislados tuvieron la misma actividad fitotxica.

Con los resultados mostrados se profundizan los de este autor quin inform que para la utilizacin de los filtrados fitotxicos de A. solani debe estudiarse la relacin entre el medio de cultivo, el genotipo hospedante y el aislado.

CONCLUSIONES

Se comprob que la respuesta de plantas in vitro de papa al filtrado de cultivo de A. sotan aplicado por inmersin de las races depende del medio de cultivo en el cual se obtenga el filtrado. De acuerdo con los resultados, el filtrado del cultivo obtenido en medio de cultivo Richard fue ms fitotxico sobre las plantas cultivadas in vitro de papa y permiti una mejor diferenciacin entre el cultivar susceptible y la especie resistente. Esto se correspondi con que en este medio de cultivo se produjo un mayor crecimiento del hongo.

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(Recibido 5-12-2011; Aceptado 7-2-2012)



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