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Artículo original

Biotecnología Vegetal Vol. 12, No. 4: 229 - 234, octubre - diciembre, 2012
IISSN 2074-8647, RNPS: 2154 (Versión electrónica)
ISSN 1609-1841, RNPS: 0397 (Versión impresa)

 

Establecimiento in vitro de segmentos nodales de plantas jóvenes de Annona muricata L.

 

In vitro establishment of nodal segments of Annona muricata L. young plants

 

Leyanis García-Águila1*; José Manuel Álvarez2, Yelenys Alvarado-Capó1, Milagros González1, Mariana La O1; Deivis Mirabal1, Carlos Romero1. *Autora para correspondencia.

1Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Carretera a Camajuaní km 5.5 Santa Clara, Villa Clara. Cuba, CP 54 830. e-mail: leyanis@ibp.co.cu
2Grupo Empresarial LABIOFAM Ave. Independencia, km 16 1/2, Boyeros, La Habana, Cuba.

 

 

RESUMEN

El empleo del cultivo in vitro de tejidos para la propagación vegetativa de árboles promisorios de guanábana (Annona muricata L.), puede contribuir a incrementar la disponibilidad de plantas para el desarrollo de plantaciones en campo. Es por ello, que este trabajo tuvo como objetivo establecer in vitro segmentos nodales de plantas jóvenes de guanábana. Los segmentos nodales con 1.5 cm de longitud se desinfectaron superficialmente con etanol al 70% durante un minuto e hipoclorito de sodio (0.5, 1.0, 1.5 y 2.0%), durante 15 minutos. A los 15 y 25 días de cultivo se evaluó la presencia de contaminación microbiana, el número de segmentos con brotación de la yema axilar, así como la longitud (cm) del brote. Los resultados mostraron una baja incidencia de contaminantes fúngicos. Sin embargo, el 3.8% de los segmentos se contaminaron con bacterias en el tratamiento de menor concentración de hipoclorito de sodio. En el 73% de los explantes se observó brotación de la yema axilar cuando se utilizó hipoclorito de sodio al 1.0%, sin diferencias significativas con 1.5%. A los 25 días de cultivo se apreció crecimiento de los brotes con la presencia de las primeras hojas expandidas y su longitud osciló entre 0.8 y 1.5 cm. Sin embargo, con el incremento del tiempo de cultivo se produjo abscisión de las hojas. Estos resultados demuestran que se puede utilizar el cultivo in vitro para la propagación de guanábana. No obstante, hay que profundizar en el estudio de las condiciones de cultivo durante la fase de multiplicación.

Palabras clave: cultivo in vitro, brotación, contaminación microbiana, oxidación fenólica.

ABSTRACT

The use of tissue in vitro culture for plant propagation of soursop (Annona muricata L.) promissory trees can help increasing the availability of plants for developing field plantations. Considering these aspect, this work aimed to establish in vitro nodal segments of young plants of soursop. Nodal segments with 1.5 cm of length were superficially disinfected with 70% ethanol during one minute and with sodium hypochlorite (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0%) during 15 minutes. The presence of microbial contamination and the number of segments with axillary buds were evaluated after 15 and 25 days of culture. The length (cm) of buds was also determined. Results showed a low incidence of microbial contamination in the explants because the presence of fungi in treatments was not observed. However, 3.8% segments were contaminated with bacteria in the treatment with lower concentration of sodium hypochlorite. Axillary shoots were observed in 73.0% of explants when 1.0% of sodium hypochlorite was used, without significant differences using 1.5%. Shoots development with first expanded leaves and a length ranged between 0.8 and 1.5 cm was observed after 25 days of culture. Increasing culture time, plants showed leaf abscission. These results demonstrate that in vitro culture can be used for the propagation of soursop. However, we must make emphasis in the study of the culture conditions for the multiplication phase.

Key words: in vitro culture, microbial contamination, phenolic oxidation, shoot production.

 

 

INTRODUCCIÓN

La guanábana (Annona muricata L.) es un árbol frutal que pertenece a la familia Anonacea.
Es originaria de las regiones tropicales de América del Sur y se encuentra dispersa en Mesoamérica y las Antillas (Pinto et al., 2005). Por sus aplicaciones en las industrias agropecuaria y farmacéutica esta especie ha ganando importancia en diferentes países de América Latina (Cordeiro et al., 2005). Su fruto se distingue por su excelente sabor y contenido de calcio, fósforo, vitaminas y fibras. Además, posee sustancias como las acetogeninas con reconocida actividad citotóxicas en células cancerígenas y biopesticida (Badrie y Schauss, 2010).

En Cuba, la siembra de Annona muricata L. ha estado limitada a patios y jardines de viviendas (Rodríguez-Dopazo et al., 2010). Su método natural de propagación es a través de semillas, las cuales presentan una germinación irregular por poseer diferentes niveles y tipos de dormancia. Esto hace que el tiempo requerido para formar una planta sea muy largo (Pinto, 2005).

La propagación vegetativa es la más indicada para proporcionar plantas uniformes. Existen varios métodos como el acodado aéreo, estaquillado y el injerto, siendo este último el más utilizado (Pinto et al., 2005). Según Barros-Neto (2008), la producción de plántulas de Annonas comerciales en condiciones de campo es extremadamente cara. Los patrones tardan alrededor de un año para alcanzar el desarrollo óptimo y el injerto puede dar lugar a graves problemas en relación con el vigor de las plantas, la productividad, así como el riesgo de transmisión de patógenos (Soares y Martins, 2003). Para el fomento de plantaciones de esta especie vegetal se requiere de gran cantidad de plantas de calidad genética y fitosanitaria con el propósito de obtener altos rendimientos en campo.

En este sentido, el cultivo in vitro de tejidos vegetales podría contribuir a la propagación vegetativa, a partir de árboles promisorios de Annona muricata L. En la literatura científica se encuentran avances relacionados con el tema en diferentes especies de Annona. Sin embargo, en Annona muricata L. se presentan dificultades relacionadas con el establecimiento in vitro de segmentos nodales procedentes de plantas adultas. Algunos autores han observando alta contaminación microbiana, oscurecimiento de los explantes por oxidación fenólica y bajos porcentajes de brotación de las yemas (Bring, 2000; Rivero et al., 2001; Ramírez-Villalobos et al., 2002; Velázquez et al., 2004).

El desarrollo de una metodología a través del cultivo in vitro permitiría altas tasas de multiplicación, la obtención de plantas vigorosas, productivas, libres de microorganismos patógenos y fieles al fenotipo seleccionado en campo. Es por ello, que se requiere determinar las condiciones de trabajo para lograr la desinfección superficial de los explantes y altos porcentajes de brotación de las yemas axilares. Teniendo en cuenta los aspectos anteriormente descritos, este trabajo tuvo como objetivo establecer in vitro segmentos nodales a partir de plantas jóvenes de Annona muricata L.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se utilizaron plantas procedentes de semillas de árboles seleccionados por el Grupo Empresarial LABIOFAM, las cuales permanecieron en casa de cultivo bajo condiciones semicontroladas (Fig. 1A). Estas se desarrollaron en bolsas con 500 cm3 de un sustrato, compuesto por 80% de materia orgánica (compost) y 20.0% de zeolita. A partir de los cuatro meses se realizaron podas periódicas para estimular la formación de nuevos brotes y de esta forma mantener el estado juvenil de las plantas donantes. Cuatro semanas antes de la colecta de los explantes se efectuó la aplicación foliar de un fungicida sistémico (Benomyl) a una concentración de 2.0 g l-1 (i.a).

Establecimiento in vitro de las plantas donantes

A los ocho meses de cultivo se colectaron los cuatro primeros segmentos nodales a partir de la yema terminal de la rama (Fig. 1B). Cada segmento con su yema axilar, desprovistos de hojas y de aproximadamente 1.5 cm de longitud se introdujeron en recipientes que contenían una solución antioxidante estéril de ácido cítrico (100 mg l-1). La desinfección superficial se realizó con etanol al 70% durante un minuto y posteriormente se colocaron en diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (0.5, 1.0, 1.5 y 2.0%), durante 15 minutos. Transcurrido este periodo se efectuaron tres enjuagues con la solución antioxidante descrita anteriormente.


Cada segmento nodal se colocó en un tubo de cultivo (15.0 x 2.5cm) que contenía 10ml de medio de cultivo en estado semisólido (2.5 g l-1 de Phytagel), el cual estaba compuesto por las sales de Murashige y Skoog (1962) (Duchefa), 0.5 mg l-1de 6-bencilaminopurina, 25 g l-1 de sacarosa y el pH se ajustó a 5.7 antes de la esterilización en autoclave.

Los tubos de cultivo con material vegetal se colocaron en cámara de crecimiento con oscuridad total durante 7 días y posteriormente se trasladaron a una cámara de luz solar con densidad de flujo de fotones fotosintética (FFF) de aproximadamente 50.0-62.5 µmolm-2s-1 y 28.0 ± 2.0 ºC. Después de 15 y 25 días de cultivo se evaluó por observación visual y se comprobó mediante observaciones microscópicas, el número de explantes con presencia de contaminación microbiana (hongos filamentosos, bacterias y levaduras), el número de explantes con brotación de su yema axilar y se midió la longitud (cm) de los brotes desde la inserción con el segmento hasta el ápice de la última hoja emitida. A los 30 días de cultivo, el material vegetal se transfirió a un nuevo medio de cultivo con igual composición.

Los datos experimentales se procesaron con el paquete computacional SPSS (del inglés, Statistical Package for the Social Sciences) versión 18.0 sobre Windows. Se les comprobó los supuestos de distribución normal y heterogeneidad de varianzas. La comparación de los valores medios se efectuó mediante la prueba Mann-Whitney para un 0.05% de significación.

RESULTADOS

Durante los primeros 15 días de cultivo, los explantes no mostraron contaminación ocasionada por hongos en ninguno de los tratamientos. Sin embargo, el 3.8% de los segmentos se contaminaron con bacterias en el tratamiento con hipoclorito de sodio al 0.5%. Durante este periodo, se observó un oscurecimiento en los extremos del segmento nodal y de la fracción del peciolo que permaneció en el explante, posiblemente como consecuencia de afectaciones por el proceso de desinfección superficial. A pesar de ello, el 73.0% de los segmentos exhibió la brotación de su yema axilar cuando se utilizó hipoclorito de sodio al 1.0%, sin diferencias significativas con la concentración de 1.5% (Fig. 2). La brotación de los explantes en estos tratamientos se caracterizó por un aumento del tamaño de la yema axilar, dado por su engrosamiento, discreta elongación y mantenimiento del color verde (Fig. 3A).

A los 25 días de cultivo, en los explantes se observó el desarrollo del brote a partir de la yema axilar y las primeras hojas habiertas de color verde intenso (Fig. 3B). El 62.7% de los brotes presentaron una longitud entre 0.8 y 1.5cm, mientras que los brotes restantes mostraron una longitud inferior al 0.5cm. No se observó en la base de los segmentos nodales el oscurecimiento del medio de cultivo como resultado de la exudación de compuestos fenólicos.

Los brotes continuaron su crecimiento después de la transferencia a medio de cultivo fresco; pero con el incremento del tiempo de cultivo se observó una disminución de su calidad fisiológica por la abscisión de las hojas. Hasta ese momento, las hojas se mantenían de color verde y en el tallo solo permanecieron las hojas cercanas a la yema apical (Fig. 3C).

DISCUSIÓN

El principal método de regeneración de plantas in vitro en especies leñosas lo constituye la vía organogénica, a partir del cultivo de yemas axilares presentes en los segmentos nodales de las ramas. Sin embargo, su iniciación o establecimiento in vitro es afectado por la incidencia de contaminación por hongos, bacterias o ambos, así como por la oxidación fenólica de los explantes (Hernández y González, 2010).

Diferentes autores, han confirmado esta problemática durante el establecimiento in vitro de segmentos nodales de plantas adultas de Annona muricata L. y para reducir estas afectaciones han dirigido sus investigaciones al efecto del tipo de explante (Rivero et al., 2001), a la estrategia de desinfección superficial (Ramírez-Villalobos et al., 2002) y al efecto del sombreamiento de planta donante para la reducción de la oxidación fenólica (Velázquez et al., 2004). Sin embargo, los resultados no han sido del todo satisfactorios. Por ejemplo, Rivero et al. (2001) observaron un incremento en la contaminación por hongos (81.91%) en la medida que los segmentos nodales se encontraban más distantes de la yema apical de la rama. Además, describen la presencia de oxidación fenólica en los diferentes tipos de segmentos. Estos autores obtuvieron a los 28 días de cultivo una brotación del 26.67% en el tercer y cuarto segmento.

Igualmente, los resultados de Ramírez-Villalobos et al. (2002) mostraron altos porcentajes de contaminación por hongos y bacterias (56.0 y 78.0 %, respectivamente) con viabilidad de los explantes entre 22.0 y 50.0%, dependiendo del tiempo de desinfección. Por ello, concluyeron que el hipoclorito de sodio no controló los microorganismos contaminantes presentes en los explantes procedentes de plantas adultas cultivadas en el campo.

Es posible que la causa fundamental de estos resultados esté relacionada con la utilización de yemas de árboles adultos de Annona muricata L., las cuales tienen problemas para su desarrollo in vitro, lo que se explica por la edad de los árboles fuente de explantes. Al respecto, se considera como factor determinante en el éxito de la propagación in vitro de especies leñosas el estado fisiológico de la planta donante, el cual aumenta con la utilización de explantes jóvenes (Dodds, 1983) y disminuye en la medida que la planta donante se aleja de su fase juvenil. Por ello, algunos protocolos han implementado métodos para inducir revigorización al material vegetal en estado fisiológico avanzado y rejuvenecimiento al adulto que presenta un mayor desarrollo ontogénico (Fraga et al., 2002).

La planta adulta de A. muricata presenta cambios progresivos como la pérdida de capacidad morfogénica y de su totipotencialidad, así como en los niveles hormonales. Además, in vitro el tejido vegetal de la planta adulta tiende a permanecer latente, a desarrollar callo y morir (Acosta et al., 2011). Por ello, Ferreira de Santana et al. (2011) consideraron que todavía hay algunos factores que puede interferir seriamente en los procesos de organogénesis in vitro de especies de Annona, especialmente en términos de inducción de brotes en segmentos nodales.

En A. muricata, estos resultados constituyen el primer informe donde se obtienen altos porcentajes de desarrollo de brotes axilares (73.0%) a partir de segmentos nodales establecidos, con baja incidencia de contaminación microbiana. Después de establecidos los cultivos, una de las dificultades que se presentaron en este estudio fue la disminución de la calidad fisiológica de las plantas por la abscisión de las hojas de los explantes. En este sentido, Bring (2000) consideró que podría estar relacionado con el cierre hermético de los recipientes, lo cual provoca poco intercambio gaseoso con el exterior y trae como resultado la falta de O2 y la acumulación de gases como el CO2 y etileno. Estos aspectos serán considerados en estudios posteriores.

CONCLUSIONES

En este estudio se logró el establecimiento in vitro de segmentos nodales de plantas jóvenes de Annona muricata L. En el 73.0% de los segmentos nodales se produjo la brotación de la yema axilar cuando se utilizó hipoclorito de sodio al 1.0%. Además, se observó el desarrollo de los brotes, con una longitud entre 0.8 y 1.5cm, así como de las hojas. Sin embargo, la posterior abscisión de estas evidenció la importancia de estudiar las condiciones de cultivo durante la fase de multiplicación.

 REFERENCIAS

Acosta, MA, Peña EJ, Castro D (2011) Evaluación de medios de cultivo para la producción in vitro de Annona muricata L. mediante la técnica de microinjertación seriada. Acta Agronómica 60(2): 140-146

Badrie, N, Schauss A (2010) Soursop (Annona muricata L.) Composition, nutritional values, medicinal uses, and toxicology. Bioactive Foods in Promoting Health: 621-643

Barros-Neto, JD (2008) Conservação de polen de Anonnas comerciais Dissertação. Mestrado em Agricultura tropical e subtropical. Instituto Agronômico de Campinas, Campinas, 78p.

Bring, H (2000) Micropropagation and determination of the in vitro stability of Annona cherimola Mill. and Annona muricata L. Berlin, Humboldt-University. Landwir tschaftlich-Gär tnerische Fakultät, Diss. [En línea] Disponible en: http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/bridg-hannia-2000-03-24/HTML/brigd -ch1.html. Consultado 23 de junio de 2012

Cordeiro, MCR, Pinto ACQ, Andrade SMR (2005) Uses Annonas species. En: Pinto, ACQ (Eds) Annona species, pp. 41-47. International Centre for Underutilised Crops University of Southampton, Southampton

Dodds, JH (1983) Tissue culture of trees. AUI. Publishing. West port. Connecticut

Fraga, M, Cañal M, Aragonés A, Rodríguez R (2002) Factors involved in Pinus radiata D. Don. micrografting. Ann. For. Sci. 59: 51-157

Ferreira de Santana, JR, Paiva R, Valéria de Souza A, Muniz de Oliveira L (2011) Effect of different carbon sources on the in vitro multiplication of Annona sp. Ciênc. Agrotec. 35(3): 487-493

Hernández Y, González ME (2010) Efectos de la contaminación microbiana y la oxidación fenólica en el establecimiento in vitro de árboles frutales. Cultivos Tropicales 31(4): 58-69

Murashige, T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiology plant 13: 473-479

Pinto, ACQ, Cordeiro MCR, Andrade SEM, Ferreira FR, Filgueiras HÁC, Alves RE, Kimparas DI (2005) Annona species, International Center for Underutilised Crops, University of Southampton, Southampton. 268 p.

Ramírez-Villalobos, M, Urdaneta A, León de Sierralta S (2002) Establecimiento in vitro de explantes adultos del guanábano (Annona muricata L.) tratados con hipoclorito de sodio. Rev. Fac. Agron. 19: 48-55

Rivero, GC, Ramírez MC, de Sierralta SL (2001) Tipo de explante en el establecimiento in vitro del guanábano (Annona muricata L.). Rev. Fac. Agron. 18: 258-265

Rodríguez-Dopazo, A, Farrés-Armenteros E, Placeres-Gafas J, Peña-González O, Fornaris LM, Mulen L, Ramos J, Hernández-Espinosa D (2010) Una mirada al manejo del cultivo de la guanábana (Annona muricata L.). Revista CitriFrut. 27(1): 64-68

Soares, EJ, Martins ABG (2003) Clonagem de quatro espécies de Anonaceae potenciais como porta-enxertos. Revista Brasileira de Fruticultura 25(2): 286-289

Velázquez, M, González A, Mata F, León de Sierralta S, Esparza D, Ramírez M (2004) Tipo de sombreamiento y tiempo de crecimiento de brotes laterales sobre la viabilidad de explantes de Annona muricata L. Rev. Fac. Agron. 21: 12-18

Recibido: 18-7-2013
Aceptado: 19-9-2013

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