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Comunicación Corta Biotecnología vegetal Vol. 3, No. 2: 111 - 113, abril - junio 2003
Efecto del carbendazim para el control de Colletotrichum sp., contaminante del establecimiento in vitro de callos de café
Mileidy Cruz Martín*, Mayra Acosta Suárez, Alina Capote, Michel Leiva y Yelenys Alvarado. *Autor para correspondencia.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e-mail: mcruz@ibp.uclv.edu.cu
RESUMEN
Se identificó el género Colletotrichum como contaminantes frecuente en la formación de callos de café a partir de fragmentos de explantes foliares de plantas cultivadas en campo. La presencia de este género como contaminante en fragmentos de hojas de café utilizadas para la formación de callos implicó al explante inicial como posible fuente de contaminación. Se evaluó, además, el efecto del carbendazim para su control a partir de la determinación de su Mínima Concentración Inhibitoria (MCI) en medio de cultivo PDA por el método de dilución en agar. El aislado CCIBP Co-1 utilizado para la determinación de la susceptibilidad fue controlado a una concentración de 1.0 mg.l-1 del carbendazim.
Palabras clave: Coffea arabica, contaminación microbiana, control, Mínima Concentración Inhibitoria
ABSTRACT
Collectotrichum genus was identified as frequent contaminant in coffee callus formation from foliar explants fragments of plants cultivated in field. The presence of this genus as contaminant in fragments of coffee leaves used for callus formation involved the initial explants as possible contamination source. It was also evaluated the effect of carbendazim for its control beginning from the determination of its Minimal Inhibitory Concentration in PDA culture medium by the dilution in agar method. The isolated CCIBP Co-1 used for the susceptibility determination wascontrolled at 1.0mg.l-1 carbendizin concentration.
Key Words: Coffea arabica, microbial contamination, control, Minimal Inhibitory Concentration
La contaminación microbiana se ha referido como una de las limitantes para el cultivo in vitro del cafeto a partir de explantes provenientes de plantas cultivadas en el campo (García y Rafael, 1990; Danby et al., 1994; González y Barrios, 2002; De Rezende et al., 2003).
La presencia de microorganismos durante la fase de establecimiento de especies leñosas es un serio problema que afecta su cultivo in vitro (Quintero 1997; Jiménez, 1998). En ello el explante inicial constituye la fuente principal de contaminantes propiciado quizás, por las características anatómicas de estos cultivos tales como: la presencia de cera y estípulas en los tallos que permite la acumulación de agentes contaminantes. Duhem et al. (1988) refirieron tres ubicaciones de la contaminación microbiana en plantas de café: en la superficie del tejido, bajo las estípulas y en el sistema vascular.
Para la formación de callos de café se han empleado fragmentos de explantes foliares de plantas cultivadas in vitro (Barbón, 1997) o en campo (De Rezende et al., 2003). González y Barrios (2002) encontraron una alta incidencia de contaminantes fungosos en la formación de callos de Coffea canephora y C. robusta. Entre ellos se destacaron los géneros Fusarium, Cladosporium y Colletotrichum. Este último se ha identificado como saprófito o parásito en casi todas las regiones del mundo donde se cultiva café, y es el responsable de enfermedades como la Antracnosis de las hojas, muerte regresiva, quemazón de los frutos maduros y la enfermedad de las cerezas verdes del café (Martínez y Zambrano, 1994).
Para la eliminación de contaminantes microbianos durante el cultivo in vitro de plantas se han empleado métodos físicos, biológicos y químicos (Leifert y Cassells, 2001). El uso de sustancias antimicrobianas ha resultado adecuado en los casos en que se identifica el microorganismo presente y se evalúa su susceptibilidad a la misma. Por ejemplo, autores como Vieira et al. (1988) y Carrazana et al. (1997) han obtenidos buenos resultados en el control de los contaminantes fungosos con el empleo de fungicidas en el medio de cultivo previa identificación del microorganismo y la determinación de su susceptibilidad.
Teniendo en cuenta estos criterios este trabajo se propuso como objetivos identificar un contaminante fungoso de alta frecuencia de aparición en la formación de callos de café y evaluar el efecto del cabendazim para su control.
Material vegetal
Fragmentos de hojas de Coffea arabica L. cv Caturra rojo, procedentes de plantas adultas cultivadas en campo, establecidos en medio de cultivo Sondhal (Sondhal y Sharp, 1977) para la formación de callos y visiblemente contaminados por un hongo filamentoso de color gris, superficie aterciopelada y reverso negro.
Fungicida
Carbendazim en forma de un complejo con β-ciclodextrina (Complejo I), el cual fue suministrado por el Departamento de Licenciatura en Química de la Facultad de Química-Farmacia de la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas.
El contaminante se aisló por siembra directa en placas de Petri (9.0cm Ø) que contenían 10ml del medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) (BioCen) y se incubaron a 28ºC en oscuridad durante 14 días.
Para el estudio taxonómico se tuvieron en cuenta sus características culturales (crecimiento, color de la colonia, color del reverso y textura superficial) y morfológicas (características de las hifas, de las estructuras de reproducción, de las esporas, presencia de setas, etc.). Para la identificación se utilizaron los criterios establecidos por Barnett y Hunter (1987).
En medio de cultivo PDA, se observaron colonias grises oscuras, con líquido transpirado de color gris oliváceo, reverso negro y crecimiento lento. En cuanto a la caracterización morfológica se observaron conidios unicelulares, alargados, casi cilíndricos con un ligero estrechamiento en el centro con extremos redondeados, estas características coincidieron con las referidas para el género Colletotrichum sp. perteneciente a la clase Deuteromycetes u hongos imperfectos, orden Melanconiales, familia Melanconiaceae.
La presencia de este género como contaminante en fragmentos de hojas de café utilizadas para la formación de callos implicó al explante inicial como posible fuente de contaminación. Varios investigadores afirman haber encontrado serios problemas al tratar de cultivar in vitro explantes procedentes de plantas leñosas, sobre todo cuando provienen de condiciones adultas y cultivadas directamente en el campo, se atribuye como causa fundamental el alto porcentaje de contaminación bacteriana y fungosa (García y Rafael, 1990; Viloria, 1993; Borges, 1997). Es por ello que juega un papel importante la selección y crecimiento de la planta madre bajo condiciones higiénicas adecuadas, esto, según Daquinta et al. (2000), reduciría notablemente la contaminación, principalmente la fungosa.
El efecto del carbendazim sobre la cepa CCIBP- Co1 de Colletrotrichum sp. se evaluó a partir de la determinación de su Mínima Concentración Inhibitoria (MCI) en medio de cultivo PDA por el método de dilución en agar según lo descrito por Cruz et al.(2001).
Se ensayaron concentraciones decrecientes de este en diluciones seriadas dobles desde 64.0 a 0.03125 mg.l-1. Se prepararon dos repeticiones de cada concentración. Además, se incluyeron placas de Petri con medio de cultivo PDA libres de fungicida para ser usadas como controles de crecimiento.
Se colocó un disco de micelio (7.0mm Ø) en el centro de cada placa, se invirtieron y se incubaron a 28ºC y oscuridad constante. Se midió diariamente el diámetro en milímetros de las colonias hasta los 14 días.
El carbendazim logró controlar la cepa de Colletotrichum sp. a una concentración de 1.0 mg.l-1 y se tomó este valor como su MCI. (Figura 1). Este resultado concordó con los presentados por Vieira et al. (1988) quienes afirmaron la efectividad del uso de forma rutinaria del carbendazim para el control de la contaminación fungosa en el cultivo in vitro de Guaraná (Paullina cupana var Sorbilis H.B.K.)
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García y Rafael (1990) refirieron el uso del Benomyl (500mg.l-1) añadido en el medio de cultivo para obtener microesquejes de café libres de contaminación fungosa. Además otros autores han afirmado obtener buenos resultados con la utilización del Benomyl y el Propiconazol para el control de la contaminación fungosa en la fase de establecimiento de varias especies (Danby et al., 1994; Carrazana et al., 1997).
El carbendazim (bencimidazol 2-il carbamato de metilo) es el componente activo de varios funguicidas sistémicos entre los que se encuenta el Benomyl, su mayor dificultad radica en su escasa solubilidad en agua. Al presentarse el carbendazim acomplejado con una β-ciclodextrina este problema queda solucionado por lo que pudiera utilizarse el Complejo Carbendazim-β-ciclodextrina como una alternativa para solucionar el problema de la presencia de contaminantes fungosos en explantes foliares de café procedentes de plantas adultas cultivadas en campo. Además se pudiera recomendar el uso de este producto en el tratamiento de las plantas donadoras antes de ser introducidas en el cultivo in vitro.
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