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Nota Técnica Biotecnología Vegetal Vol. 11, No. 3: 163 - 168, julio - septiembre, 2011
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Combinación de técnicas biotecnológicas y tradicionales para la propagación de diferentes especies de bambú
M. Freire-Seijo*, Y. García-Ramírez, O. Hurtado, León M., L. Fajardo Rosabal, M. Cruz-Martín, C. Sánchez-García, Y. Alvarado-Capó, M. Acosta-Suárez, M. Tejeda, B. Roque, M. Leiva-Mora. *Autor para correspondencia
Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central ‘Marta Abreu’ de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara. CP 54 830. Cuba e-mail: marisolf@ibp.co.cu
RESUMEN
La propagación in vitro permite clonar plantas libres de patógenos y uniformes. Además ofrece facilidades de transportación y disponibilidad de plantas durante todo el año. Para la propagación in vitro de las especies de bambú se han descrito varias dificultades entre las que se pueden citar como las más importantes: la contaminación microbiana endógena y la necrosis de los explantes. Estas han limitado la posibilidad de emplear de manera eficiente y repetible los protocolos de propagación in vitro desarrollados hasta el momento. Establecer esquemas de propagación de plantas en los que se combinen las facilidades de las técnicas de cultivo de tejidos y las vías de propagación tradicional constituye una excelente opción para poner en manos de los productores sistemas sostenibles y amigables con el medio ambiente. Las especies utilizadas en la investigación fueron Guadua angustifolia Kunth y Bambusa vulgaris var. vulgaris. Se utilizaron como explantes iniciales yemas axilares de plantas rejuvenecidas en casa de cultivo. Además, fueron identificados por primera vez los contaminantes de alta frecuencia de aparición en una población de plantas en casa de cultivo e in vitro además de la presencia de polifenoles tanto en yemas axilares muertas establecidas in vitro como en el medio de cultivo. Las plantas llevadas a casa de cultivo fueron capaces de emitir entre cuatro y siete nuevos hijos con altos porcentajes de supervivencia durante los deshijes. Las plantas producidas en el laboratorio y aclimatizadas fueron entregadas a los campesinos quienes se encargan de realizar los deshijes a nivel de vivero. Estos resultados demuestran la posibilidad de emplear estrategias de trabajo de desarrollo local en las que se permita el acceso de los campesinos a los productos de las altas tecnologías.
Palabras clave: actores locales, plantas in vitro, propagación vegetativa
ABSTRACT
In vitro propagation allows cloning pathogen-free and uniform plants. This technique favours transportation and availability of plants all the year. Several challenges have been described for in vitro propagation of bamboo species. Among them, the most important are endogenous microbial contamination and necrosis of the explants. These have limited the possibility to use the efficient and repeatable in vitro propagation protocols developed so far. Establishing plant propagation schemes that combine the facilities of tissue culture and traditional techniques is an excellent choice to put in the hands of farmers sustainable and environmentally friendly systems. The species used in the research were Guadua angustifolia Kunth and Bambusa vulgaris var. vulgaris. Axillary buds of rejuvenated plants at greenhouse were used as initial explants. The contaminants of high frequency appearing in a population of plants at greenhouse and in vitro culture were also identified for the first time. Also, the presence of polyphenols in both, dead in vitro axillary buds and on the culture medium was identified. Plants transferred to the greenhouse delivered from four to seven new suckers with high rates of survival during the removing of suckers. Plants produced in the laboratory and acclimatized were delivered to farmers. They are in charge of removing suckers at nursery level. These results demonstrated the possibility of using strategies of local development work which enable farmers to access products high technology.
Keywords: local actors, in vitro plants, plant propagation
INTRODUCCIÓN
Cuba es la Isla, de la zona, con mayor diversidad en especies de bambú. Cuenta con un total de siete géneros y 19 especies de bambúes nativos y se encuentran siete géneros y 22 especies de bambúes exóticos (López et al., 1989). Estas especies pueden
propagarse vegetativamente empleando secciones de tallos o culmos. A pesar de que existen otras vías de propagación, esta es la más utilizada por los viveristas en Cuba. Sin embargo, en muchos casos la eficiencia es baja y obliga permanentemente al corte de culmos que pueden ser empleados con fines comerciales o ambientales.
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El cultivo de tejidos vegetales y más específicamente la regeneración de plantas vía organogénesis, ha sido empleada para la propagación de bambués (Jiménez et al., 2006; Ramanayake et al., 2006). Las especies asiáticas, se han propagado in vitro con mayor facilidad (Saxena, 1990; Prutpongse y Gavinlertvana, 1992; Saxena y Dhawan, 1999).
Han sido descritas algunas dificultades para emplear este método de propagación, una de ellas se encuentra en la fase de aclimatización de las plantas propagada in vitro dada la baja supervivencia de las plantas en condiciones ex vitro. Esto se relaciona con factores como la temperatura, calidad de los sustratos, calidad del material vegetal, así como la humedad relativa y del sustrato (Morán, 2008).
En el marco del proyecto Bambú - Biomasa el Instituto de Biotecnología de las Plantas ha trabajado en investigaciones que generen sistemas de propagación para garantizar la producción de plantas de bambú de calidad (Freire-Seijo et al., 2008). Para lograr este objetivo, contar con un sistema de propagación en el que se combinen las técnicas biotecnológicas y tradicionales empleando el deshije como herramienta para el incremento del número de plantas sería factible. En este trabajo se muestran los principales resultados de las investigaciones realizadas para el desarrollo de una estrategia para la propagación de plantas de bambú en las que se combinan las ventajas de las técnicas de cultivo de tejidos (biotecnológicas) y las vías de propagación tradicional como sistema sostenible y amigable con el medio ambiente.
TÉCNICAS BIOTECNOLÓGICAS
Fase de establecimiento
El establecimiento in vitro de las yemas axilares se desarrolló en las especies Guadua angustifolia Kunth y Bambusa vulgaris var. vulgaris. Para ello se emplearon yemas axilares de plantas rejuvenecidas en casa de cultivo. La colecta del material vegetal se realizó en período lluvioso y de seca. El mayor número de yemas brotadas (99%) y de explantes libres de contaminantes microbianos visibles (98%), se logró entre los meses de enero-abril y noviembre-diciembre en la especie Bambusa vulgaris var. vulgaris (García Ramírez et al., 2010) mientras que para la especie Guadua angustifolia se obtuvo 95.81% de brotación de
las yemas axilares al emplear el hipoclorito de sodio al 1.0% durante cinco minutos.
Además, se cuantificaron e identificaron los microorganismos contaminantes que crecieron durante esta fase y se determinó el efecto de 6-Bencilaminopurina (6- BAP) y el estado físico del medio de cultivo.
En las especies leñosas frecuentemente se refieren pérdidas que ocasionan los microorganismos contaminantes durante la fase de establecimiento. Los bambúes no constituyen una excepción, los trabajos realizados por Cruz-Martín et al. (2007), Acosta-Suárez et al. (2008) y García-Ramírez et al. (2010a) describen los resultados al respecto. Se comprobó que sobre las yemas axilares se desarrollaba una microbiota diversa compuesta por hongos filamentosos y bacterias los cuales se identificaron como contaminantes in vitro. Los resultados en las investigaciones realizadas sobre el tema permitieron proponer un plan de defensa fitosanitaria para las plantas donantes.
Por otra parte, los resultados permiten emplear el medio de cultivo líquido durante la fase de establecimiento de las yemas axilares (Figura 1). El empleo de medios de cultivo líquidos favoreció el desarrollo morfológico de las plantas in vitro, facilitó las operaciones y disminuyó el costo de producción de las plantas. En procesos productivos el uso de medios de cultivo líquidos facilita la detección de los microorganismos, fundamentalmente, bacterias.
Durante la fase de establecimiento las yemas axilares, fundamentalmente de la especie Guadua angustifolia, morían luego de la brotación in vitro. Se determinó que una de las posibles causas de la mortalidad de los explantes era la presencia de polifenoles, dada por la activación del metabolismo secundario como respuesta a condiciones de estrés en los explantes durante su establecimiento in vitro. Se demostró por primera vez la presencia de polifenoles tanto en yemas axilares muertas establecidas in vitro como en el medio de cultivo donde se encontraban en un 0.077% y concentraciones de 0.182 y 0.187 mg m l-1 para fenoles de bajo y alto peso molecular respectivamente (Fajardo, 2006).
En la literatura científica consultada, no se hace referencia a esta problemática, solamente se conoce que varias investigadores atribuyen la muerte repentina de los explantes a múltiples
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causas, sin darle hasta el momento una explicación para el caso de la especie Guadua angustifolia (Huang et al., 2002).
Fase de multiplicación
Durante la fase de multiplicación se adicionaron a los medios de cultivo diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento y se estudió la influencia del estado físico del medio de cultivo para propiciar la formación de nuevos brotes.
Los resultados demostraron que durante la fase de multiplicación de las especie B. vulgaris puede ser empleado el medio de cultivo líquido (Figura 1) para la multiplicación de los brotes (García-Ramírez et al., 2010b). También se puede afirmar que hasta el quinto subcultivo de multiplicación se producen incrementos en el coeficiente de multiplicación, adicionando 6.0 mg l-1 de 6-BAP (García-Ramírez et al., 2009). Resultados más recientes (no publicados) demuestran que las plantas pueden ser multiplicadas durante siete subcultivos (Figura 1), en los subcultivos siguientes el coeficiente de multiplicación disminuye.
Fase de enraizamiento
Según los resultados de García-Ramírez et al. (2010) la fase de enraizamiento debe realizarse en dos etapas, en la primera de ellas debe adicionarse al medio de cultivo Thidiazurón (TDZ) y posteriormente se transfieren las plantas a otro medio de cultivo que contiene ácido indolbutírico (AIA). El mayor porcentaje de plantas con raíces (88.0%) se obtuvo en el tratamiento en el cual se empleó 0.6 mg l-1 de TDZ. En este mismo tratamiento las plantas alcanzaron 6.96 cm de altura.
En la figura 1 se muestra el aspecto de las plantas al concluir la etapa 2 de la fase de enraizamiento.
Fase de aclimatización de plantas propagadas in vitro
En casa de cultivo se diseñaron los experimentos en función de lograr la aclimatización de las plantas multiplicadas in vitro y favorecer la emisión de nuevos brotes para su posterior deshije, sobre este tema profundizan las investigaciones realizadas por Hurtado (2010).
Los resultados mostraron que la altura de las plantas al concluir la fase de enraizamiento fue la característica que más influyó en su aclimatización, Las mayores de 3.0 cm de altura fueron las que mostraron un mejor desarrollo morfológico y anatómico (Hurtado, 2010). Además, se determinó que la combinación de los sustratos humus de lombriz y zeolita proporcionaron a las plantas cultivadas in vitro de B. vulgaris var. vulgaris las mejores condiciones para su desarrollo durante la fase de aclimatización y emisión de nuevos brotes (Figura 1). Bajo estas condiciones las plantas fueron capaces de emitir un promedio de 3.5 brotes/planta.
De forma general, las investigaciones realizadas brindan nuevos aportes al estudio de la aclimatización y la anatomía de esta especie siendo los primeros sobre la aclimatización de plantas de B. vulgaris var. vulgaris Schrad. ex Wendl y la caracterización del desarrollo alcanzado por las plantas durante el intervalo del cultivo in vitro a la etapa de campo. Igualmente los estudios realizados sobre sustrato, la aplicación de fertilizantes para la obtención de nuevos brotes por planta y la multiplicación vegetativa de las plantas aclimatizadas procedentes del cultivo in vitro constituyen los primeros informes.
PROPAGACIÓN EMPLEANDO TÉCNICAS TRADICIONALES
Propagación vegetativa
El segundo sistema de propagación desarrollado se basó en la propagación vegetativa empleando secciones de tallos y riendas.
De forma general, las investigaciones realizadas brindan nuevos aportes al estudio de la aclimatización y la anatomía de esta especie siendo los primeros sobre la aclimatización de plantas de B. vulgaris var. vulgaris Schrad. ex Wendl y la caracterización del desarrollo alcanzado por las plantas durante el intervalo del cultivo in vitro a la etapa de campo. Igualmente los estudios realizados sobre sustrato, la aplicación de fertilizantes para la obtención de nuevos brotes por planta y la multiplicación vegetativa de las plantas aclimatizadas procedentes del cultivo in vitro constituyen los primeros informes.
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Figura 1. Propagación in vitro de Bambusa vulgaris var. vulgaris. Arriba: características de las plantas de al emplear medios de cultivo en estado líquido (izquierda) y semisólido (derecha) durante la fase de establecimiento. Abajo izquierda: brotes en fase de multiplicación luego de 20 días en medio de cultivo líquido. Abajo centro: brotes en fase de enraizamiento con emisión de raíces a los 20 días de cultivo (Etapa 2). Abajo derecha: emisión de nuevos brotes durante la fase de aclimatización luego de aplicar nitrato de potasio y sulfato de amonio.
PROPAGACIÓN EMPLEANDO TÉCNICAS COMBINACIÓN DE TÉCNICAS
TRADICIONALES BIOTECNOLÓGICAS Y TRADICIONALES
Propagación vegetativa
El segundo sistema de propagación desarrollado se basó en la propagación vegetativa empleando secciones de tallos y riendas.
Se evaluó la influencia del diámetro de las estacas en la brotación de las yemas y su relación con la dinámica de crecimiento de las yemas brotadas. Para ello se emplearon secciones de tallos de diámetros entre 1.0 cm y 3.0 cm. Se estudió el tipo y momento adecuado para realizar la fertilización, la influencia de la inmersión de las estacas en una solución enraizadora (12 mg l-1 de ácido naftalenacético (ANA), 12 mg l-1 de ácido indolbutírico (AIB) y 12 mg l-1 de AIA) antes de la siembra y luego de la brotación de las yemas (Figura 2). Las plantas obtenidas fueron deshijadas y se incluye esta labor en condiciones de casa de cultivo o vivero como una vía para incrementar la población del germoplasma obtenido. Al emplear para la propagación secciones de tallos con un diámetro mayor de un centímetro se logró la brotación de las yemas y emisión de raíces en el 69.9% de las secciones de tallos. Al emplear los brotes obtenidos en la multiplicación de los explantes, se logró aumentar los niveles de supervivencia a un 92.3% (Gallardo et al., 2008).
De la brotación de las yemas existentes en las secciones de tallos o riendas se obtienen entre 1 y 4 plantas (dependiendo de la especie) y habitualmente, estas son plantadas directamente en campo. Sin embargo, las investigaciones realizadas demuestran que es posible independizar estas plantas y someterlas a un proceso continuo de deshije (León et al., 2010). Esta alternativa puede aplicarse en condiciones de casa de cultivo o vivero pues los requerimientos son mínimos. Con esta propuesta los viveristas no se ven obligados a ir continuamente al campo a buscar explantes, lo que disminuye costos, humaniza la tarea y minimiza el impacto ambiental del hombre al no dañar los plantones.
De esta forma tanto las plantas multiplicadas in vitro y aclimatizadas como las plantas obtenidas de la brotación de las yemas de tallos y riendas pueden ser sometidas a un proceso de deshije.
Las plantas propagadas in vitro fueron capaces de emitir entre cuatro y siete nuevos hijos con altos porcentajes (97.4%) de supervivencia durante los deshijes. Los resultados posibilitan emplear estrategias de trabajo de desarrollo local en las que los campesinos accedan a los productos de las altas tecnologías. Los resultados
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permitieron confeccionar un manual para la propagación de los bambúes. Este se ha empleado en las capacitaciones a los viveristas de varias provincias del país (Figura 2).
A partir de los resultados de los estudios realizados se confeccionaron dos instructivos técnicos, uno de ellos específicamente para la especie Guadua angustifolia debido a las dificultades que tiene esta especie para la emisión de raíces y el segundo instructivo referido a la propagación de la especie B. vulgaris aunque puede ser aplicado a otras especies de bambúes.
Un enfoque holístico para la propagación de los bambúes está dado por la combinación de
técnicas biotecnológicas y tradicionales para la propagación de diferentes especies de bambú. La propuesta no absolutiza en la propagación in vitro como única vía de propagación puesto que se ofrecen tres opciones (Figura 3): 1) La producción de cantidades mínimas de plantas en el laboratorio. 2) La propagación mediante el método de propagación vegetativa empleando secciones de riendas y tallos. 3) El deshije de plantas provenientes de ambos medios de propagación. Esta propuesta permite poner en manos de los productores plantas de alto valor agregado, proteger el ambiente y las plantaciones de bambúes ya existentes, además de aumentar los ingresos de los viveristas.
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Figura 2. Brote de Guadua angustifolia Kunth emitiendo raíces a los 35 días de cultivo (izquierda). Actividad de capacitación a los productores para mostrar la forma de realizar la multiplicación vegetativa de plantas de bambú (derecha).
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Figura 3. Estrategia para la propagación de bambúes en Cuba.
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CONCLUSIONES
El empleo de yemas axilares como explantes iniciales, medios de cultivos líquidos y concentraciones y tipos adecuados de reguladores del crecimiento posibilitaron establecer un protocolo de propagación in vitro de Bambusa vulgaris var. vulgaris y G. angustifolia que generaron plantas de calidad.
Además, se demostró que es posible realizar la multiplicación vegetativa de estas plantas mediante el deshije de las plantas obtenidas in vitro y aclimatizadas, provenientes de la propagación vegetativa.
AGRADECIMIENTOS
A facilidades creadas por el proyecto Bambú-Biomasa II, financiado por COSUDE
Este trabajo fue presentado en el marco de la Primera Conferencia Regional de Bambú: El bambú en el desarrollo local, organizada por la Facultad de Construcciones, el Centro de Investigación y Desarrollo de Estructuras y Materiales (CIDEM) de la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, la Agencia Suiza para el Desarrollo y la Cooperación (COSUDE), INBAR y la red ECOSur, del 17-19 de mayo de 2011. Villa Clara, Cuba.
REFERENCIAS
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