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Comunicación Corta Biotecnología vegetal Vol. 3, No. 3: 181 - 186, julio-septiembre 2003
Estudios bioquímicos para la selección in vitro de variedades de arroz con tolerancia a estrés hídrico
Aymara García1*, Marilyn Florido2 y Regla M. Lara2. *Autor para correspondencia.
1 Instituto de Investigaciones de Riego y Drenaje Avenida Camilo Cienfuegos y Calle 27 Arroyo Naranjo Cuba email: iird@ceniai.inf.cu
2 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo realizar estudios bioquímicos para la selección in vitro de variedades de arroz con tolerancia a estrés hídrico en la búsqueda de posibles marcadores que permitan la diferenciación de las variedades en cuanto a su grado de tolerancia ante este factor abiótico. Se determinaron los porcentajes de daños medido por la permeabilidad de la membrana celular, a muestras de callos de cuatro variedades cubanas de diferentes grados de tolerancia a la sequía (Perla de Cuba, Jucarito- 104, Amistad- 82 e INCA LP-7) que fueron incubados en soluciones simuladoras del estrés hídrico (0. -0.5, -1.0, -1.5 MPa) durante 24 y 72h. A las 72h de incubar los callos con la solución de -1.0 MPa, se realizaron análisis electroforéticos de los sistemas isoenzimáticos: peroxidasas, fosfatasas ácidas y esterasas en un sistema discontinuo de poliacrilamida y asimismo, se evaluó la actividad de la enzima peroxidasa y los contenidos de proteínas totales y prolina. Los resultados permitieron detectar un comportamiento diferencial de las variedades en cuanto a su grado de tolerancia al utilizar -1.0 MPa y se discute la posibilidad de usar algunos de las variables en la detección de tolerancia a estrés hídrico.
Palabras clave: actividad peroxidasa, callo, isoenzimas, marcador, PEG, prolina, proteínas totales
ABSTRACT
This research paper was carried out in order to make biochemical studies for in vitro selection of water stress tolerance rice varieties with the aim of looking for possible markers which may be useful to genotypic discrimination against such abiotic factor. The percentages of damages measured by cellular membrane permeability were calculated in callus from rice varieties (Perla de Cuba, Jucarito-104, Amistad-82 and INCA LP-7) having different water stress degrees at 24 and 72h of incubating with solutions at different PEG-6000 levels (0, -0.5, -1.0, -1.5 MPa). After 72h of incubating calluses at -1.0 MPa, electrophoretical analyses developed in a discontinued system of polyacrilamide gels of the isoenzymes: perodixase, fosfatases and esterases as well as, peroxidase activity, total protein and proline contents were determined. The result showed differential response of varieties at -1.0 MPa having present its tolerance degree being useful the PEG concentration and some biochemical characters to detect water stress tolerance.
keywords: callus, isoenzymes, markers, PEG, peroxidase activity, proline, total protein
INTRODUCCIÓN
Dentro de los programas de mejoramiento genético para la tolerancia a estrés medioambiental resulta de vital importancia el establecimiento de marcadores que permitan incrementar la eficiencia en la selección temprana de genotipos con mayor tolerancia al estrés hídrico y la variabilidad genética. Por ello, ha sido objeto de estudio la variación tanto de sistemas isoenzimáticos como de la actividad de algunas enzimas porque en alguna medida se conocen las bases bioquímicas de la tolerancia y cuales de estas pudieran constituir mecanismos adaptativos que se inducen en las plantas y que a su vez, presenten una estrecha vinculación con el estrés (Weng, 2002).
En Cuba, se ha trabajado en la búsqueda de posibles marcadores bioquímicos para la selección en condiciones de salinidad de variedades de arroz (Iglesias y González, 1995 a y b), y de caña de azúcar tanto para estrés salino como hídrico (Díaz, 1998, Guía, 1998) y asimismo, recientemente se informó el estudio de algunos sistemas para la tolerancia a altas temperaturas en tomate (Florido et al., 2002). Sin embargo, existe muy poca información sobre la evaluación y detección de posibles marcadores bioquímicos para la selección de genotipos de arroz tolerantes al estrés hídrico, por lo que, teniendo presente la incidencia negativa de la sequía en la agricultura cubana durante los últimos años y la necesidad de incorporar una mayor cantidad de variedades a la producción arrocera nacional, el presente trabajo tuvo por objetivo realizar estudios bioquímicos en la búsqueda de marcadores que puedan ser de utilidad en la selección temprana de genotipos de arroz que muestren adaptabilidad a estas condiciones.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron cuatro variedades cubanas de arroz con diferentes respuestas a la sequía: Perla de Cuba (Perla); Tolerante, Jucarito 104 (J-104); Susceptible, Amistad- 82 (A-82); Tolerante e INCA LP- 7 (LP- 7); Tolerante (González, 1993, Alfonso, 1998)
Formación de callos
La siembra y la desinfección de las semillas maduras, 100 por cada variedad, se efectuaron según la metodología descrita por González (1993).
Inducción del estrés hídrico
Se prepararon soluciones de polietilenglicol (PEG-6000) a diferentes potenciales osmóticos (-0.5, -1.0 y -1.5 MPa) según Gupta et al. (1993), así como un tratamiento control que no se le añadió el PEG- 6000.
Determinación de la permeabilidad de la membrana celular
Se pesaron 0.05g de callos de cada variedad que se incubaron en 5 ml de solución a los diferentes potenciales osmóticos, señalados anteriormente, durante 24 y 72h a 25±2 goC y fotoperíodo de 16h, se utilizaron por tratamiento cinco viales de capacidad de 30 ml. Se determinó por conductimetría la permeabilidad de la membrana celular siguiendo la técnica descrita por García et al. (1999). El daño total de la membrana celular expresado en porcentaje fue calculado por tratamiento.
Análisis electroforéticos
Se pesaron 0.1g de callos de cada variedad y se incubaron a -1.0 MPa durante 72h. Posteriormente estos callos y otros sin tratar con PEG- 6000 fueron homogeneizados en frío con buffer que contenía sacarosa al 20% y 0.002% de ditiotrinol y se centrifugó a 12 000 gravedades a 4°C durante 20 minutos. Los extractos obtenidos se analizaron en un sistema discontinuo de geles de poliacrilamida al 85% según lo recomendado por Iglesias y González (1991). Para la caracterización de los sistemas peroxidasas, fosfatasas ácidas y esterasas se utilizaron las técnicas de tinción y conservación descritas por Iglesias (1986). En todos los casos se realizaron tres lecturas réplicas por cada muestra analizada y se confeccionaron los zimogramas en base al número, movilidad electroforética media e intensidad de tinción utilizando en este último caso la escala propuesta por Brewbakr y Hasegawa (1975).
Actividad de la enzima Peroxidasa y los contenidos de Proteínas totales y Prolina
Extracción y determinación de la actividad peroxidasa y el contenido de proteínas totales: Se pesaron 0.25g de callos y se homogeneizaron en 5 ml de buffer tris-HCl pH 7.4. Posteriormente se centrifugó a 12 000 gravedades a 4°C durante 15 minutos. El sobrenadante fue usado tanto para determinar la actividad de la enzima peroxidasa según el método descrito por Reynaldo (1990), definiéndose como unidad de actividad enzimática (UAE) la cantidad de enzima que provoca un cambio en la absorbancia de 0.01 min.-1 g masa freca -1, como para cuantificar el contenido de proteínas totales con el método de Lowry et al. (1951) con BSA como patrón.
Extracción y determinación del contenido de prolina: Para la extracción se adicionaron 7 ml de agua hirviendo a 0.25g de material vegetal, se maceró durante 2-3 minutos. La solución se filtró sobre algodón y se aforó a 10 ml. La determinación del contenido de prolina se realizó según Bates et al. (1973).
En los experimentos, repetidos tres veces, se utilizó un diseño completamente aleatorizado. Los datos se procesaron mediante análisis de varianza por variedad docimándose las diferencias significativas entre tratamientos por la prueba de rango múltiple de Duncan (1951).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de la permeabilidad de la membrana celular
En la tabla 1 se aprecia que a las 24h de incubar los callos en las soluciones de PEG- 6000 no se detectaron variaciones en la respuesta de las variedades pero a las 72h se encontró variabilidad de los genotipos en estudio que se correspondió con su grado de tolerancia al estrés hídrico. Las variedades A-82 y Perla no se afectaron al tratar los callos con soluciones de PEG-6000, mientras si lo hicieron la LP- 7 a -1.5 y la J-104 a -1.0 y -1.5 MPa . A partir de este resultado fue posible establecer las 72h como tiempo adecuado para la incubación del explante ante el PEG- 6000 y seleccionar la solución de -1.0 MPa para evaluar la tolerancia de las variedades a través de algunos indicadores bioquímicos. Este tipo de análisis ha sido propuesto por varios autores como método eficiente en la detección de tolerancia al estrés salino en variedades de arroz (Chowdry et al., 1995) y a la tolerancia a altas temperaturas en soya (Florido et al., 1996) y tomate (Florido et al., 1999).
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Análisis electroforéticos
Los resultados del análisis electroforéticos revelaron la existencia de variaciones en la composición de las izoenzimas estudiadas. Así, se puede apreciar en el zimograma de las Peroxidasas (Fig. 1) un aumento en la intensidad de tinción en la primera banda para las variedades Perla, A-82 y LP- 7 cuando los callos se trataron con la solución estresante a -1.0 MPa, y sin embargo, la variedad J-104 mostró ausencia de la última banda para este mismo tratamiento.
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De hecho, el aumento en la intensidad de tinción detectado en la isoenzima peroxidasas en presencia de PEG- 6000 ha sido también encontrado por Echenique y Polci (1994) que han indicado que dicha isoenzima forma parte del sistema de control de peróxidos en las células vegetales y de protección a las membranas celulares (Iglesias y González, 1995).
Por el contrario, se observó para fosfatasas ácidas (Fig. 2) que la solución a -1.0 MPa de PEG-6000 no afectó a esta isoenzima para las variedades tolerantes mientras que para la susceptible en presencia de PEG- 6000 hubo incremento en la tinción de la banda de mayor movilidad y disminución en la de menor.
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En la fig. 3 se muestra el zimograma Esterasas donde no hubo variaciones en la variedad Perla. En contraste, cuando los callos se sometieron a la solución de -1.0 MPa para la A-82 y LP- 7 se detectó ausencia de la primera banda y asimismo de la segunda y quinta bandas para J-104. En esta última variedad apareció una nueva banda que pudiera estar asociada con mecanismos adaptativos de la planta para sobreponerse al estrés (Iglesias, 1994).
Echenique y Polci (1994) encontraron un incremento en la intensidad de la tinción y la aparición de algunas bandas para los sistemas esterasas y fosfatasas ácidas en plántulas de pasto de un cultivar susceptible tratadas con PEG-6000 y no así en el tolerante, sugiriendo que el déficit hídrico induce una importante solubilización de las fosfatasas ácidas y otras hidrolasas en plantas que evitan la sequía y no en aquellas que la toleran.
Al parecer las variedades tolerantes al estrés hídrico logran mantener un mejor balance entre la síntesis y la degradación en presencia de este factor ambiental.
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Actividad de la enzima peroxidasa y contenidos de proteínas totales y prolina
De manera general la actividad de la enzima peroxidasa (Tabla 2) se incrementó para las variedades tolerantes en la solución a -1.0 MPa que se caracterizaron por una mayor actividad que la variedad susceptible. Aunque existen algunos criterios al respecto, Pérez et al. (1997) plantearon que el incremento en los niveles basales de las enzimas unido a la acción de otros compuestos antioxidantes puede constituir una adaptación de las plantas a las condiciones de estrés.
Las peroxidasas poseen la capacidad de eliminar el peróxido de hidrógeno por lo que su incremento puede ser una respuesta protectora que impide la formación de especies activadas de oxígeno y prevenir la formación de radicales hidroxilo.
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Del mismo modo, se encontró un aumento del contenido de proteínas totales (Tabla 3) a favor de las variedades tolerantes ante la solución simuladora del estrés hídrico, no así en la susceptible que disminuyó significativamente su contenido. Este resultado está en concordancia con lo señalado por otros autores tanto en condiciones de estrés hídrico como salino (Chandler y Robertson, 1994, Echevarría et al., 1995, 1996, García et al., 1999) considerado como una medida de protección ante el estrés osmótico, respuesta que pudiera estar vinculada con la expresión de genes específicos en presencia de estrés hídrico que favorecen la inducción de proteínas que en condiciones óptimas de disponibilidad de agua no son sintetizadas (Pérez et al., 1996).
En cuanto al contenido de prolina la tabla 4 muestra que las variedades Perla y A-82 presentaron un incremento en la concentración de este aminoácido en el tratamiento con -1.0 MPa respecto al control; por el contrario las variedades LP- 7 y J-104 mantuvieron igual comportamiento en ambos tratamientos. La acumulación de prolina es un fenómeno común que tiene lugar en plantas sujetas a déficit hídrico (Jerez et al., 1994). En ocasiones, ha sido usado como criterio útil para la selección de variedades adaptadas a estrés hídrico (Mukane et al., 1996). Sin embargo, se ha indicado que no siempre se acompaña de una mayor tolerancia a estrés. Al respecto, en arroz para condiciones de salinidad durante el estudio de dos variedades con diferentes grados de tolerancia no se observó correlación positiva entre el contenido de prolina y la tolerancia a la sal, lo que al parecer depende de las características genéticas y bioquímicas de cada especie (Echevarría et al., 1995, 1996). Estos criterios sugieren que la acumulación de prolina puede ser inefectiva sino se mejoran otros parámetros del proceso adaptativo.
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CONCLUSIONES
A partir de los resultados se concluye que al incubar callos de diferentes variedades de arroz en una solución simuladora del estrés hídrico con PEG- 6000, a -1.0 MPa de potencial osmótico, durante 72h y con la evaluación tanto del porcentaje de daño, medido por la permeabilidad de la membrana celular, como por algunas variables bioquímicas como las isoenzimas, la actividad de la enzima peroxidasa y el contenido de proteínas totales, se encontró un comportamiento diferencial de las variedades y se corroboró con el grado de tolerancia de éstas al estrés hídrico, lo que se sugiere su empleo como posibles marcadores bioquímicos para este factor abiótico en los programas de mejoramiento genético que se realizan en este cultivo.
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