Vol. 3, No. 3, 2003
Comunicacin Corta                                                                    Biotecnologa vegetal Vol. 3, No. 2: 187 - 189, julio-septiembre 2003

 

 

Aislamiento de un fragmento del ADNc ACC Oxidasa expresado durante la maduracin del fruto de Guayaba Enana

Guillermn Aguero*1, Edrey Rodrguez2, Lisbet Daz2, Neyda Bacallao2 y Elio Jimnez2. *Autor para correspondencia.

1  Centro de Anlisis de Procesos. Facultad Qumica Farmacia. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuan km 5 Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: chapin@qf.uclv.edu.cu

2 Instituto de Biotecnologa de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuan km 5 Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830.

RESUMEN

En este trabajo se describe el aislamiento y clonaje por TI-PCR (Transcripcin inversa y Reaccin en cadena de la polimerasa) de un fragmento de ADNc que codifica para la ACC oxidasa a partir de frutos maduros de guayaba. Este es un paso preliminar para aplicar la tecnologa de ARN antisentido para el silenciamiento de genes con el propsito de controlar la maduracin en frutos de guayaba a travs de la transformacin gentica. Un fragmento de ADNc ACC oxidasa fue aislado usando el sistema Ready To GoTM RT-PCR Beads y fue clonado en el vector pGEMR-TEasy. El anlisis de la secuencia mostr un elevado porcentaje de homologa (84-94%) con otras ADNc ACC oxidasas referenciadas en bases de datos.

Palabras clave: antisentido, etileno, Psidium guajava, Transcripcin Inversa Reaccin en Cadena de la Polimerasa (TI-RCP)

ABSTRACT

Isolation and cloning of a cDNA fragment encoding ACC oxidase from ripe guava fruits by RT-PCR is shown in this report. It is the early step to apply RNA antisense technology for gene silence in order to control guava fruit ripening through genetic transformation. ACC oxidase cDNA fragment was isolated using Ready To GoTM RT-PCR Beads system and cloned into pGEMR- Teasy vector. Sequence analysis showed a high homology percent (84-94%) with other cDNA ACC oxidases reported in data base.

Key words: antisense, ethylene, Psidium guajava, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Abreviaturas: ADNc (cido desoxirribonucleico complementario), ACC oxidasa (1-aminociclopropano-1-carboxilo oxidasa), TI-RCP (transcripcin inversa y reaccin en cadena de la polimerasa), RCP (reaccin en cadena de la polimerasa), ARN (cido ribonucleico).

INTRODUCCIN

La guayaba (Psidium guajava L., Myrtaceae) originada en Amrica tropical es ampliamente cultivada en Cuba para el consumo nacional y con inters de mercado. La facilidad de su cultivo, su alto valor nutricional y la popularidad de sus productos procesados la convierten en un cultivo muy atractivo para el pas. La guayaba es un fruto climatrico, en el cual el etileno controla la velocidad de maduracin (Yueming, 2000). La rapidez con que se produce este proceso afecta la comercializacin de la fruta fresca; por lo que el manejo poscosecha es importante para reducir las prdidas por maduraciones tempranas (Mason y Botella, 1997). La dilucidacin de la ruta biosinttica del etileno ha brindado las bases para el anlisis bioqumico y gentico de la misma. La ACC oxidasa es una enzima clave en la biosntesis de etileno siendo la ltima que interviene en la sntesis del mismo (Giovannoni, 2001). Por esta razn dicha enzima se selecciona para silenciar su actividad utilizando la tecnologa del ARN antisentido unida a la transformacin gentica (Mason y Botella, 1997). El trabajo muestra por primera vez el aislamiento y la secuenciacin de un fragmento de ADNc ACC oxidasa a partir de frutos maduros de guayaba enana con la perspectiva de ser usado para el futuro control de la biosntesis de etileno en frutos de este cultivo.

Material vegetal y extraccin de cidos nucleicos

Los frutos de Guayaba Enana fueron colectados y trasladados al laboratorio dejndolos madurar completamente. Los mesocarpios fueron cortados, congelados en nitrgeno lquido y almacenados a 80C hasta que se necesitaran. El ARN total fue aislado a partir de los mesocarpios de los frutos, usando un protocolo descrito por Lpez-Gmez y Gmez-Lim (1992). El ADN genmico fue aislado a partir de hojas siguiendo el protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983)

Diseo de los Oligonucletidos y Reaccin TI-RCP

Un par de oligonucletidos degenerados fueron diseados a partir de un alineamiento realizado a 13 secuencias ADNc ACC oxidasas pertenecientes a individuos de la subclase Rosidae en el programa Clustal X. La secuencia de los oligonucletidos 5 y 3 fueron 5 AAYTGGGGHTTYTTTGAG 3 y 5 GCGNAGYTTCATRTARTCYTC 3 respectivamente. La reaccin de transcripcin inversa fue llevada a cabo utilizando el sistema Ready To GoTM RT-PCR Beads (AmershanPharmaciaBiotech), 2g de ARN total y 1.0mM de ambos oligonucletidos en un volumen total de reaccin de 50 ml. La reaccin fue realizada en un solo paso en termociclador Perkin Elmer 2400 programado con los siguientes pasos: 30min 42°C; 5min 95°C; 1min 95°C, 1min 50°C, 1min 72°C (RCP) por 32 ciclos ms una incubacin final de 7min a 72°C.

Reaccin RCP

Se realiz una reaccin adicional de RCP usando como molde una pequea porcin de la reaccin de TI-RCP. Los parmetros de la RCP fueron 2 min 95°C; 1 min 94°C, 1 min 52°C, 1min 72°C por 30 ciclos ms una extensin final a 72°C por 7 min. En el caso de la RCP sobre el ADN de la planta los parmetros fueron 5 min 94°C; 1 min 94°C, 1 min 50°C, 1min 72°C por 32 ciclos.

Clonaje y Secuenciacin

El producto de la RCP fue bien purificado sin contaminaciones de sales y otros productos usando el kit GEL Band Purification Kit (AmershamPharmaciaBiotech). La banda fue clonada en un vector pGEMR-TEasy (Promega, USA) y la seleccin de los recombinantes fue segn el criterio de colonias blancas y azules utilizando clulas competentes XL-1Blue en la transformacin. La secuenciacin se realiz sobre el mismo vector utilizando los oligonucletidos del fago M13 por el servicio de secuenciacin MWG (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany).

El mtodo de extraccin de ARN fue exitoso para el caso de los frutos de guayaba maduros, a pesar de que este protocolo nunca se haba experimentado para este cultivo. Se obtuvo un ARN total de buena calidad y con altos rendimientos, por lo tanto se tom para la reaccin de trascripcin inversa. La relacin 260/280 estuvo por encima de 1.80 lo que indic poca contaminacin con protenas. La integridad del ARN fue analizada por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante, visualizndose dos bandas correspondientes al ARN ribosomal 25 S y 18 S (Fig. 1).

Al separar los productos de la reaccin de TI-RCP en un gel de agarosa 0.8% se observ una banda intensa de aproximadamente 750 bp adems de otras amplificaciones no especficas ubicadas por encima y por debajo de dicha banda. Para aumentar la especificidad del producto, se tom una pequea porcin de la reaccin y fue reamplificada con un ligero incremento en la temperatura de apareamiento (52°C). Se obtuvo un solo producto y en la talla esperada segn el diseo de los oligonucletidos. En el caso de la RCP sobre el ADN de la planta se obtuvo una banda ligeramente por encima 1Kb, que podra indicar la posible presencia de intrones al comparase con la banda obtenida con los mismos oligonucletidos pero sobre el ARN total. La posibilidad de que esta banda pertenezca a una isoforma de la ACC oxidasa codificada en el ADN de la planta tampoco se descarta (Fig. 2) (Castellano y Vioque, 2002).

El fragmento amplificado a partir del ARN total result ser de una talla de 783 pb y su secuencia nucleotdica y aminoacdica est publicada en la base de datos GenBank con nmero de acceso AY 123201. El anlisis comparativo de secuencia realizado a travs de un Blastn (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) mostr un alto porcentaje de homologa (84-94%) con otras ADNc ACC oxidasas pertenecientes a diferentes cultivares.

Este es el primer informe de un gen homlogo ACC oxidasa expresado durante la maduracin del fruto de la guayaba.

Este trabajo fue realizado en el Instituto de Biotecnologa de las Plantas. UCLV.

REFERENCIAS

Castellano, JM y Vioque, B (2002) Characterisation of the ACC oxidase activity in transgenic auxin

overproducing tomato during ripening. Plant Growth Regulation 38(3): 203-208

Dellaporta, SL, Word, J y Hicks, JB (1983) A plant DNA minipreparation: Versin II. Plant Mol. Biol. Reporter 1: 19-21

Giovannoni, J (2001) Molecular Biology and fruit maturation and ripening. Annual Review of Plant Physilogy and Plant Molecular Biology 52: 725-749

Lpez-Gmez, R y Gmez-Lim, MA (1992) A method for extracting intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. HortScience 27(5): 440-442

Mason, MG y Botella, JR (1997) Identification and characterization of two 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate (ACC) synthase cDNAs expressed during Papaya (Carica papaya) fruit ripening. Journal Plant Physiology 24: 239-244

Yueming, J (2000) Ethylene regulation of fruit ripening: Molecular aspects. Plant Growth Regulation 30(3): 193-200



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