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Comunicación Corta Biotecnología Vegetal Vol. 10, No. 1: 57 - 61, enero - marzo, 2010
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Caracterización de cepas bacterianas aisladas de la filosfera de Musa spp. con actividad antifúngica in vitro frente a Mycosphaerella fijiensis
Ivian Poveda1,2, Mileidy Cruz-Martín1, Cynthia Sánchez-García1, Mayra Acosta-Suárez1, Michel Leiva-Mora1, Berkis Roque1, Yelenys Alvarado-Capó1* *Autor para correspondencia
1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní. km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830 e-mail: yelenys@ibp.co.cu
2 Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní. km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830
RESUMEN
El estudio de la interacción Musa Mycosphaerella fijiensis así como su interrelación con microorganismos asociados a la filosfera de Musa spp. puede contribuir al desarrollo de estrategias de mejoramiento genético para lograr resistencia más duradera y fungicidas altamente selectivos. Sin embargo, poco se conoce sobre la microbiota presente en este cultivo y su posible relación con el agente causal de la enfermedad. Teniendo en cuenta este criterio el trabajo tuvo como objetivo aislar bacterias de la filosfera de bananos y plátanos así como caracterizar aquellas que presentaron actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis. Se tomaron fragmentos de tejido con síntomas y sin síntomas de la enfermedad, de tres cultivares parcialmente resistentes y tres susceptibles. Para el aislamiento de las bacterias se empleó el método de impresión de la hoja sobre medio de cultivo sólido. El aislamiento y caracterización se realizó según las pruebas tradicionales descritas para estos fines. La actividad antifúngica in vitro se determinó por cultivo dual. Se aislaron 317 cepas bacterianas, de las cuales 20 presentaron actividad antifúngica frente a M. fijiensis. De ellas, el 80.0% provenía de tejidos con síntomas de Sigatoka negra y el 75.0% de cultivares parcialmente resistentes. Predominaron los representantes de la familia Bacillaceae. Una característica común de las cepas seleccionadas fue la presencia de pigmentos y la capacidad de degradar varios sustratos.
Palabras clave: biocontrol, interacción Musa-M. fijiensis, Sigatoka negra
ABSTRACT
The study of Musa - Mycosphaerella fijiensis interaction and their interaction with microorganisms in Musa spp. phyllosphere may contribute to the development of breeding strategies to achieve more durable resistance and highly selective fungicides. However, little is known about the microbiota present in this crop and its possible relationship to the causal agent of the disease. Then, the aimed of this research was to isolate bacterium from the phyllosphere of bananas and plantains and to characterize those with in vitro antifungal activity against M. fijiensis. Tissue samples were taken from leaves, with and without symptoms of the disease, from three partially resistant and three susceptible cultivars. The method of leaf printing on solid medium was used to isolate the bacterium. Isolation and characterization was carried out by traditional tests described for these purposes. The in vitro antifungal activity was determined by dual culture. An amount of 317 bacterial strains were isolated out of which 20 of them showed antifungal activity against M. fijiensis. The 80.0% came from tissues with symptoms of black Sigatoka and 75.0% from partially resistant cultivars. Representatives of the Bacillaceae family were predominant. A common feature of selected strains was the presence of pigments and the ability to degrade different substrates.
Key words: biocontrol, Black Sigatoka, Musa-M. fijiensis interaction
INTRODUCCIÓN
Los plátanos y bananos son afectados por la enfermedad conocida como Rayado negro de la hoja o Sigatoka negra que es causada por Mycosphaerella fijiensis Morelet. Esta se controla principalmente mediante fungicidas químicos con un alto costo anual de cerca de 350 millones de dólares para América Latina (Peláez et al., 2006).
Sin embargo, el control químico trae problemas colaterales, como son la contaminación ambiental, afectaciones a la salud humana y la aparición de cepas de M. fijiensis resistentes a los fungicidas químicos (Chin et al., 2001).
La tendencia cada vez más acentuada a disminuir los costos de producción y los niveles de residuos químicos en los productos agrícolas, el respeto por el medio ambiente y la falta de productos eficaces en muchos casos, sitúa al control biológico como una alternativa o al menos un complemento del control químico (Salazar et al., 2006). El empleo de bacterias antagonistas juega en esto un papel importante.
En este sentido se ha demostrado que la microbiota epifita puede defender a las plantas de los agentes patógenos al ejercer una acción antagónica contra estos. Varios investigadores han aislado bacterias de las partes aéreas de las plantas con el fin de utilizarlas como control biológico de muchos patógenos debido a su capacidad de producir sustancias con propiedades antifúngicas (Enya et al., 2007; Alvindia y Natsuaki, 2009).
En Musa, Osorio et al. (2004) y Salazar et al. (2006) refirieron presencia de bacterias epifitas con potencial biocontrolador contra M. fijiensis en la filosfera de plantaciones comerciales de banano y plátano en Costa Rica y en Urabá, Colombia. Además, Alvindia y Natsuaki (2009) lograron reducir significativamente la incidencia de la podredumbre de la corona en bananos aplicando, poscosecha,Bacillus amyloliquefaciens aislado del fructoplano. Estos autores demostraron así, que la microbiota nativa puede influir en el crecimiento de los patógenos y reducir las enfermedades foliares de los cultivos.
Teniendo en cuenta este criterio el trabajo tuvo como objetivo aislar bacterias de la filosfera de bananos y plátanos así como caracterizar aquellas que presentaron actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras de hojas se recolectaron de parcelas particulares cultivadas con diferentes genotipos de Musa spp. situadas en de diferentes regiones de la provincia de Villa
Clara. Estas no habían sido sometidas a la aplicación de fungicidas. Se tomaron fragmentos de tejido de la tercera y cuarta hojas, con síntomas y sin síntomas de la enfermedad, de tres cultivares parcialmente resistentes a la Sigatoka negra [(FHIA-18 (AAAB), FHIA-21 (AAAB) y Bluggoe (ABB)] y tres susceptibles [(Parecido al rey (AAA), Cavendish enano (AAA) y Cavendish gigante (AAA)].
Para el aislamiento de las bacterias de la filosfera se empleó el método de impresión de la hoja sobre medio de cultivo sólido. Para ello se utilizaron fragmentos de tejidos con síntomas (lesiones necróticas, estados 3-5 de la escala propuesta por Fouré (1985)) y sin síntomas de cada uno de los cultivares (tratamientos).Pasado el tiempo de incubación se cuantificó el número de colonias crecidas por cada tratamiento. Se compararon los resultados entre cultivares y para cada cultivar por tipo de tejido (con síntomas y sin síntomas). Los resultados se informaron como número de colonias.cm-2 de tejido.
Las colonias de bacterias que presentaban características morfológicas y culturales diferentes, se aislaron y se les determinó actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis (aislado CCIBP-Pf-83). Para ello se empleó el método de cultivo dual sobre medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) (BioCen). En un Erlermeyer con 200.0 ml de medio de cultivo PDA fundido a 40ºC se añadieron 20.0 ml de una suspensión micelial de M. fijiensis (5.0x105 fragmentos de micelio. ml-1). Se homogenizó la mezcla y se vertió en placas de Petri de 90mm de diámetro. A las 24 horas de incubación a 28ºC, se inocularon las bacterias (cultivos bacterianos de 24 horas de crecidos en medio de cultivo Agar nutriente) mediante punción (ocho aislados por placa de Petri).Como control se utilizó agua desionizada estéril en lugar del crecimiento bacteriano. Se emplearon dos réplicas por cada cepa bacteriana y se repitió dos veces.
La evaluación se realizó diariamente hasta las 96 horas mediante la observación de la presencia o no de halo de inhibición del crecimiento del patógeno alrededor del sitio de inoculación de las bacterias, lo cual se tomó como criterio de selección de las cepas bacterianas para su posterior identificación.
A las cepas bacterianas con actividad antifúngica se les realizó una caracterización morfológica, cultural y fisiológica. Para ello se llevaron a cabo observaciones microscópicas, se describieron los caracteres culturales y se determinó la respuesta a pruebas bioquímicas acorde con los protocolos descritos en el Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Krieg y Holt, 1984,1986). La identificación de las cepas se realizó hasta la categoría de familia.
El procesamiento estadístico de los datos de las variables evaluadas se realizó con el paquete estadístico Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 9.0 para Windows. Para la comparación estadística de los valores obtenidos entre cultivares fue utilizada la prueba de Kruskal-Wallis y dentro de cada cultivar entre tipo de tejido se empleó la prueba de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se observaron diferencias significativas entre todos los cultivares en cuanto al número de colonias.cm-2 aisladas de tejidos con síntomas y sin síntomas de Sigatoka negra (Figura 1).
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Solo se aislaron las bacterias cultivables que se encontraban en la superficie de las hojas. Aunque se obtuvieron colonias aisladas, el método empleado (impresión de la hoja sobre medio de cultivo sólido) no permite precisar la localización de las bacterias o afirmar que cada colonia tuvo su origen en una sola célula, por ello no es posible informar los resultados como ufc.cm-2 o células.cm-2. Se comprobó que en los cultivares susceptibles el número de colonias.cm-2 de tejido fue significativamente mayor tanto en tejido con síntomas como sin síntomas (Figura 1).
En todos los cultivares el número de colonias.cm-2 aisladas fue significativamente superior en el tejido con síntomas (Figura 2).
En este sentido, Suda et al. (2009) encontraron un incremento en la cantidad de bacterias encontradas en hojas de plantas de Pepino (Cucumis sativa) y de Bonetero del Japón (Euonymus japanicus Thunb) cuando estas presentaban enfermedades foliares como Mildium polvoriento (Podosphaera xanthii y Erysipe cichoracearum respectivamente) que en aquellas que no presentaban síntomas. Además, destacaron diferencias entre el tipo de bacterias encontradas. Según estos autores, estos cambios se deben, quizás a la secreción por parte del patógeno de metabolitos que directamente afectan la composición de las bacterias y/o que el patógeno fúngico altera las condiciones físico-químicas y fisiológicas de las hojas que influyen en la colonización y el crecimiento de las bacterias epifíticas.
Se lograron aislar de la filosfera de los cultivares de Musa utilizados, 317 cepas bacterianas con diferentes caracteres culturales. De ellas, se seleccionaron 20 con actividad antifúngica frente a M. fijiensis (CCIBP-A1, CCIBP-A2, CCIBP-A3, CCIBP-A4, CCIBP-A5, CCIBP-A6, CCIBP-B1, CCIBP-B.1, CCIBP-B2, CCIBP-B3, CCIBP-B4, CCIBP-B5, CCIBP-C1, CCIBP-C2, CCIBP-C3, CCIBP-C4, CCIBP-C5, CCIBP-C6, CCIBP-C7 y CCIBP-F.1).
El 80.0% provenía de tejidos con síntomas de Sigatoka negra y el 75.0% de cultivares parcialmente resistentes. De estos últimos, el 50.0% del cultivar Bluggoe. Esto sugiere una prevalencia de cepas con propiedades antifúngicas en lesiones de cultivares resistentes.
El hecho de encontrar 20 aislados bacterianos de la filosfera de Musa spp. con actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis indica que la microbiota epifita de este cultivo tiene potencialidades para defender a las plantas de los agentes patógenos.
Varios autores señalan que los microorganismos que pueden crecer en la filosfera pueden ser mejores candidatos de control biológico que aquellos que no pueden. Este hallazgo implica que las bacterias asociadas con hojas de bananos y plátanos pueden ser eficaces como antagonistas contra las enfermedades foliares.
Del total de cepas con actividad antifúngica (20), el 80.0% fueron Gram+ y el 20.0% fueron Gram-y predominó la morfología bacilar (95.0%); sólo un aislado presentó forma de cocos. Se identificaron tres familias. El 45.0% de las cepas seleccionadas correspondieron a la familia Bacillaceae; el 15.0% a Pseudomonadaceae; el 5.0% a Micrococcaceae y el 35.0% se agruparon como otros bacilos Gram+ no formadores de esporas.
El predominio de bacterias pertenecientes a la familia Bacillaceae puede deberse en parte a la presencia de características especiales como la formación de endosporas y la producción de sustancias con actividad antifúngica que les permiten la subsistencia y competencia en condiciones ambientales desfavorables.
El género Bacillus se describe en la literatura científica como productor de una amplia gama de compuestos con actividad antifúngica tales como: subtilina, bacilina y bacilomicina, los cuales se encuentran dentro de la familia de las iturinas (Alippi y Mónaco, 1994). Estos autores plantearon la presencia de un gran número de metabolitos antifúngicos excretados, por cepas de este género.
En este estudio se comprobó que las cepas bacterianas aisladas de la filosfera de bananos y plátanos son capaces de degradar varios sustratos diferentes. De ellas, el 20.0% hidrolizó el almidón, el 65.0% hidrolizó la caseína, el 60.0% hidrolizó la gelatina y el 35.0% produjo indol. Estas características evidencian que poseen capacidades metabólicas diversas.
Una característica común de las cepas seleccionadas fue la presencia de pigmentos (colonias de color amarillo claro, amarillo, rosado y blanco). Predominaron las colonias de color amarillo claro (75.0%). Los microorganismos epifitos están expuestos a la luz y son resistentes a los rayos solares. Las bacterias pigmentadas son un ejemplo de esto; ellas raramente son halladas en la rizosfera de la planta, se encuentran dominando la superficie de las hojas. La radiación solar directa influye en la ecología de la filosfera (Sundin y Jacobs, 1999; Jacobs y Sundin, 2001).
CONCLUSIONES
Es posible aislar bacterias de la filosfera de Musa spp. que posean actividad antifúngica frente a M. fijiensis. Los aislados se caracterizaron por pertenecer en su mayoría a la familia Bacillaceae, degradar varios sustratos y por la presencia de pigmentos. Predominaron los aislamientos de tejidos con síntomas de Sigatoka negra y de cultivares parcialmente resistentes.
REFERENCIAS
Alippi, A, Mónaco C (1994) Antagonismo in vitro de especies de Bacillus contra Sclerotium rolfsii y Fusarium solani. Revista de la Facultad de Agronomía, La Plata. 70:91-95
Alvindia, DG, Natsuaki KT (2009) Biocontrol activities of Bacillus amyloliquefaciens DGA14 isolated from banana fruit surface against banana crown rot-causing pathogens. Crop Protection. 28:236242
Chin, KM, Wirz M, Laird D (2001) Sensitivity of Mycosphaerella fijiensis from Banana to Trifloxystrobin. Plant Dis. 85:1264-1270
Enya J, Shinohara H, Yoshida S, Tsukiboshi T, Negishi H, Suyama K, Tsushima S (2007) Culturable Leaf-Associated Bacteria on Tomato Plants and Their Potential as Biological Control Agents. Microbial Ecology 53: 524536
Fouré, E (1985) Black leaf Streak Disease of Bananas and Plantains (Mycosphaerella fijiensis Morelet), Study of the symptoms and stages of the disease in Gabon. IRFA-CIRAD, París
Jacobs, JL, Sundin GW (2001) Effect of Solar UV-B Radiation on a Phyllosfhere Bacterial Community. Appl. Environ. Microbiol. 67(12):5488-5496
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