Vol.10, No.2, 2010.pmd 
Artículo Científico                                                                               Biotecnología Vegetal Vol. 10, No. 2: 113 - 119, abril - junio, 2010
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) 
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)

 

Efecto del estado físico del medio de cultivo y el número de subcultivos en la fase de multiplicación in vitro de plantas de Bambusa vulgaris var. vulgaris. Schrad. ex Wendl.

Y. García-Ramírez*, M. Freire-Seijo, Blanca Rosa Pérez, Ortelio Hurtado. *Autor para correspondencia

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central ‘Marta Abreu’ de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5 Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830 e-mail: yudith@ibp.co.cu

RESUMEN

Bambusa vulgaris var. vulgaris Schard. ex Wendl. es una especie multipropósito de rápido crecimiento y proporciona beneficios a los cultivos agrícolas y ha sido empleada en plantaciones y sistemas agroforestales. Su propagación in vitro se ha efectuado a través de organogénesis a partir de yemas axilares. Sin embargo, los bajos coeficientes de multiplicación y la presencia de fenoles han sido elementos que han afectado la multiplicación in vitro en varias especies de bambúes. Este trabajo se realizó con el objetivo de determinar el efecto del estado físico del medio de cultivo y el número de subcultivo en la fase de multiplicación in vitro de plantas de B. vulgaris var. vulgaris. Para ello se empleó un medio de cultivo compuesto por las sales MS, mio-inositol (100 mg l-1), sacarosa (30 g l-1) y 6-BAP (6.0 mg l-1) en estado líquido y en estado semisólido (2.5 g l-1 de Gelrite). Se cuantificó el número de brotes por planta y el número de hojas expandidas por cada explante, además se midió la altura de la planta principal desde la base hasta el punto de inserción de la primera hoja. Los resultados demostraron que el estado físico del medio de cultivo influyó en la multiplicación in vitro de B. vulgaris var. vulgaris. El mayor coeficiente de multiplicación (3.0) se logró después de cinco subcultivos de multiplicación en medio de cultivo en estado líquido.

Palabras clave: bambú, coeficiente de multiplicación, organogénesis, yemas axilares

ABSTRACT

Bambusa vulgaris var. vulgaris. Scharde ex Wendl. is a fast growing multi-species which provides benefits to agricultural crops. It has been used in plantations and agroforestry systems. In vitro propagation of this species has been made by organogenesis from shoot tip. However, the low rates of multiplication and the presence of phenols have affected the in vitro multiplication in several species of bamboo. This work was carried out to determine the effect of the culture medium physical state and the number of subcultures in the in vitro multiplication of B. vulgaris plants var. vulgaris. A medium composed of MS salts, myo-inositol (100 mg l-1), sucrose (30 g l-1) and 6-BAP (6.0 mg l-1) in liquid and semisolid (2.5 g l-1 Gelrite) was used. The number of shoots per plant and the number of expanded leaves per explants were quantified. The height of the main plant was also measured from the base to the point of insertion of the first leaf. Results showed that the physical state of the culture medium had influence on in vitro multiplication of B. vulgaris var. vulgaris. The highest multiplication coefficient (3.0) was achieved after five subcultures of multiplication in liquid culture medium.

Key words: axillary buds, bamboo, multiplication coefficient, organogenesis

INTRODUCCIÓN

El estado físico de los medios de cultivo constituye un aspecto importante para el cultivo in vitro. Autores como Bag et al. (2000) han señalado el efecto positivo del medio de cultivo en estado líquido sobre la multiplicación in vitro de varias especies de bambúes.

Sin embargo, aún persisten serias limitantes que afectan la propagación in vitro de Bambusa vulgaris var. vulgaris tales como los bajos coeficientes de multiplicación y la presencia de fenoles (Mishraa et al., 2007).

Para elevar los coeficientes de multiplicación en esta especie se han estudiado y puesto en práctica diferentes alternativas. Varios autores han evaluado la influencia del número de subcultivos y el manejo de los explantes en cada subcultivo (Yashodha et al., 2007). También se ha hecho referencia a la posibilidad de emplear medio de cultivo líquido tal y como fue descrito en la especie Pseudoxynanthera stocksii por Sanjaya et al. (2005).

Por todo lo anterior, la presente investigación tuvo como objetivo determinar el efecto del estado físico del medio de cultivo y el número de subcultivos en la fase de multiplicación in vitro de plantas de Bambusa vulgaris var. vulgaris.

MATERIALES Y MÉTODOS

Como material vegetal, se emplearon brotes establecidos (20 días de cultivo, 6.0 cm de altura) a partir de yemas axilares según lo descrito por García-Ramírez et al. (2007) para Bambusa vulgaris var. vittata (Figura 1).

El medio de cultivo estuvo compuesto por las sales inorgánicas propuestas por Murashige y Skoog (1962) (MS), mio-inositol (100 mg l-1), sacarosa (30 g l-1) y 6-BAP (6.0 mg l-1). Se establecieron dos tratamientos: el medio de cultivo estado líquido y en estado semisólido, al cual se le agregaron 2.5 g l-1 de Gelrite® (SIGMA).

Los frascos de cultivo empleados en cada tratamiento fueron Erlenmeyers (250 ml de volumen). A cada uno se le adicionaron 50 ml de medio de cultivo y en cada frasco se colocaron cinco explantes (se consideró como explante un brote individual o con hasta dos brotes nuevos). Los frascos de cultivo se colocaron en cámaras de crecimiento a 26±2.0°C y luz solar (38.0-45.7 μM m-2 s-1).

A los 20 días de cultivo (subcultivo) se cuantificó el número de brotes por planta y el número de hojas expandidas por cada explante. Además, se midió la altura de la planta principal (cm) desde la base hasta el punto de inserción de la primera hoja.

Posteriormente, se realizaron cinco subcultivos de multiplicación. Para ello, se colocaron las plantas en grupos de a tres, sin individualizar (Figura 2). Al final de cada subcultivo (cada 20 días) se calculó el coeficiente de multiplicación (CM) con la siguiente fórmula: CM= Número de plantas totales (grupos de a tres) por frasco / número de plantas inicial (grupos de a tres) por frasco.

Los valores obtenidos fueron analizados mediante una prueba de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El estado físico del medio de cultivo influyó en la multiplicación in vitro de B. vulgaris. Durante la multiplicación en medio de cultivo líquido, se observó la formación de nuevos brotes a partir de la segunda semana de cultivo. Sin embargo, en el medio de cultivo semisólido se retardó la emisión de nuevos brotes, estos no fueron visibles hasta después de 17 días de cultivo.

Cuando se empleó el medio de cultivo líquido la emisión de nuevos brotes se favoreció, se formaron 4.60 brotes por cada planta, mientras que al emplear medio de cultivo semisólido solamente se formó como promedio un brote por planta (Figura 3). Estos valores difirieron significativamente (p<0.05, según la prueba de Mann-Whitney).

Sin embargo, el estado físico del medio de cultivo no provocó diferencias significativas entre los tratamientos cuando se analizaron las variables: altura de las plantas, que varió de 5.8 a 5.9 cm y el número de hojas expandidas, que osciló entre 1.9 y 2.0.

Desde el punto de vista cualitativo se pudieron apreciar diferencias en cuanto al color de los brotes. Los brotes desarrollados en medio de cultivo líquido mostraban una coloración verde-intensa. Sin embargo, los brotes formados en medio de cultivo semisólido fueron de color verde claro.

La baja emisión de brotes en el medio de cultivo semisólido pudiera deberse a múltiples causas, una de ellas puede ser la presencia de fenoles en la zona de la base de las plantas. Autores como Nadgauda et al. (1997) describieron el crecimiento lento de las plantas pudiera estar asociado a la acumulación de fenoles en la base de las plantas in vitro de B. arundinacea. Estos mismos autores atribuyeron el crecimiento lento a las barreras físicas que impone el estado semisólido del medio de cultivo.

Resultados similares fueron informados por Ndiaye et al. (2006) para B. vulgaris var. vittata y Eiman et al. (2008) para Oxytenanthera abyssinica. Estos autores compararon los valores de formación de brotes obtenidos en medio de cultivo líquido y semisólido. Ellos demostraron que el estado físico del medio de cultivo influyó en la formación de brotes y mencionaron que los valores de este indicador fueron inferiores significativamente en las plantas cultivadas en medio de cultivo semisólido.

Un gran número de artículos científicos relacionados con la multiplicación in vitro de los bambúes hacen referencia al empleo del medio de cultivo líquido durante esta fase, debido a los efectos positivos sobre el incremento del número de brotes por planta y en el coeficiente de multiplicación en varias especies (Arya et al., 2001). En el medio de cultivo en estado líquido las plantas se encuentran parcialmente sumergidos, lo que propicia una mejor absorción de los nutrientes y por ende un mayor crecimiento y desarrollo del explante (Sandal et al., 2001). Además, aumenta la difusión gaseosa dentro y fuera de las células del tejido y el crecimiento se hace más rápido (George et al., 2008).

Autores como Mishra et al. (2007) en B. tulda; Shirin y Rana (2007) en B. glaucescens; Ramanayake et al. (2008) en B. atra, D. giganteus y Dendrocalamus hookeri; Sayanika y Sharma (2009) en Arundinaria callosa y Rajneesh y Hyamal (2009) en D. hamiltonii, han corroborado el incremento del número de brotes por planta al emplear medio de cultivo líquido.

Los resultados demostraron que el medio de cultivo líquido favoreció la emisión de nuevos brotes lo que se relaciona directamente con el incremento en el coeficiente de multiplicación y finalmente en el número de plantas para ser transferidas a fase de enraizamiento.

Es importante señalar, además, que las plantas en medio de cultivo semisólido no sobrevivieron a los siguientes subcultivos. Se observó que los brotes morían una vez que estos eran transferidos a un segundo subcultivo, por ello solo se muestran los resultados en medio de cultivo líquido.

Se comprobó que el número de subcultivos influyó sobre el coeficiente de multiplicación de B. vulgaris. Este se incrementó a medida que se aumentó el número de subcultivos. En el quinto subcultivo de multiplicación se obtuvo un coeficiente de multiplicación de 3.0 (Figura 4).

No se observaron diferencias fenotípicas entre las plantas en los diferentes subcultivos. Además, no fueron visibles síntomas de hiperhidricidad a pesar de que todos los subcultivos se realizaron en medio de cultivo líquido y que esta es una especie leñosa. De manera general, las plantas in vitro mantuvieron una coloración verde intenso, característico de B. vulgaris (Figura 5).

Otros investigadores también han constatado un incremento del coeficiente de multiplicación con el número de subcultivos. Por ejemplo, Ramanyake et al. (2006) en B. vulgaris var. vittata al extender el número de subcultivos hasta el noveno. Por su parte, Mishra et al. (2007) y Shirin y Rana (2007) alcanzaron un coeficiente de multiplicación de 3.2 y 4.0 al quinto subcultivo de multiplicación in vitro de B. tulda y B. glaucescens, respectivamente. Igualmente, Ramanayake et al. (2008) en B. atra, D. giganteus y D. hookeri informaron coeficientes de multiplicación de 3.0 y 4.2 al sexto subcultivo de multiplicación in vitro. Los valores antes referidos son cercanos a los obtenidos en el presente trabajo para B. vulgaris.

El empleo de medios de cultivo líquidos permitió que las yemas axilares presentes en los tallos de las plantas brotaran al ponerse en contacto directo con el medio de cultivo. Este aspecto influyó en el incremento del coeficiente de multiplicación, principalmente a partir del tercer subcultivo de multiplicación. La brotación de estas yemas se tuvo en cuenta para el manejo de las plantas in vitro durante los subcultivos (Figura 3).

Al respecto, Saxena (1990) señaló que los bajos coeficientes de multiplicación constituyen una de las principales limitantes para la multiplicación in vitro de bambúes, lo cual puede estar relacionado con el manejo del explante, los reguladores de crecimiento y el estado físico del medio de cultivo. Muchos artículos científicos hacen referencia a la forma en la que deben ser subcultivados los explantes de bambú, todos coinciden en mantener pequeños grupos de plantas al momento de transferirlas. Dicho método contribuye al incremento de los coeficientes de multiplicación y evita la muerte de las plantas (Saxena, 1990; Prutpongse y Gavinlertvatana, 1992; Ramanayake y Yakandawala, 1997; Ravikumar et al., 1998; Ramanayake et al., 2001). Específicamente para Guadua angustifolia, Jiménez et al. (2006) obtuvieron incrementos en el coeficiente de multiplicación al dividir las plantas en grupos de tres durante la multiplicación in vitro.

Autores como Sood et al. (1992) y Ramanayake et al. (2001) señalaron la importancia del manejo de las plantas para el incremento del coeficiente de multiplicación, ya que se ha demostrado en la mayoría de especies de bambúes la muerte de las plantas una vez que estas se individualizan en el momento del subcultivo. Yasodha et al. (2007) incrementaron el coeficiente de multiplicación, al dividir las plantas de B. nutans en grupos de tres y cuatro en medio de cultivo en estado líquido durante la multiplicación in vitro de esta especie. Al igual que Dutta y Borthakur (2009) para B. balcooa aumentaron su coeficiente de multiplicación a 4.0 al emplear medio de cultivo líquido.

CONCLUSIONES

Los resultados demostraron que durante la fase de multiplicación in vitro de B. vulgaris puede ser empleado el medio de cultivo líquido para la multiplicación de las plantas. También se puede afirmar que hasta el quinto subcultivo de multiplicación se producen incrementos en el coeficiente de multiplicación.

Lograr el incremento en el coeficiente de multiplicación en plantas de B. vulgaris var. vulgaris a través del estudio de la influencia del estado físico del medio de cultivo y el número de subcultivos, resulta de gran interés ya que, además, permite obtener explantes de óptima calidad, para la posterior fase de enraizamiento in vitro. Esto le permite dar solución a unas de las principales problemáticas que afectan la propagación in vitro en varias especies de bambúes.

REFERENCIAS

Arshad, S, Kumar A, Bhatnagar S (2005) Micropropagation of Bambusa wamin through proliferation of mature nodal explants. J. Biol. Res. 3: 59-66

Arya, I, Satsangi R, Arya S (2001) Rapid micropropagation of edible bamboo Dendrocalamus asper. J. Sus. For. 14: 103–114

Bag, N, Chandra S, Palni L, Nandi S (2000) Micropropagation of Dev-ringal [Thamnocalamus spathiflorus (Trin.) Munro] – a temperate bamboo, and comparison between in vitro propagated plants and seedlings. Plant Sci. 156: 125–135

Cátasus, L (2003) Estudio de los bambúes arborescentes cultivados en Cuba. ACTAF. La Habana

Christanty, L, Kimmins J, Mailly D (1997) Without bamboo, the land dies’:a conceptual model of the biogeochemical role of bamboo in an Indonesian agroforestry system. Forest Ecol. Manag. 91: 83–91

Das, M, Pal A (2005) In vitro regeneration of Bambusa balcooa Roxb.: factors affecting changes of morphogenetic competence in the axillary buds. Plant Cell Tissue Organ Cult 81:109–112

Dutta, M, Borthakur M (2009) In vitro micropropagation of Bambusa balcooa Roxb. through nodal explants from field-grown culms and scope for upscaling. Current Science 96 (7): 962-966

Eiman, E, Diab E, Syadat E (2008) In vitro morphogenesis and plant regeneration of bamboos (Oxytenanthera abyssinica A. Rich. Munro). Int. J. Sustain. Crop Prod. 6: 72-79

George, E, Somerset M, Kingdom U, Hall M, Klerk G (2008) Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition. Volume 1, pp. 115-283. United Kingdom

Gielis, J, Oprins J (2002) Micropropagation of temperate and tropical woody bamboos from biotechnological dream to commercial reality. En: Bamboo for sustainable development. Proceedings of the Vth International Bamboo Congress and the VIth International Bamboo Workshop, pp. 333–344. San José, Costa Rica.

Jiménez, V, Castillo J, Tavares E, Guevara E, Montiel M (2006) In vitro propagation of the neotropical giant bamboo, Guadua angustifolia Kunth, through axillary shoot proliferation. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 86: 389–395

Lin, C, Lin C, Chang W (2004) Effect of thidiazuron on vegetative tissue-derived somatic embryogenesis and owering of bamboo Bambusa edulis. Plant Cell Tiss Org Cult 76: 75–82

Mishraa, Y, Kumar P, Suman Y, Shirina F, Ansar S (2007) A micropropagation system for cloning of Bambusa tulda Roxb. Scientia Horticulturae 115: 315-318

Nadgauda, R, John C, Parasharami V, Joshi M, Mascarenhas A (1997) A comparison of in vitro with in vivo flowering in bamboo: Bambusa arundinacea. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 48:181-188

Ndiaye, A, Mamadou S, Niang D, Gassama-Dia Y (2006) In vitro regeneration of adult trees of Bambusa vulgaris. African Journal of Biotechnology 5 (13): 1245-1248

Prutpongse, P, Gavinlertvatana P (1992) In vitro propagation of 54 species from 15 genera of bamboo. Hort. Sci. 27: 453–454

Rajneesh, A, Hyamal N (2009) In vitro shoot cut: a high frequency multiplication and rooting method in the bamboo Dendrocalamus hamiltonii. Biotechnology 8 (2): 259-263

Ramanayake, S, Yakandawala K (1997) Micropropagation of the giant bamboo ( Dendrocalamus giganteus Munro) from nodal explants of field grown culms. Plant Sci. 129: 213–223

Ramanayake, S, Maddegoda K, Vitharana M, Chaturani G (2008) Root induction in three species of bamboo with different rooting abilities. Scientia Horticulturae 118: 270-273

Ramanayake, S, Meemaduma, V, Weerawardene T (2006) In vitro shoot proliferation and enhancement of rooting for the large-scale propagation of yellow bamboo (Bambusa vulgaris ‘Striata’). Sci. Hort. 110: 109–113

Ramanayake, S, Wanniarachchi W, Tennakoon T (2001) Axillary shoot proliferation and in vitro owering in an adult giant bamboo, Dendrocalamus giganteus Wall. Ex Munro. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 37: 667–671

Ravikumar, R, Ananthakrishnan G, Kathiravan K, Ganapathi A (1998) In vitro shoot propagation of Dendrocalamus strictus Nees. Plant Cell Tiss Org Cult 52: 189–192

Sandal I, Bhattacharya A, Ahuja P (2001) An efficient liquid culture system for tea shoots proliferation. Plant Cell Tissue Organ Cult. 65: 75-80

Sanjaya, T, Ravishankar R (2005) Micropropagation of Pseudoxynanthera stocksii Munro. In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 41: 333-337

Saxena, S (1990) In vitro propagation of the bamboo (Bambusa tulda Roxb.) through shoot proliferation. Plant Cell Rep. 9: 431–434

Sayanika, W, Sharma G (2009) In vitro propagation of Arundinaria callosa Munro. An edible bamboo from nodal explants of mature plants. The Open Plant Science Journal 3: 35-39

Shirin, F, Rana P (2007) In vitro plantlet regeneration from nodal explants of eld-grown culms in Bambusa glaucescens Willd. Plant Biotechnology Reports 1: 141-147

Sood, A, Ahuja P, Sharma O, Godbole S (2002) In vitro protocols and eld performance of elites of an important bamboo Dendrocalmus hamiltonii Nees et Arn. Ex Munro. Plant Cell Tiss Org Cult 71: 55–63

Sood, A, Sharma O, Palni L (1992) Improved methods of propagation of Maggar bamboo (Dendrocalamus hamiltonii Nees et Arn. ex Munro) using single node cuttings taken from juvenile culms of elite seedlings. J Am Bamboo Soc 9:17–24

Yasodha, R, Kamala S, Kumar A, Kumar D, Kalaiarasi K (2007) Effect of glucose on in vitro rooting of mature plants of Bambusa nutans. Scientia Horticulturae 116: 113-116



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