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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 10, No. 2: 121 - 128, abril - junio, 2010
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Efecto de la orientación y la longitud del cotiledón inmaduro sobre la formación de embriones somáticos en dos genotipos cubanos de soya
I. Bermúdez-Caraballoso1*, T. Del Socorro Blanco 2, J. Pérez-Pérez 3, L. R. García1, N. Veitía1, R. Collado1, D. Torres1, C. Romero1, B. Roque1 *Autor para correspondencia
1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5. 5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: idalmis@ibp.co.cu
2Escuela de Ingeniería Agroindustrial, Instituto Universitario de la Paz. Carretera a Bucaramanga km 15. Barrancabermeja, Colombia
3 Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Universidad de Granma. Carretera vía Manzanillo, km17.5, Peralejo, Bayamo, Granma, Cuba. CP 85 100
RESUMEN
En el cultivo de la soya la identificación de genotipos apropiados para la embriogénesis somática resulta de gran importancia para su posterior aplicación en programas de mejoramiento genético. Con el objetivo de determinar el efecto de la orientación y la longitud del cotiledón inmaduro sobre la formación de embriones somáticos de dos genotipos cubanos de soya (Incasoy-24 e Incasoy-35) se realizó la siguiente investigación. Se evaluaron dos orientaciones: abaxial y adaxial, así como cinco longitudes del cotiledón inmaduro: 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 y 6.0 mm. Se incluyó como control el genotipo Williams-82. Los resultados demostraron que la orientación y la longitud del cotiledón inmaduro fueron determinantes en el número de embriones somáticos que se formaron en los genotipos cubanos evaluados. Con la orientación abaxial se obtuvo el mayor número de embriones somáticos por cotiledón. La mayor respuesta embriogénica se alcanzó cuando se emplearon cotiledones inmaduros de 4.0 mm de longitud. Estos resultados proporcionan información básica para investigaciones posteriores en este cultivo.
Palabras clave: embriogénesis somática, orientación abaxial, regeneración
ABSTRACT
Identification of the suitable genotype for somatic embryogenesis in soybean culture is very important for further application in Genetic Improvement Programs. The objective of the investigation was to determine the effect of the orientation and length of immature cotyledons in the formation of somatic embryos of two Cuban soybean genotypes (Incasoy-24 and Incasoy-35). The genotype Williams-82 was included as control. Two orientations were evaluated: abaxial and adaxial, as well as five lengths of the immature cotyledons: 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 and 6.0 mm. Results demonstrated that the orientation and seed size are determinant in the number of somatic embryos formed in the Cuban genotypes evaluated. The highest values of somatic embryos per cotyledon were obtained in abaxial orientation. The highest embryogenic response was achieved using cotyledons of 4.0 mm length. These results provided basic information for further researches in this crop.
Keywords: abaxial orientation, regeneration, somatic embryogenesis
INTRODUCCIÓN
La soya [Glycine max (L.) Merril] es uno de los cultivos más importantes del mundo por el alto contenido de proteína y de aceite en sus semillas, potencialmente útiles para emplearlas con fines alimentarios o industriales (Nishizawa e Ishimoto, 2009; FAO, 2009).
Debido a la importancia económica del cultivo, los esfuerzos en las investigaciones se han orientado al mejoramiento de las variedades con el fin de incrementar la calidad de las semillas, su adaptación a las condiciones edafoclimáticas adversas, su resistencia a plagas y enfermedades y la tolerancia a la aplicación de herbicidas (Yang et al., 2009). En tal sentido, a nivel mundial se emplean tanto métodos tradicionales como herramientas biotecnológicas para el mejoramiento genético (Schmidt et al., 2005).
En Cuba, se han empleado métodos de mejoramiento genético tales como: inducción de mutaciones e hibridación natural para la obtención de nuevos genotipos de soya, entre los cuales se encuentran Incasoy-1, Incasoy-24, Incasoy-27 e Incasoy-35 (Ortíz et al., 2005; Ponce et al., 2003).
La transformación genética como vía de mejoramiento de este cultivo, cobra cada día mayor relevancia y su éxito se relaciona directamente con la eficiencia del sistema de regeneración empleado para la obtención de plantas transformadas. Dentro de los sistemas de regeneración de plantas conocidos, la embriogénesis somática ha sido uno de los más empleados en soya (Parrott et al., 1989; Ko et al., 2003; Schmidt et al., 2005), debido a que las plantas obtenidas por esta vía son más uniformes genéticamente y a que mediante el establecimiento de cultivos embriogénicos proliferativos se puede obtener gran cantidad de material vegetal útil, como blanco para la transformación (Parrot et al., 1989; Meng et al., 2007; Kita et al., 2007).
No obstante, uno de los factores limitantes para la regeneración de plantas por esta vía, es su condición genotipo-dependiente (Parrott et al., 1989; Hiraga et al., 2007), lo cual impide el empleo directo de los protocolos ya existentes.
De esta manera, la identificación de genotipos apropiados para la embriogénesis somática, así como el conocimiento de su interacción con los factores físico-químicos que la determinan resulta de gran importancia.
Teniendo en cuenta los antecedentes anteriormente planteados, el presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de la orientación y la longitud del cotiledón inmaduro sobre la formación de embriones somáticos de dos genotipos cubanos de soya.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se emplearon los genotipos cubanos de soya, IS-24 e IS-35. Como control se utilizó el genotipo Williams-82, en consideración a que se ha probado en los protocolos empleados como referencia en este estudio (Bailey et al., 1993; Saymolov et al., 1998). Las semillas de todos los genotipos fueron aportadas por el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas de Cuba (INCA).
Las plantas donantes se cultivaron en bolsas de polietileno en casa de cultivo del Instituto de Biotecnología de las Plantas. El sustrato estuvo compuesto por 25% de zeolita y 75% de materia orgánica. Se realizaron dos riegos al día, cada uno con una duración de cinco minutos. El tiempo transcurrido desde la antesis hasta que la semilla alcanzó la longitud requerida en cada uno de los experimentos se determinó marcando, de manera aleatoria y a partir del momento de la antesis, botones florales en varias plantas dentro de cada genotipo. La longitud de la semilla se midió por su eje plano con una escala milimetrada acoplada al ocular del microscopio estereoscopio (OLYMPUS).
Como explante para el inicio del proceso de embriogénesis somática se emplearon cotiledones inmaduros provenientes de semillas de vainas cosechadas entre 12 y 15 días después de la antesis. Las vainas se lavaron con una solución de agua y detergente comercial, luego se desinfectaron sumergiéndolas en alcohol al 70% (v/v) durante 20 segundos, seguido de una segunda desinfección en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 3.0 % (v/v) y seis gotas de Tween-20 durante diez minutos. Al término de este tiempo, y en cámara de flujo laminar, se enjuagaron seis veces con agua destilada estéril. Las semillas inmaduras fueron separadas de las vainas y el extremo donde se encontraba el eje embrionario fue cortado y descartado. Los dos cotiledones fueron obtenidos ejerciendo una presión suave en el extremo contrario al corte (Lazzeri et al., 1985).
Efecto de la orientación del cotiledón inmaduro sobre el medio de cultivo
Se tomaron cotiledones inmaduros (4.0 y 5.0 mm) los que fueron colocados por el lado abaxial y adaxial sobre el medio de cultivo semisólido para la inducción de embriones somáticos MSD40 (Bailey et al., 1993; Saymolov et al., 1998). Este tenía en su composición sales MS (Murashige y Skoog, 1962), vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), 3% de sacarosa, 40 mg l-1 de ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) y 2 g l-1 de Gelrite® (SIGMA). El pH se ajustó a 7.0 (Santarém et al., 1997) antes de la esterilización. En este experimento se establecieron dos tratamientos según la orientación del cotiledón inmaduro en los dos genotipos cubanos y el control (Williams-82), con diseño completo al azar. Cada tratamiento tuvo cinco réplicas, cada una con cuatro explantes.
Los frascos fueron incubados en cámaras de crecimiento con fotoperíodo 16/8 horas luz/ oscuridad, 26±2°C e intensidad luminosa de 5-10 μE m-2 s-1 según lo propuesto por Lazzeri et al. (1987), provista por lámparas fluorescentes. A los 30 días de cultivo se cuantificó el número de cotiledones inmaduros con respuesta embriogénica y el número de embriones somáticos formados por cotiledón.
Se realizó una descripción del proceso de formación de los embriones somáticos respaldado por un análisis histológico. Para ello, se tomaron muestras de tejido de los cotiledones inmaduros a los nueve y doce días de cultivo. Se fijaron en FAA (formaldehído 37%, ácido acético 100%, etanol 70%, en una proporción 5:5:90). Luego fueron deshidratados en un gradiente ascendente de etanol y embebidas en cera de parafina. Posteriormente se realizaron cortes de 10 μm de grosor con un micrótomo rotatorio (Zeiss), se fijaron en portaobjetos y se tiñeron con safranina al 0.5%. Las secciones histológicas de las diferentes muestras se examinaron en microscopio óptico (AXIOSKOP) y las imágenes fueron captadas con una cámara digital (OLYMPUS DP70) acoplada al microscopio.
Influencia de la longitud del cotiledón inmaduro
Se emplearon cotiledones inmaduros provenientes de semillas de 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 y 6.0 mm de longitud. Los cotiledones fueron colocados sobre el medio de cultivo MSD40 según la orientación en la cual se logró el mayor número de embriones somáticos en dependencia del genotipo de acuerdo con los resultados obtenidos anteriormente. En este experimento se establecieron cinco tratamientos según la longitud del cotiledón inmaduro y en cada genotipo cubano y el control. Cada tratamiento tuvo cinco réplicas, cada una con cuatro explantes, con diseño completamente al azar.
Los frascos fueron colocados en cámaras de crecimiento con fotoperíodo 16/8 horas luz/oscuridad, 26±2°C e intensidad luminosa de 5-10 μE m-2 s-1 provista por lámparas fluorescentes.
A los 30 días de cultivo se cuantificó el número de cotiledones inmaduros con respuesta embriogénica y el número de embriones somáticos por cotiledón inmaduro.
Análisis estadístico
Para el procesamiento de los datos se usó el programa estadístico Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 16.0 sobre Windows. La comparación de los datos relacionados con el efecto de la orientación del explante en el número de cotiledones inmaduros con respuesta embriogénica y el número de embriones somáticos por cotiledón inmaduro, se realizó mediante la prueba de Mann- Whitney. Para la comparación de los datos en la variable longitud de la semilla se realizó una prueba de Kruskall Wallis. En todos los casos se realizó una comprobación previa de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de la orientación del cotiledón inmaduro sobre el medio de cultivo
Se determinó que la orientación del cotiledón inmaduro sobre el medio de cultivo influyó en el valor promedio de embriones somáticos formados en los genotipos cubanos IS-24 e IS-35. En el genotipo IS-24 el valor de porcentaje obtenido en la orientación abaxial difirió significativamente del alcanzado en la orientación adaxial (Figura 1).
Por su parte, en los genotipos IS-35 y el Williams-82 (Control) no se encontraron diferencias significativas en la respuesta embriogénica a los 30 días de cultivo en las dos orientaciones estudiadas.
Al analizar el número promedio de embriones somáticos por explante se encontraron diferencias significativas entre los genotipos, en las dos orientaciones estudiadas. En los genotipos cubanos IS-24 e IS-35 los mayores valores promedios se alcanzaron cuando el cotiledón inmaduro se orientó de manera abaxial sobre el medio de cultivo. Resultados similares mostró el genotipo control Williams-82 (Figura 2).
En los dos genotipos cubanos de soya estudiados se observó que la embriogénesis somática se inició directamente sobre la superficie de los cotiledones inmaduros. Las primeras estructuras embriogénicas fueron visibles a partir de los siete días después del establecimiento en el genotipo Williams-82 y entre los 9 y 11 días, en los genotipos cubanos IS-24 e IS-35, respectivamente.
Con la orientación abaxial, los embriones somáticos se formaron en el centro y en el borde del explante, tanto en los genotipos cubanos como en el control (Figura 3 A, B y C) y en la orientación adaxial se formaron con mayor frecuencia en los bordes del cotiledón en los genotipos evaluados (Figura 3 D). Independientemente de la orientación del cotiledón inmaduro sobre el medio de cultivo, los embriones somáticos se formaron sobre el tejido necrosado y su tamaño varió en dependencia del genotipo: menores de 1.0 mm de longitud en IS-24 e IS-35 y entre 2.0 y 3.0 mm en el genotipo Williams-82.
Lazzeri et al. (1985), publicaron por primera vez el empleo de cotiledones inmaduros para la inducción y formación de embriones somáticos en soya, desde entonces ha sido considerado como el único explante adecuado para regenerar plantas, vía embriogénesis somática (Finer y Nagasawa, 1988; Bailey et al., 1993; Ko y Korban, 2004; Hiraga et al., 2007). El efecto de la orientación del cotiledón inmaduro sobre el medio de cultivo, ha sido estudiado por varios autores en esta especie (Hepher et al., 1988; Hartweck et al., 1988; Griga, 1993; Santarém et al., 1997; Ko y Korban, 2004).
En las secciones histológicas tomadas de tejidos con nueve días de cultivo se observó una proliferación de tejido con células proembriogénicas ubicado cerca de la epidermis de los cotiledones inmaduros en las dos orientaciones estudiadas, aunque en mayor proporción cuando el cotiledón se orientó por el lado abaxial (Figura 3 E y F). La sección histológica correspondiente al tejido embriogénico a los 12 días de cultivo, permitió confirmar que en los genotipos cubanos de soya la embriogénesis somática fue directa, ya que se observa la continuidad de la epidermis entre el tejido materno y el embrión somático globular (Figura 3 G). Esta característica coincide con lo descrito por Aparecida et al. (2002) en un estudio sobre la caracterización anatómica de la embriogénesis somática de un genotipo brasilero de soya y el genotipo Williams-82.
Los resultados del presente estudio indicaron que la orientación fue determinante en el número de embriones somáticos que se formaron en los genotipos cubanos evaluados. De esta manera, con la orientación abaxial se obtuvieron los mayores valores del número de embriones somáticos por cotiledón. Estos resultados fueron similares a los descritos por Santarém et al. (1997), cuando evaluaron el efecto de la orientación del cotiledón inmaduro en cuatro genotipos de soya americanos. Sin embargo, difieren de los obtenidos por Ko y Korban (2004) quienes encontraron una mejor respuesta embriogénica cuando el cotiledón se orientó por el lado adaxial sobre el medio de cultivo, en genotipos de soya americanos.
La influencia de la orientación del cotiledón en la respuesta embriogénica, pudiera estar dada por las diferencias estructurales y fisiológicas de las células y los tejidos que existen en el lado abaxial y adaxial del cotiledón, las cuales determina en última instancia, el transporte de auxinas y por tanto, el proceso embriogénico (Griga, 1993; Aparecida et al., 2002). Hepher et al. (1988) y Ziv y Chen (2008), sugirieron que el potencial embriogénico de un tejido está relacionado con su papel activo en el transporte de nutrientes. Estos autores plantearon que varios tejidos embriogénicos (nucela, escutelo, sinérgidas y la epidermis abaxial de los cotiledones de soya) tienen esta capacidad.
Influencia de la longitud del cotiledón inmaduro
La longitud del cotiledón inmaduro influyó en la respuesta embriogénica de los genotipos cubanos de soya IS-24 e IS-35. El mayor porcentaje de cotiledones inmaduros con respuesta embriogénica se logró con 3.0, 4.0 y 5.0 mm de longitud en los dos genotipos cubanos y el control. Los porcentajes más bajos se presentaron con 2.0 y 6.0 mm en todos los genotipos evaluados (Figura 4).
Al analizar el número de embriones somáticos formados por cotiledón inmaduro se encontró que el genotipo IS-35 alcanzó los mayores valores con una longitud de 4.0 mm con diferencia significativa con las otras longitudes evaluadas. Resultados similares se encontraron en el genotipo Williams-82. Por su parte, en el genotipo IS-24 no se presentaron diferencias significativas en el número de embriones somáticos por cotiledón cuando se emplearon tamaños de 4.0 y 5.0 mm de longitud. Estos resultados difirieron significativamente con los valores obtenidos en los cotiledones de longitudes de 2.0, 3.0 y 6.0 mm. Los dos genotipos cubanos evaluados lograron la mayor respuesta embriogénica cuando se emplearon cotiledones de 4.0 y 5.0 mm para IS-24 y 4.0 mm de longitud para IS-35 (Figura 5).
La embriogénesis somática está asociada predominantemente a la existencia de células competentes en el explante inicial, ya que estas pueden dar lugar a embriones somáticos directamente o después de varios ciclos mitóticos, en dependencia del estado fisiológico del explante y del genotipo (Parrot et al., 1989). inmaduros para la inducción de la embriogénesis somática directa, debido a la existencia de meristemos organizados en este tipo de explante, razón por la cual el tamaño del cotiledón es considerado uno de los factores limitantes de este proceso morfogénico (Lazzeri et al., 1985; Gaj, 2004; Yang et al., 2009).
Resultados similares a los obtenidos en la presente investigación fueron descritos por Yang et al. (2009) en genotipos chinos de soya, donde la mayor respuesta embriogénica se logró cuando los cotiledones procedían de semillas de 4.0 a 5.0 mm de longitud; y la menor respuesta con longitudes menores de 3.0 y mayores de 6.0 mm.
De igual forma, al evaluar la respuesta embriogénica en cotiledones inmaduros procedentes de semillas de longitudes entre 1.5 y 8.5 mm en genotipos de soya americanos, Lazzeri et al. (1985), concluyeron que los cotiledones tomados a partir de semillas entre 4.0±1.0 mm proveían el tejido más apropiado para la inducción embriogénica, ya que en estas longitudes de semillas se formaron la mayor cantidad de embriones somáticos.
Igualmente, a partir del estudio de los factores determinantes en la embriogénesis somática de genotipos coreanos de soya, Kim et al. (2004), encontraron una relación directamente proporcional entre el tamaño óptimo del cotiledón y el tamaño final de la semilla madura con la respuesta embriogénica. Estos autores observaron que en los genotipos en los cuales la semilla madura era de tamaño pequeño, la mayor formación de embriones somáticos se presentó cuando los cotiledones provenían de semillas de 3.0 mm de longitud y en los genotipos en los cuales la semilla madura era de tamaño grande, la mayor respuesta embriogénica se relacionó con cotiledones provenientes de semillas de 4.0 mm. Al igual que en el presente estudio, estos autores obtuvieron los menores valores en formación de embriones somáticos cuando emplearon cotiledones de semillas menores de 3.0 mm y mayores a 5.0 mm.
La capacidad embriogénica, según Gaj (2004), está restringida a un corto periodo de tiempo dentro del desarrollo del tejido empleado como explante. En estudios sobre embriogénesis somática en Arabidopsis thaliana, este autor encontró una relación inversa entre la capacidad embriogénica y el grado de madurez del embrión cigótico. Por ello concluyeron que el grado de madurez no sólo influye en la cantidad de embriones somáticos formados sino también en el tipo de embriogénesis inducida. De esta forma, cuando empleó embriones cigóticos maduros, observó que los embriones somáticos se formaron directamente sobre el explante, es decir, la embriogénesis era directa; mientras que, cuando empleó embriones cigóticos inmaduros frecuentemente se formó un callo embriogénico, o sea, se indujo embriogénesis somática indirecta.
CONCLUSIONES
En el presente trabajo se concluyó que la orientación y la longitud del cotiledón inmaduro tuvieron efecto en la respuesta embriogénica en los dos genotipos cubanos de soya (Incasoy-24 e Incasoy-35) y el control Williams-82. El mayor número de embriones somáticos se obtuvo con la orientación abaxial y longitud del cotiledón inmaduro de 4.0 mm, en los genotipos estudiados. Estos resultados proporcionan información básica para investigaciones posteriores.
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