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Protocolo Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 1: 27 - 32, enero - marzo, 2009
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Protocolo para la selección in vitro de plantas de papa resistentes al filtrado de cultivo de Alternaria solani Sor.
Novisel Veitía*, Lourdes R. García, Idalmis Bermúdez-Caraballoso, Mayra Acosta-Suárez, Michel Leiva-Mora, Yelenys Alvarado-Capó, Dámaris Torres, Yenny Padrón. *Autor para correspondencia.
Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP), Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830. e-mail: novisel@ibp.co.cu
RESUMEN
El empleo del filtrado del cultivo de Alternaria solani en la diferenciación de genotipos de papa susceptibles y resistentes ha sido descrito en la literatura científica. Sin embargo, existen pocos trabajos donde se tengan en cuenta el papel de los aislados de A. solani y otros factores que inciden en la obtención del filtrado del cultivo para emplear la selección in vitro como una herramienta que le permita a los fitomejoradores reducir el tiempo de obtención de nuevas variedades de papa. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer un protocolo para la selección in vitro de plantas de papa resistentes al tizón temprano con el empleo del filtrado del cultivo de Alternaria solani Sor., en apoyo al Programa de Mejoramiento genético en el cultivo de la papa. El protocolo propuesto relaciona los aspectos: obtención del filtrado del cultivo, características de los aislados de A. solani y del material vegetal así como, la escala descriptiva de evaluación del efecto del filtrado de cultivo sobre plantas de papa (Solanum tuberosum L.) var. Desirée. Puede ser utilizado como una herramienta útil en ensayos en fase temprana para evaluar la resistencia a A. solani en genotipos de papa obtenidos por cualquier método de mejoramiento genético a esta enfermedad, lo cual contribuye a incrementar la eficiencia de la selección en las condiciones ex vitro ya que disminuye el número de individuos a evaluar bajo condiciones donde inciden otros factores que dificultan la diferenciación de genotipos susceptibles y resistentes.
Palabras clave: Desirée, programa de mejoramiento, tizón temprano
ABSTRACT
The use of culture filtrate of Alternaria solani in the differentiation of susceptible and resistant potato genotypes has been described in scientific literature. However, few researches take into account the role of isolates of A. solani and other factors affecting the production of culture filtrate to use in vitro selection as a tool. This allows plant breeders to reduce the time to obtained new varieties of potato. This study aimed to establish a protocol for in vitro selection of potato plants resistant to early blight with the use of culture filtrate of Alternaria solani Sor, in support to the potato Genetic Improvement Program. The proposed protocol related aspects such as: obtaining of culture filtrate, characteristics of A. solani isolates and plant material, as well as, the descriptive scale for assessing the effect of culture filtrate on potato plants (Solanum tuberosum L.) var. Desirée. The protocol can be used as a useful tool in early stage trials to evaluate the resistance to A. solani in potato genotypes obtained by any method of genetic improvement to this disease. This contributes to increased efficiency of selection in natural conditions. The number of individuals to evaluate in field decreases. In these conditions other factors affect the differentiation of susceptible and resistant genotypes.
Keywords: Desirée, breeding program, early blight
INTRODUCCIÓN
El tizón temprano causado por el hongo Alternaria solani es después del tizón tardío, la enfermedad foliar más importante del cultivo de papa (van der Waals et al., 2003). Se presenta con mayor incidencia en las zonas paperas ubicadas en regiones húmedas y cálidas de países como India, Uruguay, Brasil y otros del Caribe. En Cuba, el tizón temprano se ha considerado como una enfermedad fúngica importante y se ha encontrado variabilidad genética y patogénica entre aislados procedentes de diferentes localidades del país (Pérez et al., 2004).
Para el control de tizón temprano se han descrito medidas tales como prácticas culturales, aplicación de fungicidas y el uso de variedades resistentes (Torres, 2002).En las condiciones de Cuba, Castellanos (2000), elaboró y validó un Sistema de Manejo Integrado para el tizón temprano en la papa, conformado por medidas preventivas y curativas. Las preventivas, que incluyeron el saneamiento y la resistencia varietal. Las medidas curativas se concentran en el uso y manejo de fungicidas.
En la práctica, el control químico es el más efectivo, pero encarece considerablemente los costos de producción y trae consigo la contaminación ambiental. El control de la enfermedad por la vía de la resistencia genética es el método más deseado, ya que contar con variedades resistentes reduciría el número de aplicaciones de fungicidas y por tanto los costos de producción. Sin embargo, no se cuenta entre las variedades comerciales con genotipos con resistencia a esta enfermedad (Cassells y Kowalski, 1998).
El mejoramiento genético clásico en el cultivo de la papa para incrementar resistencia a enfermedades fúngicas, el rendimiento y la calidad industrial, ha jugado un papel preponderante como estrategia para generar nuevas variedades. No obstante, el abrumador crecimiento de la población mundial y el dinámico desarrollo de las plagas y enfermedades, han hecho que durante los últimos años, se haya considerado la importancia de integrar a los esquemas clásicos de investigación, técnicas modernas y métodos de la biotecnología como el cultivo de tejidos, la selección in vitro a factores bióticos y abióticos, la ingeniería genética y los marcadores moleculares, con la finalidad de acelerar el mejoramiento genético de la papa y contar con variedades sobresalientes (Ligarreto, 2001).
Los trabajos científicos donde se emplea el cultivo de tejidos y la selección in vitro, como una alternativa en la obtención de variedades resistentes a enfermedades, se han incrementado. Esto se debe al avance en los estudios tanto de los procesos de la planta y la biología de los patógenos como del entendimiento de las interacciones planta-patógeno (Pérez, 1998). Por otro lado, desde el punta de vista práctico la utilización de la toxina o el filtrado del cultivo de hongos, elimina uno de los problemas encontrados cuando se trabaja con el patógeno in vivo como agente selectivo, los cultivos de células pueden ser expuesto fácil y uniformente al agente selectivo, ya que estos pueden ser incorporados a los medios de cultivo (Kosky, 1998).
Es conocido que A. solani, produce toxinas no hospedero específicas tanto in vivo como en medios de cultivo, de las cuales han identificado 12. Entre estas, se encuentran: el ácido alternárico, solanapironas A, B y C que son capaces de inducir puntos necróticos similares a los causados por el tizón temprano (Chaerani y Voorrips, 2006). Es por ello, que varios autores han descrito la utilización del filtrado de cultivo en la diferenciación de genotipos de papa susceptibles y resistentes al tizón temprano (Lynch et al., 1991; Hernández et al., 1991; Martínez y Mantell, 1994). Sin embargo, en la literatura científica consultada relacionada con el empleo de los filtrados de A. solani sobre plantas de papa no se describen protocolos que detallen la obtención y aplicación de los filtrados de cultivo de dicho hongo fitopatógeno para su empleo como agente selectivo en la búsqueda de plantas con resistencia al tizón temprano en apoyo a los programas de mejoramiento genético de papa que se desarrollan en el país.
El presente trabajo tuvo como objetivo proponer un protocolo para la selección in vitro de plantas de papa resistentes al filtrado de cultivo de A. solani.
DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
Teniendo en cuenta los resultados científicos descritos por Veitía et al. (2001) relacionados con los objetivos del Programa de mejoramiento genético, para la obtención de plantas de papa con resistencia al tizón temprano que se desarrolla en el Instituto de Biotecnología de las Plantas, se estableció un protocolo para la selección in vitro de plantas de papa var. Desirée con el empleo del filtrado de cultivo de Alternaria solani, el cual se describe a continuación.
Material biológico
Se utilizarán aislados de Alternaria solani caracterizados en base a las características culturales, morfológicas y los más agresivos en ensayos de patogenicidad en casa de cultivo. Los aislamientos se deben realizar de campos comerciales de papa en zonas productoras del país.
Para la selección in vitro se utilizarán plantas de papa del genotipo de interés cultivadas in vitro así como, plantas de papa (Solanum tuberosum L.) variedad Desirée, susceptible al tizón temprano (Lorenzo et al., 1992) y la especie silvestre de papa (Solanum chacoense BIT) tipo Pi275136 perteneciente a la serie Glabrescantia Buk con resistencia en campo a la enfermedad (Estévez et al., 1993). Ambos genotipos de respuesta conocida frente al filtrado del cultivo de A. solani (Veitía et al., 2001).
La propagación in vitro de las plantas de papa se realizará mediante la metodología propuesta por Espinosa et al. (1992). Se utilizarán plantas in vitro con no menos de 8.0 cm de altura, y al menos cinco yemas axilares sin contar la yema del explante original (segmento de tallo de aproximadamente 1.0 cm con una yema axilar) y abundantes raíces.
Materiales de trabajo y equipos necesarios
1- Agua desionizada estéril
2- Asa de inoculación para hongos
3- Balanza técnica
4- Cabina de flujo laminar
5- Enlermeyers 500 ml
6- Espátula de Drigalski
7- Filtro millipore de 0.22 μm
8- Horadador de 10 mm de diámetro
9- Incubadoras
10- Mechero
11- Microscópio óptico
12- Papel de filtro (Whatman No 4)
13- Placas de Petri (9 cm de diámetro)
14- Pipet Boy
15- Phmetro
16- Rotoevaporador
17- Tubos de ensayo 15x20 mm
18- Vasos de precipitado de 1 000 ml estériles
Medios de cultivo y soluciones
Medio de cultivo Caldo papa dextrosa (PDB, Duchefa) (Extracto de papa 4g; dextrosa 20g; H2O 1 000 ml; pH =5.6).
Medio de cultivo Agar papa dextrosa (PDA, Difco)
(bacto dextrosa 20g; bacto agar 15g; H2O 1 000 ml; pH = 5.6).
Medio de cultivo Richard: nitrato de potasio (10.0 g.l-1), dihidrogenofosfato de potasio (5.0 g.l-1), sulfato de magnesio heptahidratado (2.5 g .l-1), cloruro de hierro (III) (0.02 g.l-1) y sacarosa (50.0 g.l-1). H2O 1 000 ml; pH = 5.6.
Alcohol (70%) (v/v)
Precauciones y medidas de seguridad
Es conocido que Alternaria solani es potencialmente patógeno para la salud humana, es por ello que se recomienda: utilizar guantes, batas sanitarias, tapaboca y todos los medios de protección necesarios para su manipulación.
Obtención del filtrado de cultivo
Siembra en medio de cultivo sólido
A partir de un tubo de ensayo que contenga el aislado de A. solani, tomar el inóculo con la aguja de siembra e inocular en placas de Petri de 9.0 cm de diámetro que contenga 15 ml de medio de cultivo Agar papa dextrosa (PDA). Seguidamente incubar en cámaras climáticas a 26±2o C y oscuridad constante según Izquierdo (1979). La colonia que crezca en las placas de Petri debe mantener las características culturales de la cepa inoculada.
Inoculación en medio de cultivo líquido
Una vez crecido el hongo en las placas de Petri, se procederá a la inoculación en el medio de cultivo Richard (Martínez y Mantell, 1994). Para ello, se tomará un disco de micelio de 1.0 cm de diámetro de la zona de crecimiento del micelio de la placa y se inoculará en Erlenmeyers de 500 ml que contendrán 100 ml de medio de cultivo Richard (Figura 1). Los erlenmeyers se incubarán por un período de 30 días a 28oC en condiciones de cultivo estático y oscuridad constante.
Cosecha del cultivo del hongo
Separar el estroma del medio de cultivo que contiene los metabolitos producido por el hongo con ayuda de un tamiz y filtrar el cultivo a través de papel de filtro Whatman No. 4 (Whatman, Clifton, NY USA) (Figura 2).
Una vez realizada la filtración se determinará al filtrado del cultivo de A. solani :
Masa seca del micelio (el micelio se secará en estufa a 65o C hasta que el peso se mantenga constante, para lo cual se utilizará una balanza técnica).
pH
Determinación del contenido de azúcares reductores en el medio de cultivo (ICIDCA, 1974).
Rotoevaporación del filtrado del cultivo
Con el objetivo de concentrar 10 veces el volumen inicial del filtrado del cultivo se rotoevaporará al vacío a 40oC con un rotoevaporador (Heidolph, Bioblock) a una presión en la unidad de control no menor de 28mbar y una temperatura en el baño María de 50oC, lo cual se comprobará con la ayuda de un termómetro.
Esterilización
Se realizará por filtración y para ello se empleará un filtro de 0.22 μm (Millipore). Antes de la esterilización debe filtrarse mediante un filtro de porcelana para eliminar posibles restos de micelio.
Selección in vitro
Dilución del filtrado del cultivo
Preparar una dilución 1:3 v/v del filtrado del cultivo concentrado con agua destilada estéril.
Aplicación del filtrado del cultivo
Se realizará por inmersión de raíces según lo descrito por Hernández et al. (1991). Las plantas in vitro se colocarán en tubos de ensayo de 15.0x20.0 mm, que contendrán 4.0 ml del filtrado del cultivo. Una planta por tubo de ensayo.
Incubación de las plantas
Una vez aplicado el filtrado del cultivo las plantas se colocaran en cámaras de cultivo a 22 ±2oC y luz artificial con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) de 62 μE.m-2 .s-1, el fotoperíodo será de 16 horas luz, durante 72 horas hasta la evaluación de las afectaciones.
Evaluación
Las plantas se dividirán en tres zonas (Figura 2). La zona apical comprenderá una yema axilar y el ápice de la planta. La zona media incluirá dos yemas axilares y la inferior el resto de las yemas axilares del tallo de la planta. Como criterio de selección se empleará el siguiente: serán seleccionadas las plantas que muestren grados de afectación menor o igual a tres de acuerdo con la escala de evaluación in vitro propuesta por Veitía et al. (2001) (Tabla 1).
Las plantas que se ajusten al criterio de selección serán multiplicadas in vitro y posteriormente se llevarán a condiciones ex vitro para determinar su respuesta a la enfermedad en condiciones de inoculación artificial y con fuente de inóculo natural. Para ello se regirán por el protocolo descrito por Leiva-Mora et al. (2006).
Factores a tener en cuenta para la aplicación del protocolo de selección in vitro
Selección del aislado de A. solani para la producción del filtrado del cultivo
Se debe evaluar la fitotoxicidad del filtrado del cultivo de cada uno de los aislados más agresivos. Se partirá de la dilución 1:1(v:v) (Filtrado del cultivo concentrado: agua destilada estéril). Se empleará para la producción del filtrado del cultivo el aislado que provoque los mayores valores en el grado de afectación según la escala de evaluación in vitro descrita anteriormente sobre el genotipo de papa susceptible (Desirée) y el resistente (S. chacoense).
Conservación y mantenimiento de aislados de A. solani
Para la conservación de los aislados de A. solani se
utilizarán dos métodos:
a) Conservación por transferencia periódica.
Se inoculará un fragmento de micelio del aislado de
A. solani en tubos de ensayos (150 x 20mm) que
Dextrosa. Se incubarán a 28ºC y oscuridad constante durante 14 días. Cada tubo será marcado y posteriormente se conservará a 4ºC.
b) Conservación en aceite mineral a temperatura ambiente.
Se inoculará un fragmento de micelio frascos de vidrio de 5 ml de volumen o tubos de ensayo que contendrán medio de cultivo Agar Papa y Dextrosa. Se incubarán a 28º C y oscuridad constante por 14 días. Después de crecidos, se les adicionará aceite mineral previamente esterilizado hasta cubrir totalmente el crecimiento micelial.
Con los métodos de conservación descritos anteriormente en el Instituto de Biotecnología de las plantas se ha conservado gran parte de la colección de cultivos microbianos del laboratorio de Fitopatología. Los aislados de A. solani han sido conservados por más de 10 años y estos han mantenido sus características morfológicas y culturales así como los filtrados de cultivos obtenidos a partir de estos aislados han sido fitotóxicos sobre plantas de papa de la var. Desirée y de la especie silvestres S. chacoense tipo Pi 275136 cultivadas in vitro.
Culminación del ensayo
Una vez concluida la última evaluación se procederá a desmontar el experimento. El material vegetal así como los restos de filtrado de cultivo de A. solani serán esterilizados en autoclave y eliminados.
CONSIDERACIONES FINALES
El protocolo descrito unido al informado por Leiva-Mora et al. (2006) para diferenciar genotipos de papa mediante la inoculación artificial de homogeneizados miceliales de Alternaria solani Sor. en cantero y campo, constituye una herramienta útil en ensayos en fase temprana para evaluar la resistencia a A. solani en genotipos de papa obtenidos por cualquier método de mejoramiento genético.
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