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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 1: 41 - 45, enero - marzo, 2009
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Efecto del cultivo in vitro en el perfil metabólico de Psidium guajava L.
Alina Capote1, Naivy Pérez-Alonso1, Anabel Pérez1, Dirk Wilken2, André Gerth2, Lutz Müller-Kuhrt3, Elio Jiménez1
1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba, CP 54 830
2BioPlanta GmbH, Leipzig, Germany
3AnalytiCon Discoveries GmbH, Potsdam, Germany
RESUMEN
El uso de las técnicas de cultivo in vitro para la producción de metabolitos secundarios de interés farmacéutico se ha incrementado ampliamente. El cultivo de órganos representa una alternativa interesante para la identificación de nuevos compuestos o para incrementar la producción de compuestos ya conocidos que sean de utilidad para la humanidad. El presente trabajo tuvo como objetivo producir in vitro biomasa de Psidium guajava mediante el cultivo de brotes y determinar el efecto del cultivo in vitro en el perfil metabólico de esta especie.Se comprobó que el contenido de agua fue mayor en el material vegetal obtenido en el cultivo de brotes in vitro con relación a las muestras obtenidas de plantas cultivadas en campo. Los rendimientos de los extractos resultaron mayores en los brotes cultivados in vitro. En esta especie los perfiles de expresión entre muestras de hojas de plantas en campo y brotes in vitro fueron distintos, siendo mayor la gama de compuestos obtenidos en el cultivo de brotes. Se detectaron 23 nuevos compuestos. Este es el primer trabajo que muestra el perfil metabólico de Psidium guajava en brotes cultivados in vitro demostrando que el cultivo in vitro es una fuente potencial para la identificación y producción de nuevos compuestos.
Palabras clave: cultivo de órganos, espectrometría de masa, guayaba, metabolitos secundarios
ABSTRACT
The use of in vitro techniques for the production of secondary metabolites in the pharmaceutical industry has increased widely. The organ culture is one of the alternatives for the identification of new compounds or to increase the production of already known compound useful for the humanity. The aim of this work was to produce biomass of Psidium guajava L var EEA18-40 using shoot culture and to determine the effect of the in vitro culture in the metabolic profile of this spicies. Water content was higher in the plant material obtained in the shoots cultured in vitro compared to samples collected from plants grown in field. Yields of extracts were greater in shoots cultured in vitro. Expression profiles among leaves samples of plants grown in field were different in this species, obtaining a higher rate in the shoots culture.A number of 23 new compounds was detected . This is the first work that shows the metabolic profile of Psidium guajava in shoots cultured in vitro. It was demonstrated that the in vitro culture is a potential source for identification and production of new compounds.
Key words: guava, mass spectrometry, organs culture, secondary metabolites
INTRODUCCIÓN
Los metabolitos secundarios de plantas debido a su gran actividad biológica se usan a través de siglos en la medicina natural y tradicional (Bourgaud et al., 2001). Aproximadamente, 50 000 compuestos diferentes han sido encontrados en las plantas y se estima que en el futuro este valor supere los 200 000 (Fiehn et al., 2000).
Diversas propiedades medicinales se le atribuyen a la guayaba (Psidium guajava L.), entre ellas, como antibiótica, astringente, desinflamante, expectorante, sedante y sudorífica. Además, contiene valores extraordinarios de vitamina A, ácido ascórbico, azúcares, taninos, flavonoides y fibras (Laguado et al., 1998; Pérez et al., 2008). Igualmente, ha despertado gran interés en el fortalecimiento del sistema inmunológico por su contenido en vitamina C (Suntornsuk, 2002).
Los extractos de frutas y ramas verdes se usan para neutralizar el efecto de las diarreas. En general, se le ha atribuido un efecto significativo en la disminución de las enfermedades gastrointestinales (Wei, 2000; Mitchell y Ahmad, 2006a,b). Según Arima (2002) las ramas tiernas debilitan el desarrollo bacteriano que altera el tracto intestinal. Otra ventaja de los componentes de la guayaba es el fortalecimiento del sistema cardiovascular (Yamashiro et al., 2003).
No obstante, la calidad y la cantidad de los compuestos obtenidos a partir de plantas colectadas en ambientes naturales son muy variables y están influenciadas por condiciones ambientales tales como el clima, la época del año y el suelo. Adicionalmente, las afectaciones por enfermedades o plagas y la aplicación de pesticidas reduce la calidad de los compuestos obtenidos (Bhojwani y Razdan, 1996). Sin embargo, el cultivo in vitro permite independizar la producción de metabolitos de estos factores externos y disponer de condiciones controladas en el proceso de producción y extracción. Además, posibilita la obtención de nuevos compuestos no presentes en la planta madre (Massot et al., 2000).
La deducción del contexto biológico en que una planta dada produce determinados compuestos, a partir de datos obtenidos por la medición de las concentraciones de metabolitos, requiere de una estrategia que integre la extracción óptima de la muestra, separación, detección, identificación del metabolito y cuantificación de estos con gran fiabilidad. Técnicas analíticas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la espectrometría de masa se utilizan para la detección e identificación de compuestos en mezclas orgánicas y permiten el descubrimiento de más y más moléculas y el estudio de compuestos naturales (Verpoorte y Alfermann, 2000; Weekwerth et al., 2004; Le Gall et al., 2005; Peters et al., 2009).
El presente trabajo tuvo como objetivo producir in vitro biomasa de Psidium guajava mediante el cultivo de brotes y determinar el efecto del cultivo in vitro en el perfil metabólico de esta especie.
MATERIALES Y MÉTODOS
Producción de biomasa in vitro
Para la producción de la biomasa in vitro de la especie en estudio se siguió el protocolo propuesto por Caballero (2001) para el establecimiento y la multiplicación de brotes en medio de cultivo semisólido.
Se emplearon como explantes iniciales segmentos nodales de plantas crecidas en casa de cultivo.
Para la fase de establecimiento se utilizó el medio de cultivo compuesto por las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) (MS), 0.5 mg.l-1 de tiamina, 100 mg.l-1 de mio-inositol, 1.0 mg.l-1 de 6-Bencilaminopurina (6-BAP) y 3.0% de sacarosa.
Los explantes se multiplicaron en un medio de cultivo compuesto por las sales MS, 0.5 mg.l-1 de tiamina, 100 mg.l-1 de mio-inositol, 2.0 mg.l-1 de 6-Bencilaminopurina (6-BAP), 3.0% de sacarosa y Agar (SIGMA) a razón de 7.0 g.l-1. Se colocaron 10 explantes por frasco de cultivo de 250 ml de capacidad con 30 ml de medio de cultivo. Los subcultivos se realizaron cada 28 días.
El material vegetal en fase de establecimiento y multiplicación se colocó en cámaras de crecimiento con luz solar con una intensidad luminosa de aproximadamente 100-125μmol.m-2.s-1 y 26±2ºC. Se colectaron hojas de las plantas en tercer y cuarto subcultivo hasta obtener 10g de masa fresca.
Obtención de biomasa de plantas crecidas en campo
Se seleccionaron plantas de seis años de cultivo en campo para la toma de las muestras. Estas procedieron de la Estación Experimental Pedro Lantigua ubicada en el municipio de Remedios, perteneciente al Instituto de Biotecnología de las Plantas, a las cuales se le realizaron atenciones culturales según Instructivo técnico de la guayaba (MINAGRI, 1985).
De las plantas cultivadas en campo se colectaron hojas de ramas jóvenes hasta alcanzar 10g de masa fresca.
Determinación del contenido de agua
A las muestras provenientes de las plantas en campo y del cultivo in vitro se les determinó la masa fresca y seca. Para esto último se sometieron a un proceso de secado en estufa a 40ºC hasta lograr un peso constante (g). Además, se determinó el contenido de agua mediante la fórmula siguiente:
CA (%) = PF-PS x 100
PF Donde:
CA- contenido de agua PF- masa fresca (g) PS- masa seca (g)
Análisis del contenido de metabolitos
Las muestras secadas en estufa se maceraron mediante el empleo de un mortero y posteriormente se empaquetaron en sobres de papel y se conservaron a temperatura ambiente hasta su análisis.
La determinación de metabolitos secundarios en las distintas muestras se realizó en la compañía AnalytiCon (Potsdam, Alemania), mediante técnicas de cromatografía líquida y espectrometría de masa (HPLC-ESI-MS) según los protocolos establecidos.
Los extractos de las muestras de material vegetal cultivado in vitro y en campo se obtuvieron a partir de 1.5 g de masa seca. Se utilizó como tampón de extracción éter metil terbutil/metanol (MTB-Ether/ Metanol) y posteriormente 10mg.ml-1 del extracto se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). Las muestras se inyectaron automáticamente y se separaron utilizando una columna de fase reversa (C18, Phenomenex, USA) y un gradiente de 5 a 50% de acetonitrilo. Los compuestos eluidos de la columna se detectaron mediante un detector de diodo (Diode Array Detector) a 210-600nm. La masa molecular se determinó por espectrometría de masa en modo de ionización por nebulización eléctrica (Electro spray ionization).
Se realizó la comparación de la masa molar relativa del compuesto detectado con un base de datos que contiene cerca de 12 000 sustancias de plantas (MEGABOLITE ®). Posteriormente se determinaron los grupos químicos a los que pertenecen la mayoría de las sustancias encontradas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación del contenido de agua
En la biomasa obtenida se pudo comprobar que el contenido de agua fue mayor en el material vegetal obtenido mediante el cultivo in vitro de brotes 82.1% en relación con las muestras de plantas cultivadas en campo (40%). Por consiguiente, la relación masa fresca y masa seca en las plantas cultivadas in vitro fue mayor (5.6). Esto se debe a que el ambiente in vitro se caracteriza por presentar una alta humedad relativa (HR) que provoca la saturación de la atmósfera interna del frasco de cultivo y esto trae aparejado malformaciones a nivel de tejido como la carencia de la capa epicuticular de cera en la epidermis y por consiguiente un incremento del contenido de agua en los tejidos (Piqueras y Debergh, 1999).
Se plantea que el ambiente in vitro difiere del ambiente ex vitro en el cual se desarrollan las plantas normalmente, es por eso que frecuentemente se observan cambios fisiológicos y morfológicos en las plantas (Ziv, 1999).
Adicionalmente, la intensidad y calidad de la luz son diferentes (Miyashita et al., 1996; Piqueras y Debergh, 1999), lo cual tiene una influencia fuerte en el desarrollo morfológico. La presencia de sales, reguladores del crecimiento y fuentes de carbono en el medio de cultivo condiciona el crecimiento heterotrófico o mixotrófico de los tejidos (Nguyen y Kozai, 1998; Kozai, 1999).
Se conoce que la producción de metabolitos secundarios no es uniforme en todas las partes de la planta y en la mayoría de los casos se produce en un órgano o tejido específico, de ahí la importancia de poder cultivar y producir biomasa de estos tejidos como fuente para la purificación de metabolitos de interés (Verpoorte y Alfermann, 2000).
Análisis del contenido de metabolitos
En los extractos obtenidos el rendimiento fue siempre mayor en las muestras procedentes del cultivo de brotes en comparación con las muestras de plantas cultivadas en campo, como se muestra en la tabla 1.
Los mayores rendimientos en el proceso de extracción de la biomasa producida in vitro pudieran estar asociados a las condiciones controladas en que se desarrolla el proceso, lo cual trae consigo una mayor homogeneidad y calidad del material vegetal.
Una de las grandes ventajas del cultivo in vitro sobre el cultivo en campo es que se pueden obtener sustancias de gran utilidad (metabolitos secundarios) en condiciones controladas independientemente de cambios climáticos, condiciones de suelo y libres de patógenos. Además, es posible reducir los costos e incrementar la productividad mediante el control automatizado del crecimiento celular y la regulación de los procesos metabólicos, contar con un sistema de producción definido, calidad uniforme y rendimiento constante del producto, así como la posibilidad de establecer sistemas estrictos de control de la calidad, para disponer de un producto independiente de los cambios ambientales (Morgan y Shanks, 2000; Vanisree y Tsay, 2004).
Las diferencias observadas en los perfiles pueden explicarse por las distintas fases de desarrollo y organización de tejido entre estos tipos de muestras, lo que implica una regulación diferencial de la expresión génica y por consiguiente diferencias en los compuestos identificados.
Al realizar una comparación individual de cada uno de los compuestos detectados en estas muestras con la base de datos MEGABOLITE ® se observaron diferencias en cuanto a la presencia y concentración de los compuestos identificados y no identificados. Los compuestos identificados son aquellos que, basados en los tiempos de retención y datos de masa molecular, mostraron similitud con compuestos en la base de datos. Los compuestos no identificados son aquellos donde no se encontró coincidencia con la base de datos.
El número de compuestos detectados (identificados y no identificados) en las muestras de las hojas de plantas en campo fue superior al de las hojas de brotes cultivados in vitro.
En las muestras de hojas de plantas en campo, se encontraron entre los compuestos identificados flavonas tales como: miricitrina, catechina y prunina. Esta última es de todo este grupo la que se encontró en mayor concentración (348.6mg/ 10g). Otros compuestos encontrados fueron flavonoides con equidad en la masa molar y en la concentración. Estos aparecieron en menor concentración que las flavonas. Se observó que varios de los compuestos no identificados eran isómeros de los compuestos identificados (catechina, esteposido, piracantosido, myricitrina, prunina) ya que coinciden en el tiempo de retención y en equidad molar.
En las muestras de hojas de brotes cultivados in vitro se aislaron 23 nuevos compuestos que no se encontraron en las hojas de plantas en campo. Los compuestos identificados pertenecen al grupo de los triterpenos, saponinas y ácidos.
La mayoría de los compuestos identificados en muestras de brotes cultivados in vitro y en las hojas de plantas en campo son sustancias antioxidantes y pudieran tener un efecto en el fortalecimiento del sistema inmunológico y disminuir el riesgo de tumores malignos (Jiménez, 2001; Suntornsuk, 2002).
Autores como Dicosmo y Misawa (1995), Wilken et al. (2003) han hecho mención a las diferencias existentes en el perfil de los compuestos aislados en el material vegetal cultivados in vitro respecto a las plantas cultivadas en campo en diversas especies de plantas y señalan que este resultado es debido a alteraciones en la parte funcional de genes que ocurren debido a la exposición de estímulos químicos y físicos, por lo que el cultivo de tejidos de plantas producen compuestos que no son encontrados en plantas intactas, lo que representa una alternativa para investigar nuevas sustancias.
Los compuestos que se detectaron y no fue posible identificar constituyen una fuente importante de nuevas moléculas con posible función biológica.
Estos resultados reafirman la hipótesis de que el cultivo in vitro es una fuente potencial para la identificación y producción de nuevos compuestos.
CONCLUSIONES
Se comprobó que el cultivo in vitro influye en el perfil metabólico Psidium guajava. Los perfiles de expresión entre muestras de hojas de plantas cultivadas en condiciones de campo y hojas de brotes cultivados in vitro fueron distintos. En estas últimas se identificaron nuevos compuestos que no fue posible identificar en muestras de planta en condiciones de campo y que constituyen una fuente importante de nuevas moléculas con posible función biológica de aplicación en la industria farmacéutica.
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