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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2: 99 - 103, abril - junio, 2009
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Micobiota de plantas donadoras y hongos filamentosos contaminantes del establecimiento in vitro de cinco especies forestales
M. Acosta-Suárez, Y. Alvarado-Capó, M. Cruz-Martín, M. Leiva-Mora, C. Sánchez-García, Berkis Roque, E. Quiala, Maité Chávez, F. Jiménez-Terry, Mariana la O, R. Barbón, R. Collado, Mayelín Rodríguez, M. De Feria, Ivan Borroto, Martha Pérez *Autor para correspondencia
Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830 e-mail: mayra@ibp.co.cu
RESUMEN
A pesar de que se han desarrollado protocolos para propagar un gran número de especies forestales por cultivo in vitro, la contaminación fúngica de los explantes constituye uno de los problemas fundamentales que limita su aplicación. Los objetivos de este trabajo fueron identificar la micobiota de plantas donadoras y los hongos filamentosos contaminantes del establecimiento in vitro de explantes de cinco especies forestales (caoba, teca, majagua, pino y cedro). De plantas donadoras se tomaron explantes que se colocaron en cámara húmeda. Se realizaron preparaciones directas al microscopio óptico del crecimiento fúngico, se aislaron e identificaron los géneros presentes. Además, se aislaron e identificaron los hongos filamentosos contaminantes de la fase de establecimiento. Se identificaron 11 géneros fúngicos presentes en las plantas donadoras y 20 como contaminantes del establecimiento in vitro. Botryodiplodia, Cephalosporium, Diplodia, Dreschlera, Geotrichum, Gloeosporium Helminthosporium, Memnoniella, Oidiodendron y Rhinoclediella aparecieron solamente durante la fase de establecimiento, mientras que Alternaria, Aspergillus, Cercospora, Curvularia, Cladosporium, Colletotricum, Fusarium, Nigrospora, Penicillium y Pestalotia se detectaron en plantas donadoras y durante la fase de establecimiento, lo que indicó que el explante inicial fue la posible fuente de contaminación. Los géneros más frecuentes fueron Botryodiplodia en teca, Nigrospora en majagua y Alternaria en pino, cedro y caoba. A partir de estos resultados se elaboró un plan de defensa fitosanitario para plantas donadoras que incluyó fungicidas sistémicos y de contacto cuyo espectro de acción cubría los géneros de hongos identificados.
Palabras clave: caoba, cedro, contaminación microbiana, majagua, micropropagación, pino, teca
ABSTRACT
Although protocols to propagate large numbers of woody species by in vitro culture have been developed, microbial contamination of explants is a fundamental problem which limits its application. The objectives of this study were: to identify the donor plant mycobiota and to identify filamentous fungi contaminants at the establishment phase of mahogany, teak, majagua, pine and cedar. Explants of donor plants were placed in moist chamber and were prepared to direct optical microscope of fungal growth. Cultural characteristics and morphological were taken into account to identify filamentous fungi contaminants in the establishment phase. Frequency of all genera identified was determined. Eleven genera of filamentous fungi in donor plants and twenty genera in the establishment of forest species were identified. The genera Botryodiplodia, Cephalosporium, Diplodia, Dreschlera, Geotrichum, Gloeosporium Helminthosporium, Memnoniella, Oidiodendron and Rhinoclediella appeared only during establishment phase. Others such as Alternaria, Aspergillus, Cercospora, Curvularia, Cladosporium, Colletotricum, Fusarium, Nigrospora, Penicillium and Pestalotia were detected in donor plants and during establishment phase. This indicates that the possible source of contamination was the initial explant. The most frequent genera were Botryodiplodia in teak, Nigrospora in majagua and Alternaria in pine, cedar and mahogany. A phytosanitary plan of defence for donor plants was developed. The plan included systemic and contact fungicides whose spectrum of activity covered the identified genera of fungi.
Keywords: cedar, mahogany, majagua, micropropagation, microbial contamination, pine, teak
INTRODUCCIÓN
El rescate de especies forestales de interés comercial es una de las líneas prioritarias de la biotecnología como herramienta básica para apoyar al mejoramiento de árboles élites. De esta forma se contribuye a elevar las tasas de multiplicación y permite participar en los programas de reforestación de áreas con grandes problemas de deforestación. Todo ello conduce a su integración al desarrollo del país y a mantener el equilibrio del ecosistema natural.
Las especies forestales tienen muchos problemas de propagación por la variabilidad genética de las plantas producidas a partir de semillas (Daquinta et al., 2000). La micropropagación vía organogénesis directa mediante el desarrollo y enraizamiento de brotes axilares ha ido reemplazando los sistemas de propagación tradicional (Nadgauda et al., 1997; Monteuuis et al., 1998; Daquinta et al., 2001).
Uno de los principales problemas para la micropropagación de estas especies, lo constituye la contaminación fúngica durante la fase de establecimiento in vitro. En las especies forestales esto se ve incrementado por las características anatómicas de los explantes que dificultan a menudo su desinfección (Sharry, 2001). El uso de fungicidas en el tratamiento de plantas donadoras durante la fase preparativa de la micropropagación es muy importante para prevenir o eliminar los hongos filamentosos saprofíticos o parásitos causantes de contaminaciones durante la fase de establecimiento (Agramonte et al., 2001). Conocer la micobiota epifítica de plantas donadoras y los hongos filamentosos contaminantes del establecimiento in vitro, permite crear un esquema de tratamientos a las plantas donadoras dirigidos a prevenir, disminuir o eliminar la contaminación fúngica. Por ello los objetivos de este trabajo fueron identificar la micobiota de plantas donadoras y los hongos filamentosos contaminantes del establecimiento in vitro de explantes de cinco especies forestales (caoba, teca, majagua, pino y cedro).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se emplearon plantas de caoba (Swietenia mahagonii L Jacq,.), teca (Tectona grandis L.) majagua (Talipariti elatum (Sw)), pino (Pinus caribaea var. caribaea (L) Morelet) y cedro (Cedrela odorata L.) que estuvieron sembradas en bolsas de polieturano ubicadas en el banco de donantes del Instituto de Biotecnología de las Plantas.
Identificación de la micobiota de plantas donadoras
De las ramas laterales de las plantas donadoras se cortaron segmentos nodales de aproximadamente 1 a 3 cm de longitud con una yema axilar bien diferenciada (explantes).
Inmediatamente después de cortados los explantes fueron introducidos en recipiente de 500ml de capacidad con 25 ml de agua desionizada estéril (25 explantes por recipiente) y se colocaron en zaranda orbital a 140 rpm por 15 minutos para su lavado superficial. Posteriormente los explantes se colocaron en cámara húmeda para el crecimiento de los hongos filamentosos que conformaban la micobiota de las plantas donadoras. Las placas se incubaron a 28ºC y oscuridad constante hasta 14 días.
Los hongos filamentosos que crecieron fueron aislados. Para ello el micelio fue transferido con aguja de siembra a placas de Petri de 32 mm de diámetro con medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (BioCen). Las placas se incubaron a 28ºC y oscuridad constante durante 7 días. Para la identificación se describieron las características culturales y morfológicas de los hongos filamentosos y se realizaron preparaciones directas que se obtuvieron con el microscopio clínico (OLYMPUS) con 400x de aumento. Las características observadas se compararon con las descripciones contenidas en el Atlas de hongos del suelo y de semilla (Watanabe, 2002).
Identificación de hongos filamentosos contaminantes en fase de establecimiento in vitro
Los explantes fueron establecidos in vitro según protocolos descritos por Daquinta et al. (2000); Collado et al. (2004); Jiménez-Terry et al. (2007) y De Feria et al. (2008) Todos los explantes donde se detectó visualmente crecimiento de hongos filamentosos se retiraron de las cámaras de crecimiento para su posterior identificación.
Se procesaron un total de 171 explantes, de ellos 40 de caoba, 49 de teca, 27 de majagua, 32 de pino y 23 de cedro. Para el aislamiento e identificación se siguió un protocolo similar al descrito anteriormente. Además, se determinó la frecuencia de aparición de los géneros identificados.
A partir de los resultados se confeccionó un plan de defensa fitosanitario que incluyó la aplicación de fungicidas sistémico y de contacto que permitió el control de los géneros identificados en las plantas donadoras.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Identificación de la micobiota de plantas donadoras
Se identificaron 11 géneros de hongos filamentosos en plantas donadoras de las cinco especies forestales. Estos hongos han sido descritos como saprofitos o patógenos de plantas. Están clasificados taxonómicamente dentro de la clase Hyphomycetes los géneros Alternaria, Aspergillus, Cercospora, Cladosporium, Curvularia, Fusarium, Nigrospora, Penicillium y Trichoderma y en la clase Coleomycetes los géneros Colletotrichum y Pestalotia (Watanabe, 2002; Vilaró et al., 2006). Los géneros Fusarium y Alternaria fueron los de mayor incidencia en todas las especies forestales. La mayor diversidad de hongos filamentosos como parte de su micobiota se apreció en pino, seguido de caoba y teca (Tabla 1, Figura 1).
Se conoce que la micobiota de las especies forestales es diversa. Estudios de la micobiota de otros árboles han revelado la existencia de algunos de los géneros fúngicos encontrados en este trabajo. Por ejemplo, Acosta-Suárez et al. (2005) identificaron nueve géneros de hongos filamentosos en la micobiota del eucalipto (Eucaliptus grandis) ellos fueron: Alternaria, Cladosporium, Curvularia, Fusarium, Gloeosporium, Memnoniella, Nigrospora, Penicillium y Rhizopus. En el cacao (Theobroma cacao), Urdaneta y Delgado (2007) encontraron las especies Curvularia lunata, Nigrospora sphaerica, Colletotrichum gloeosporioides, Lasiodiplodia theobromae, Moniliophthora roreri, Phytophthora spp., Penicillium sp y Gliocladium sp.
Identificación de hongos filamentosos contaminantes en fase de establecimiento in vitro
Se identificaron 20 géneros de hongos filamentosos contaminantes del establecimiento in vitro de las cinco especies forestales. Los géneros
Botryodiplodia, Cephalosporium, Diplodia, Dreschlera, Geotrichum, Gloeosporium Helminthosporium, Memnoniella, Oidiodendron y Rhinoclediella aparecieron solamente durante la fase de establecimiento, mientras que Alternaria, Aspergillus, Cercospora, Curvularia, Cladosporium, Colletotricum, Fusarium, Nigrospora, Penicillium y Pestalotia se detectaron en los explantes de plantas donadoras y durante la fase de establecimiento indicando que el explante inicial fue la posible fuente de contaminación. Están clasificados taxonómicamente dentro de la clase Hyphomycetes los géneros Dreschlera, Geotrichum Helminthosporium, Memnoniella, Oidiodendron y Rhinocladiella y los géneros Botryodiplodia, Diplodia y Gloeosporium, dentro de los Coleomycetes (Watanabe, 2002; Vilaró et al., 2006). El género Fusarium fue el de mayor incidencia en todas las especies evaluadas, seguido de Cladosporium, Curvularia y Nigrospora. Los géneros más frecuentes fueron Botryodiplodia en teca, Nigrospora en majagua y Alternaria en pino, cedro y caoba (Figuras 1 y 2).
El medio de cultivo de tejidos vegetales es una excelente fuente de nutrientes para el crecimiento de microorganismos, cuya presencia trae como resultado, generalmente, un incremento en la mortalidad de los tejidos, reducción del coeficiente de multiplicación y del enraizamiento de la planta in vitro (Kane, 2003).
Estos resultados concuerdan con los encontrados en el establecimiento in vitro de otros árboles leñosos, ejemplo los géneros: Alternaria, Cladosporium, Curvularia, Fusarium y Helminthosporium aparecieron como contaminantes en el establecimiento in vitro de segmentos nodales de guayaba (Ramírez et al., 2000; Acosta-Suárez et al., 2002); mientras que Cladosporium ha sido identificado en el establecimiento de la conífera Cryptomeria japonica (Gómez y Valverde, 2003).
En la formación de callos a partir de explantes foliares de Coffea sp. González y Barrios (2003) identificaron a Fusarium y Cladosporium como los hongos filamentosos de mayor frecuencia de aparición.
Por su parte, Martínez et al. (2005) micropropagaron dos especies de eucalipto Eucaliptus urophylla y E. grandis y obtuvieron un 3% y un 8% de contaminación por hongos contaminantes respectivamente. Acosta-Suárez et al. (2005) identificaron los géneros Alternaria y Curvularia en el establecimiento de E. grandis.
A pesar del gran número de especies propagadas por cultivo in vitro, la contaminación interna de los explantes, constituye uno de los problemas fundamentales en su multiplicación (Sharry, 2001).
Varios investigadores afirman que desde la fase 0 o preparatoria de la micropropagación hay que tomar las medidas necesarias para prevenir o eliminar la contaminación en el establecimiento in vitro. Así, Pacheco (1995) refirió que la revigorización es una vía factible que permite la manipulación del potencial en las especies leñosas en función de preparar las plantas donadoras para el establecimiento in vitro y disminuir la contaminación por microorganismos de los explantes iniciales.
La metodología de micropropagación del Eucalyptus grandis (Hill ex Maiden) desarrollada por Agramonte et al. (2001) señala la importancia del establecimiento de un banco de plantas donantes bajo condiciones controladas y la aplicación de mezclas de fungicidas comerciales con el objetivo de atenuar el efecto de los microorganismos contaminantes durante la fase de establecimiento.
En este sentido Jiménez-Terry et al. (2007) demostraron que la aplicación de varios fungicidas (Benomil, Mancozeb y Silvacur Combi) a los brotes de estaquillas de Cedrela odorata L. en casa de cultivo durante la revigorización de este material vegetal, ejerció un papel determinante en la disminución de la contaminación in vitro de los explantes.
De acuerdo con resultados se confeccionó un plan de defensa fitosanitario que comprendió la aplicación de fungicidas preventivos y curativos de acción sistémica (Silvacur combi CE30 (22.5+7.5) (Tebuconazol + Triadimenol) a la concentración de 2.0 ml.l-1.) y fungicidas preventivos de contacto (Mancozeb PH80 (Ingrediente activo: etilenbisditiocarbamato de Mn y Zn) a la concentración de 5 g.l-1) a plantas donadoras cuyo espectro de acción cubría los géneros de hongos identificados.
CONCLUSIONES
La micobiota de plantas donadoras de especies forestales fue diversa y estuvo integrada por géneros de hongos filamentosos que generalmente aparecieron durante la fase de establecimiento in vitro indicando que el explante inicial es la posible fuente de contaminación. El pino fue la especie con mayor diversidad de hongos filamentosos como parte de su micobiota. El género Fusarium apareció como contaminante en todos los forestales durante fase de establecimiento, mientras que los más frecuentes fueron Botryodiplodia en teca, Nigrospora en majagua y Alternaria en pino, cedro y caoba.
REFERENCIAS
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