Vol.9, No.3 2009.pmd 
Artículo Científico                                                                    Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 3: 161 - 167, julio - septiembre, 2009
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) 
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)

Propagación in vitro de Vriesea en sistemas de inmersión temporal

Iris Capote1*, Maritza Escalona1, Marcos Daquinta1, Danilo Pina2, Justo González1, Carlos Aragon1 *Autor para correspondencia.

1Centro de Bioplantas, UNICA, Carretera a Morón, km 9 Ciego de Ávila.

2Laboratorio de Células y Cultivo Tejidos, Centro de Bioplantas, Universidad de Ciego de Ávila, CP 69 450, Cuba. e-mail: icapote@bioplantas.cu

RESUMEN

Las bromelias son plantas ornamentales muy atractivas por la coloración de sus hojas y la belleza de sus inflorescencias. Dentro de ellas Vrieseas es uno de los géneros de mayor interés comercial. Cuando se desean introducir nuevos híbridos en el mercado, las técnicas de propagación tradicional son insuficientes, por lo que resultan de gran interés las técnicas de propagación in vitro. Con el objetivo de establecer un protocolo para la propagación in vitro en Biorreactores de Inmersión Temporal se determinó el efecto del paclobutrazol combinado con Kinetina y BA a diferentes frecuencias de inmersión en la proliferación y calidad de los brotes, y dos concentraciones de AG3 en el crecimiento de los brotes. La integración de los resultados constituyen los procedimientos elementales para un protocolo de propagación de Vriesea con el empleo de la técnica de inmersión temporal.

Palabras clave: bromelias, ornamentales, paclobutrazol

ABSTRACT

Bromeliads are ornamentals plants very attractive due to leaves coloration and the beautiful inflorescences. Vrieseas is a genus of a great commercial interest among them. Traditional propagation techniques are limited to introduce new hybrids to market. Then, in vitro propagation technique gains a great interest. Effect of paclobutrazol combined with Kinetin and BA to different immersion frequency in shoots proliferation and quality, using two concentrations of GA3 in shoots growth were evaluated to establish a protocol for in vitro propagation in Temporary Immersion Systems. Integration of these results is the elemental procedure for an in vitro propagation protocol of Vriesea using temporary immersion technique.

Key words: bromeliads, ornamentals, paclobutrazol

INTRODUCCIÓN

Las Bromelias se propagan de forma tanto natural a través de la vía sexual como de la asexual, pero ambas vías presentan problemas. El desarrollo de las técnicas de micropropagación ha tenido resultados ventajosos en la propagación rápida y con calidad de genotipos élites. Los protocolos de propagación in vitro de las Bromelias se han establecidos a partir del cultivo de ápices, yemas axilares y explantes de hojas provenientes de plantas adultas (Pierik y Sprenkles, 1991), del cultivo de plantas a partir de la germinación de las semillas in vitro (Mercier y Kerbauy, 1994; Alves y Guerra, 2001), y por la formación de yemas adventicias a partir de la parte basal de las hojas removidas de cultivos asépticos (Carneiro et al., 1999). Todos estos protocolos presentan como desventajas los bajos coeficientes de multiplicación, el alto costo de la mano de obra y la escasa posibilidad de automatización. Es por ello que se han venido desarrollando nuevos métodos de propagación con el empleo de medio de cultivo líquido.

Con el cultivo en inmersión temporal se aumenta la tasa de multiplicación y se mejora la calidad morfológica intrínseca de los brotes. La caracterización fisiológica de las plantas en esa nueva forma de cultivo ha demostrado una baja capacidad fotosintética in vitro y una mayor asimilación de nutrientes en el cultivo de piña (Ananas comosus L.) (Escalona et al., 2003).

El presente trabajo se desarrolló con el objetivo de determinar el efecto de diferentes condiciones de cultivo en la propagación in vitro de la Vriesea en Sistemas de Inmersión Temporal.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Plantas cultivadas in vitro de un híbrido de Vriesea, Bromelia Ornamental, proveniente del Laboratorio Comercial SBW de Holanda. Se utilizaron grupos de 2-3 brotes de los agregados, las hojas de los brotes se removieron y se cortaron a una altura de 1.5 cm desde la base.

El medio de cultivo fue el MS (Murashige y Skoog, 1962) modificado. Para todos los experimentos, el pH del medio de cultivo se ajustó a 5.8 previo a la esterilización por vapor de autoclave, 121ºC y 118 kPa. El tiempo de esterilización estuvo en correspondencia con el volumen de medio de cultivo (Burger, 1988) que se empleó en cada caso.

Se emplearon Biorreactores de Inmersión Temporal (BIT) previamente descritos por Escalona et al. (1999). Las condiciones de cultivo en el estante de inmersión temporal fueron de 25 ± 1ºC, un flujo de Fotones Fotosintéticos de 30-40 μmol.m-2.s-1 y un foto período de 16 horas luz y 8 horas oscuridad.

El coeficiente de multiplicación se determinó por el cociente del número final de brotes entre el número inicial de brotes que se inocularon. Como indicadores de calidad se cuantificó presencia de brotes hiperhídricos, coloración de los brotes. Se midió la longitud de los brotes, número de hojas por brote, número de raíces por brote, así como se determinó la masa fresca (g) y la masa seca (g). Para la determinación de la masa seca los brotes se colocaron durante 72 horas a 70ºC en estufa de convección (HSA) hasta peso constante.

Efecto de Paclobutrazol (PBZ) y la frecuencia de inmersión

Se evaluaron dos factores: concentración de Paclobutrazol (0.0, 1.70, 3.40 y 5.10 μmol.l-1 PBZ) adicionado al medio de cultivo basal MS modificado y la frecuencia de inmersión (cada una, tres y cinco horas) con el objetivo de evaluar el posible efecto sinérgico citoquininas-retardante del crecimiento en la proliferación de los brotes en BIT a diferentes frecuencias de inmersión.

Efecto de Bencil adenina (BA) y Paclobutrazol (PBZ)

Este experimento tuvo como objetivo evaluar el efecto de diferentes concentraciones de BA y PBZ en la proliferación y calidad de los brotes de Vriesea tomando como base la mejor frecuencia de inmersión que se determinó en el experimento anterior.

Las condiciones experimentales fueron las mismas que se describieron en el experimento anterior. Como tiempo y frecuencia de inmersión se emplearon cuatro minutos cada tres horas.

Se ensayaron las siguientes concentraciones de BA: 0.0, 4.43 y 8.87 μmol.l-1 (Mara Alves y Guerra, 2001), así como las concentraciones de PBZ: 0.0, 0.4 y 0.85 μmol.l-1 (Daquinta et al., 2001). Se empleó un tratamiento control que contenía la misma composición basal descrita anteriormente, pero se adicionaron 4.64 μmol.l-1 de Kinetina y 0.53 μmol.l-1 de ácido naftalenacetico (ANA).

Efecto del ácido giberelico (AG3) en el crecimiento de los brotes de Vriesea en el BIT

El objetivo de este experimento estuvo relacionado con lograr la elongación de los brotes. Para ello fue necesario ampliar la capacidad del BIT. Con ese propósito, se emplearon BIT de 1 000 ml. El tiempo de proliferación fue de ocho semanas. Para la fase de crecimiento en el BIT se establecieron tres tratamientos: MS (formulación completa Murashige y Skoog, 1962), MS con 2.02 μmol.l-1 AG3 y MS con 4.05 μmol.l-1 AG3.

Para el desarrollo de este experimento se tomaron brotes de Vriesea provenientes de medio de cultivo semi-sólido después de un sexto subcultivo los cuales se multiplicaron en el BIT según las condiciones experimentales descritas con anterioridad. En este caso para la proliferación de los brotes se empleó la mejor composición determinada en el experimento anterior. El experimento contó con un total de tres tratamientos cada uno con tres repeticiones.

Después de quince días en la fase de crecimiento se evaluó el coeficiente de multiplicación Para el análisis estadístico se utilizó el utilitario estadístico SPSS (versión 11.5 para Windows).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto del Paclobutrazol y la frecuencia de inmersión

Al evaluar el efecto de la frecuencia de inmersión y diferentes concentraciones de PBZ adicionado al medio de cultivo durante la proliferación de la Vriesea en el BIT se encontró que la frecuencia de inmersión cada una y tres horas con la concentración de PBZ de 3.40 μmol.l-1 aumentó significativamente el coeficiente de multiplicación después de las ocho semanas de cultivo. Se alcanzaron valores de 3.14 y 3.45 respectivamente (Tabla 1). De forma general, para cada frecuencia de inmersión a esta concentración de PBZ (3.40 μmol.l-1) se la formación de brotes. La frecuencia de inmersión cada tres horas aumentó significativamente los indicadores de calidad de los brotes como fue el número de hojas/brote independientemente de la concentración de PBZ. Solo el tratamiento control a esa misma frecuencia de inmersión logró aumentar significativamente la longitud de los brotes a 4 cm (Tabla 1).

En el cultivo en inmersión temporal, la frecuencia de inmersión es uno de los factores que tiene mayor incidencia en la respuesta morfogenética de los explantes ya que es el proceso mediante el cual los explantes se ponen en contacto con el medio de cultivo líquido y de esa forma se toman los nutrientes, se logra la aireación e intercambio gaseoso del vaso de cultivo y se regula el nivel de hiperhidricidad de los brotes.

Es bien conocido que los retardantes del crecimiento tales como el PBZ, bloquean la biosíntesis de las giberelinas a través de la inhibición competitiva de las enzima P450 mono-oxigenasa, la cual cataliza las reacciones de oxidación que conducen a la formación del ent-kaurenoico a partir del ent-kaureno (Rademacher, 2000).

En la proliferación de los brotes de Vriesea se logró un efecto combinado entre la frecuencia y la concentración de 3.40 µmol.l-1 de PBZ en el medio de cultivo con Kinetina-ANA, incluso a la misma frecuencia (cada tres horas) que se ensayó en experimentos anteriores (datos no presentados). Este resultado puede ser indicativo de que la adición de PBZ al medio de cultivo logró un efecto sinérgico con la citoquinina y favoreció la proliferación de los brotes. Es decir, que en la adición de PBZ inhibió la síntesis de giberelinas y como consecuencia, las citoquininas pueden manifestar su potencial inductor en la formación de brotes (Werbrouck, et al., 1996).

De los indicadores morfológicos que se evaluaron, una vez más la inmersión cada tres horas logró un aumento significativo en el número de hojas de los brotes independientemente de la concentraciones de PBZ. La ventaja de la inmersión temporal radica en que en esta técnica se combinan la ventilación de los tejidos de las plantas y el contacto intermitente entre la superficie del tejido y el medio de cultivo líquido (Etienne y Berthouly, 2002). Se favoreció un aumento en el número de hojas y en la longitud de los brotes en el tratamiento donde el PBZ estuvo ausente.

Como resultado de este experimento se seleccionó la frecuencia de cada tres horas para continuar con el cultivo en inmersión temporal y evaluar otros factores que elevaron la eficiencia biológica en esta especie de planta.

Si bien es cierto que bajo las condiciones que se experimentaron se logró aumentar la proliferación de los brotes en el BIT, los niveles de proliferación que se alcanzaron fueron bajos en relación con los ya informados para otras especies de plantas y en particular para otras Bromelias ornamentales. Es por ello que se decidió evaluar las concentraciones de BA en combinación con PBZ, pero a las concentraciones que previamente establecieron Daquinta et al. (2001).

Efecto de la concentraciones de Bencil adenina (BA) y Paclobutrazol (PBZ)

Al evaluar el efecto de la combinación de diferentes concentraciones de BA y PBZ en la proliferación y calidad de los brotes de Vriesea en BIT, se observó que las concentraciones de 4.43 y 8.87 µmol.l-1 de BA con la mayor concentración de PBZ (0.85 µmol.l-1) aumentó significativamente el coeficiente de multiplicación en un rango de 3.6 y 3.9 respectivamente. No se encontraron diferencias significativas en la longitud promedio de los brotes y solo BA a 8.87 µmol.l-1 incrementó el número de hojas por brote (11.1) (Tabla 2).

El efecto de las citoquininas en el cultivo de tejidos u órganos puede variar en dependencia al tipo de compuesto que se utilice, el tipo de cultivo, la variedad de planta y si el explante proviene de un tejido juvenil o maduro (George, 1993).

En comparación con el empleo de Kinetina (control), las dos concentraciones de BA que se aplicaron lograron aumentar la proliferación de los brotes sólo cuando estas se combinaron con la mayor concentración de PBZ. Atendiendo a lo discutido anteriormente sobre la interacción citoquinina-PBZ, es evidente que la inhibición de la síntesis de giberelinas es aún más necesaria cuando BA actúa como inductor de la brotación en Vriesea, que cuando se utiliza Kinetina. Por ello hubiera sido interesante evaluar concentraciones de PBZ más altas en combinación con la BA, aspecto este a abordar en futuros experimentos.

Con la máxima concentración de BA sin PBZ lograron brotes con un mayor número de hojas, lo cual es indicativo de una mayor calidad en esta especie de plantas.

Como resultado de este experimento se decidió emplear para la proliferación de Vriesea en BIT la concentración de 8.87 µmol.l-1 BA y 0.85 µmol.l-1 de PBZ añadidos al medio de cultivo MS modificado (sin Kinetina y con 0.44 µmol.l-1 ANA). Sin embargo, con el objetivo de aumentar la longitud de los brotes previo a la fase de enraizamiento ex vitro y aclimatización se procedió a determinar el efecto de dos concentraciones de AG3 durante la fase de crecimiento en el BIT.

Efecto del AG3 en el crecimiento de los brotes de Vriesea en el BIT

Al analizar el efecto de dos concentraciones de AG3 en la fase de crecimiento de los brotes de Vriesea en el BIT, después de ocho semanas de proliferación, se determinó que los brotes que crecieron en el medio de cultivo MS sin reguladores del crecimiento lograron aumentar significativamente su capacidad morfogenética y alcanzaron un coeficiente de multiplicación de 5.9 en comparación con los tratamientos donde se empleó AG3 (Figura 1). Sin embargo, el AG3 provocó un aumento significativo en la longitud de los brotes y no se encontraron diferencias significativas entre ambas concentraciones. Además, el número de hojas por brote fue elevado y tampoco se comprobaron diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 2).

Cuando el AG3 se adiciona a los medios de cultivo de plantas, este frecuentemente produce efectos similares a las auxinas. Los brotes que reciben el efecto del AG3 incrementan la longitud. En varias plantas, el uso de giberelinas en el medio de cultivo de brotes no es favorable ya que produce brotes elongados con hojas muy estrechas (George, 1993).

En el cultivo in vitro de Vriesea friburgensis se ha empleado el AG3 para lograr la conversión sincrónica de las microyemas a brotes. El medio de cultivo libre de reguladores de crecimiento o con AG3 resultó en la diferenciación y desarrollo de brotes múltiples a partir de las multiyemas (Alves y Guerra, 2001).

También el AG3 ha sido utilizado en estudios de la composición del medio de cultivo en la germinación de semillas in vitro y en el ulterior desarrollo de las plántulas. Cuando se comparó el efecto del ANA y el AG3 a la concentración de 4.05 µmol.l-1 en el medio de cultivo basal Knudson, este último regulador promovió la germinación de Vriesea splendens mientras que el ANA estimuló el desarrollo temprano de las plántulas (Mercier y Kerbauy, 1997).

De los resultados del presente experimento resulta interesante destacar que el subcultivo de los brotes de Vriesea en el BIT en un medio de cultivo sin reguladores de crecimiento provocó un incremento significativo de su capacidad morfogenética. De allí que pudiera inferirse de que los brotes de Vriesea requieren de un proceso de no exposición al efecto de las citoquininas para la formación de nuevos brotes. En las Bromelias, los meristemos intercalares distribuidos en la base de las hojas tiene un alto potencial para la formación de yemas. Es por ello que la capacidad morfogenética de algunas especies deba estar muy relacionada con la capacidad inductiva del tipo de regulador que se aplique y el balance endógeno que se logre (Mercier y Kerbauy, 1997).

CONCLUSIONES

Se determinó que las condiciones de cultivo influyeron en la propagación in vitro de Vriesea en Sistemas de Inmersión Temporal, especialmente las concentraciones de los reguladores de crecimiento empleados y la frecuencia de inmersión. La integración de los resultados constituyen los procedimientos elementales para un protocolo de propagación de Vriesea con el empleo de la técnica de inmersión temporal.

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