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Comunicación Corta Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 3: 177 - 181, julio - septiembre, 2009
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Enraizamiento y aclimatización de brotes de Phaseolus vulgaris L. regenerados in vitro
Lourdes R. García *, Raúl Collado, Idalmis Bermúdez-Caraballoso, Novisel Veitía, Dámaris Torres, Carlos Romero. *Autor para correspondencia.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: lourdes@ibp.co.cu
RESUMEN
El género Phaseolus se ha demostrado que es recalcitrante a la regeneración in vitro de plantas lo cual es un requisito indispensable para iniciar un programa de mejoramiento genético. Con el objetivo de lograr el enraizamiento y aclimatización de brotes regenerados del cv. CIAP 7247 se estudió la influencia deL AIB en el medio de cultivo. Además, se evaluó la longitud de los brotes y la supervivencia de las plantas enraizadas en la fase de aclimatización. Los resultados mostraron que es indispensable el AIB para la inducción de raíces en esta variedad. Se comprobó que los brotes con 1cm o más de longitud pueden ser transferidos a los medios de cultivo de enraizamiento donde se obtienen porcentajes de formación de raíces mayores de 70.6% y supervivencia en fase de aclimatización fue 95%. No se encontraron diferencias en cuanto al color y forma de las hojas y tallo y todas las plantas aclimatizadas fueron fértiles.
Palabras clave: auxinas, cultivo de tejidos, frijol
ABSTRACT
The genus Phaseolus showed to be recalcitrant to in vitro plant generation, which is a prerequisite to start a breeding program. Influence of IBA in the culture medium and the shoot longitude were studied in order to achieve rooting and acclimatization of regenerated shoots of the cv. CIAP 7247. Survival of plants in the acclimatization phase was also evaluated, as well as morphological characteristics and fertility them. Results showed that IBA is indispensable for roots induction in this variety. Shoots with 1cm or more can be transferred to the rooting culture medium where percentages of roots formation 70.6% and 95% of plants acclimatization are obtained. Differences in the morphological characteristics were not found taking into account color and shape of leaves and shoota. Besides, all the plants were fertile.
Keywords: auxin, beans, tissue culture
INTRODUCCIÓN
Phaseolus vulgaris es una de las especies del género Phaseolus que más se cultiva mundialmente como fuente de alimentación por sus valiosos aportes a la dieta de millones de personas en países de América, Asia y Äfrica (Delgado-Sánchez et al., 2006).
Dentro de los programas de mejoramiento genético la búsqueda de variedades más productivas, resistentes a estrés biótico y abiótico es una tarea primordial para satisfacer las necesidades siempre crecientes de la población.
Entre las herramientas que se han utilizado para acelerar el desarrollo de nuevas variedades está la transformación genética (Guidolin, 2003). No obstante, en las especies de Phaseolus estas técnicas se hacen muy difíciles por lo recalcitrante del cultivo in vitro y la poca reproducibilidad de los experimentos, entre otras causas (Shamsudeen et al, 2006; Kanchiswamy y Maffei, 2008). Phaseolus acutifolius es la única especie de Phaseolus que puede ser fácilmente transformada con Agrobacterium tumefaciens (Terryn et al., 2008).
Para poder desarrollar estas técnicas es indispensable contar con protocolos de regeneración de plantas eficientes que permitan llevar las investigaciones hasta la evaluación de las plantas en el campo.
El cultivo de tejidos y la regeneración de plantas en P. vulgaris ha tenido serias dificultades desde el inicio. Diferentes explantes han sido utilizados para la regeneración directa de plantas siguiendo la vía de la organogénesis (Guidolin, 2003), pero se ha demostrado que esta especie es genotipo dependiente y es difícil repetir los protocolos desarrollados en otras variedades (Collado et al., 2008).
García et al. (2008) propusieron un protocolo de regeneración de plantas vía organogénesis directa a partir de yemas múltiples en P. vulgaris L. cv. CIAP 7247. En la presente investigación se realizan un conjunto de experimentos con el objetivo de lograr el enraizamiento y la aclimatización de plantas regeneradas in vitro en este cultivar.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se emplearon brotes elongados de P. vulgaris L. cv. CIAP 7247 regenerados in vitro a partir de yemas múltiples según el protocolo propuesto por García et al. (2008).
Se emplearon frascos de vidrio de 250 ml de capacidad con 30 ml de medio de cultivo. El pH de los medios de cultivo se ajustó a 5.7 previo a la esterilización con NaOH 1.0 N y HCl 1.0 N.
Se colocaron seis explantes por frasco de cultivo que contenían 30 ml del medio de cultivo y se emplearon 10 frascos por tratamiento. Los explantes fueron subcultivados cada dos semanas al mismo medio de cultivo y las evaluaciones se realizaron a las 4 semanas. El material vegetal se incubó a 27 ± 2 ºC en condiciones de luz solar en las cámaras de crecimiento.
El diseño experimental empleado fue completamente aleatorizado para todos los experimentos, dadas las condiciones de homogeneidad en las que se desarrolló la investigación. Para los análisis estadísticos se realizaron análisis de varianza de clasificación simple. Para determinar los grupos homogéneos y/o significativamente diferentes, a un nivel de 5.0%, se utilizó la prueba de rangos múltiples de Tukey.
Influencia del ácido indol butírico (AIB)
Brotes elongados, con longitud mayor o igual a 3 cm, fueron separados y colocados en distintos medios de cultivo con el objetivo de lograr el enraizamiento. El medio de cultivo basal estuvo compuesto por las sales Murashige y Skoog (1962), sacarosa 30 g.l-1, vitaminas propuestas por Heinz y Mee (1969) y se estudiaron tres concentraciones de AIB (0.0, 1.0 y 2.0 mg.l-1). Se utilizó como control el medio de cultivo libre de reguladores del crecimiento.
Se cuantificó el número de brotes enraizados y se midió la longitud de las raíces por brote (cm).
Influencia de la longitud de los brotes
Se determinó el tamaño mínimo permisible de los brotes para lograr el enraizamiento in vitro y la aclimatización posterior en casas de cultivo. Para ello se utilizaron brotes entre 0.5 y 1 cm, entre 1 y 3 cm y mayores de 3 cm, los cuales fueron colocados en el medio de cultivo de enraizamiento seleccionado en el experimento anterior.
Las variables evaluadas fueron las mismas que en el experimento anterior.
La aclimatización de los brotes se realizó en casa de cultivo. Las plantas obtenidas in vitro fueron colocadas en cajas de polieturano de 70 orificios en un sustrato compuesto por una mezcla de materia orgánica-zeolita de 80-20% respectivamente. El riego tuvo una frecuencia de cinco veces al día por 2 minutos cada uno.
En esta fase se determinó el número de plantas vivas a los 7 días (supervivencia) y se observaron las características morfológicas de las plantas, el florecimiento y la fructificación para detectar alguna anomalía.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia del AIB
Los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó el AIB (1 y 2 mg.l-1) como componente dentro del medio de cultivo. Se observaron los mayores valores de brotes enraizados (88% y 90%, respectivamente) en un período de cuatro semanas (Figura 1).
En el medio de cultivo sin regulador del crecimiento solamente se alcanzó un 15% de enraizamiento.
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Los explantes utilizados en el experimento se regeneraron a partir de yemas múltiples formadas en medios de cultivo con 1 mg.l -1 de tidiazurón (TDZ) (García et al., 2008). Se ha demostrado que uno de los problemas cruciales del TDZ es la inhibición del enraizamiento de los brotes en especies como Phaseolus vulgaris, P. acutifolius y P . polyanthus. Por ello disminuye la eficiencia de los protocolos de regeneración (Dillen et al., 1997; Zambre et al., 1998; Zambre et al., 2001).
Se ha sugerido por varios investigadores que este regulador del crecimiento puede estar involucrado en la acumulación y/o síntesis de citoquininas (Capelle et al., 1983; Cruz de Carvalho et al., 2000) Por esta razón se hizo necesario en este estudio la adición de auxinas a los medios de cultivo para inducir el enraizamiento de los brotes. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Varisai Mohamed et al. (2006) en la especie P. angularis. Ellos refieren buenos resultados cuando trataron los brotes con soluciones de AIB durante 10 minutos y luego los colocaban en un medio de cultivo sin reguladores del crecimiento.
En este trabajo la respuesta de las plantas a la formación de raíces, a pesar de haberse utilizado el TDZ en anteriores medios de cultivo, puede estar relacionada, además, con lapresencia de AgNO3 en el medio de cultivo de elongación de brotes. Khalafalla et al. (2000) demostraron que inhibidores de etileno, como AgNO3, actúan en el enraizamiento de brotes de fava regenerados en presencia de TDZ, anticipando la formación, aumentando la tasa de crecimiento y el número de raíces formadas.
Influencia de la longitud de los brotes
La longitud de los brotes influyó significativamente en su enraizamiento. Se observó que de los brotes >3 cm de longitud enraizaron el 100% y de los brotes con una longitud entre 1 y 3 cm enraizaron el 70.6% . De los brotes con longitudes menores a 1 cm solo enraizó el 47% (Tabla 1).
Cuando se evaluó la variable longitud de las raíces no se encontraron diferencias significativas entre los brotes mayores de 1 cm de longitud.
En la fase de aclimatización se observaron también diferencias en la supervivencia de las plantas en dependencia de su longitud. Todas las plantas 1 cm de longitud con raíces bien diferenciadas presentaron porcentaje de supervivencia superiores a 95% (Figura 2 A), mientras que las plantas menores de 1 cm murieron.
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Se demostró que brotes con 1cm o más de longitud pueden formar raíces cuando son transferidos a los medios de cultivo de enraizamiento, lo que garantizará una superviviencia adecuada en la fase de aclimatización.
En el estudio de las características morfológicas de las plantas no se encontraron diferencias en cuanto al color y forma de las hojas y tallo (Figura 2 B) y todas las plantas aclimatizadas fueron fértiles (Figura 2 C).
CONCLUSIONES
En el trabajo se constata la importancia del AIB en los medios de cultivo de enraizamiento en esta especie y la necesidad de utilizar explantes mayores de 1cm en esta fase de desarrollo para lograr altos porcentajes de superviviencia en la fase de aclimatización.
REFERENCIAS
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