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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 8, No. 1: 35 - 41, enero - marzo, 2008
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Enraizamiento y aclimatización de plantas transgénicas de papaya var. Maradol roja
Maylin Cruz1*, Ana L. Darías2, Dariel Cabrera3, Amado Pérez4, Mileidy Cruz-Martín4, Tatiana Pichardo4, Rafael G. Kosky4, Orelvis Portal4 * Autor para correspondencia
1Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Maleza km 2.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e.mail: lpsvvc@enet.cu
2Centro de Análisis y Procesos (CAP). Facultad de Química-Farmacia, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba.
3Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba.
4Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP). Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba.
RESUMEN
La enfermedad causada por el Virus de la mancha anular de la papaya es la más importante del cultivo de la papaya en el mundo. El empleo de las técnicas biotecnológicas, como herramienta auxiliar, ha contribuido al mejoramiento genético en este cultivo, aunque tiene dificultades durante las fases de enraizamiento y aclimatización. Tomando como base estas problemáticas se desarrolló el presente trabajo con el objetivo de lograr el enraizamiento y aclimatización de líneas transformadas de papaya. Se determinó la influencia de dos medios de cultivo con diferentes concentraciones de ácido indol-3-butírico (AIB) sobre el enraizamiento in vitro y ex vitro de plantas de papaya transformadas. Además, se valoró la influencia de la aplicación del biopreparado de Trichoderma harzianum en su aclimatización. Se logró el enraizamiento in vitro de plantas de papaya transgénicas al utilizar 2 mg.l-1 de ácido indol-3-butírico en el medio de cultivo, así como el enraizamiento ex vitro con altos porcentajes de supervivencia. Se demostró la factibilidad de la aplicación del biopreparado de T. harzianum al sustrato, previo a la plantación, por su efecto estimulante.
Palabras clave: Carica papaya, ex vitro, in vitro, Trichoderma harzianum
ABSTRACT
The disease caused by Papaya ringspot virus is the most important in papaya worldwide. The use of biotechnological techniques, as auxiliary tools, has facilitated the genetic improvement in papaya. Nevertheless, this species has a lot of constraints, mainly during rooting and acclimatization phases. For that reason we developed the present work. The in vitro and ex vitro rooting was evaluated. Culture media with different concentrations of indol-3-butiric acid hormone were used in the in vitro rooting. The influence of Trichoderma harzianum bioproduct in the acclimatization of plants was also studied. The in vitro rooting of transgenic plants was achieved by applying 2 mg.l-1 of indol-3-butiric acid in the culture medium. The ex vitro rooting with high percentages of plants survival was also obtained. The applications of T. harzianum bioproduct on the substrate, previous to the plantation, demonstrated its stimulating effect.
Key words: Carica papaya, ex vitro, in vitro, Trichoderma harzianum
INTRODUCCION
El cultivo de la papaya (Carica papaya) está cobrando una mayor importancia económica a nivel mundial debido a que se puede consumir como fruta fresca o procesarse para obtener otros productos como dulces, jaleas, licuados y encurtidos, además, por su alto contenido de nutrientes. También posee un gran potencial de industrialización en el área farmacéutica, culinaria, médica, industria cervecera y bebidas no alcohólicas (Acuña, 2005).
El Virus de la mancha anular de la papaya (PRSV) es el causante de la enfermedad más importante del cultivo de la papaya en el mundo. Es un obstáculo para la producción de papaya de calidad exportable en las regiones productoras del mundo.
Se han desarrollado muchas estrategias de manejo, tanto del vector trasmisor de la enfermedad como del virus, que han resultado ineficientes. El manejo de la enfermedad con labores agrotécnicas de diversa índole no han logrado disminuir sus efectos. La obtención de plantas con resistencia al PRSV en papaya también ha sido un tema ampliamente trabajado. Sin embargo, la resistencia natural encontrada en especies silvestres de Carica no ha podido ser utilizada para cruzamientos con las variedades comerciales por su incompatibilidad. Igualmente, la protección cruzada con aislados atenuados tampoco ha sido viable por los elevados niveles de divergencia del virus en diferentes regiones geográficas (Thomas y Dodman, 1993; Tennant et al., 1994; Gonsalves, 1998; Rezende y Pacheco, 1998; Chen et al., 2001).
La creación de resistencia artificial ha rendido importantes resultados, lo cual ha contribuido significativamente a las expectativas de éxito en la lucha contra las virosis en papaya. Una de las principales estrategias seguidas para lograr resistencia al PRSV en el cultivo de la papaya han sido las que emplean la resistencia derivada del patógeno (Sanford y Johnston, 1985) mediante la introducción en el hospedero del gen de la proteína de la cápsida en sus diferentes variantes (Gonsalves, 1998; Tripathi et al., 2008). Para este fin ha sido necesario el empleo de las técnicas de cultivo de tejidos. Según Drew y Manshardt (1997) la multiplicación in vitro de la papaya solo se justifica económicamente si la misma se realiza para un genotipo híbrido. Uno de los grandes problemas que tiene esta metodología a nivel internacional es el alto nivel de contaminación in vitro cuando se emplean como explantes iniciales ápices o meristemos de plantas adultas cultivadas en campo (Brar y Khush, 1994; Wilson, 1996), además de las numerosas pérdidas de material vegetal que se producen en las fases de enraizamiento y aclimatización (Lucas, 2007). Posada et al. (2004) lograron establecer in vitro ápices de un híbrido de papaya (IBP-4299) y Gallardo et al. (2002) estudiaron las fases de multiplicación, enraizamiento y aclimatización para este material vegetal y propusieron una metodología para su micropropagación. Desde hace más de una década en el Instituto de Biotecnología de las Plantas se viene trabajando en la obtención de líneas transgénicas de papaya con resistencia al PRSV. Partiendo de estas experiencias y la necesidad de estudiar el desarrollo de estas fases en plantas transgénicas de papaya se desarrolló este trabajo que tuvo como objetivo: lograr su enraizamiento y aclimatización.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Para el enraizamiento y aclimatización se emplearon plantas de papaya variedad Maradol roja transformadas, que portaban una variante no traducible del gen de la proteína de la cápsida del PRSV. Para la transformación se empleó una pistola de genes de baja presión siguiendo la metodología propuesta por Mas et al. (2002). Las plantas estaban en fase de multiplicación y se encontraban en el 7mo u 8vo subcultivo.
Enraizamiento in vitro
Para determinar el medio de cultivo más adecuado para el enraizamiento in vitro de las plantas transgénicas de papaya se compararon dos medios de cultivo. Uno de los medios de cultivo utilizados fue el propuesto por Drew (1988) [medio de cultivo A] que contenía las sales Murashige y Skoog (MS) a la mitad de su concentración (Murashige y Skoog, 1962) y 2 mg.l-1 de ácido indol-3-butírico (AIB). El segundo medio de cultivo [medio de cultivo B] fue el recomendado por Posada (1995), quien utilizó también las sales MS a la mitad de su concentración y 5 mg.l-1 de AIB. Ambos medios de cultivo se solidificaron con Phytagel (Duchefa) 3.5 g.l-1. Cuando se utilizó el medio de cultivo A, las plantas in vitro se mantuvieron durante 20 días y en el medio de cultivo B, 10 días.
Se emplearon 20 frascos de vidrio por tratamiento, con capacidad de 250 ml y 30 ml de medio de cultivo y se ubicaron cinco plantas en cada uno a las que se les eliminó de 1-2 mm de la base del tallo para favorecer la emisión de las raíces (Drew y Miller, 1990; Kataoka e Inoue, 1991). Posteriormente, se transfirieron a un medio de cultivo MS sin regulador de crecimiento durante 20 días para la formación de raíces. Pasado este tiempo se realizaron evaluaciones de las siguientes variables: longitud de la raíz más larga (cm), número de raíces por planta, número de hojas por planta y plantas enraizadas (%).
Enraizamiento ex vitro
El enraizamiento ex vitro ha sido usado por Kataoka e Inoue (1991) con el objetivo de enraizar plantas de papaya debido a los altos costos de esta fase en el proceso de propagación in vitro. Basados en este hecho y en las experiencias de Posada (1995) quien utilizó 8 mg.l-1 de AIB en solución acuosa con este fin, se realizaron tres tratamientos donde se emplearon soluciones acuosas de AIB a las concentraciones de 0 (control), 5 y 8 mg.l-1.
Las plantas de papaya fueron lavadas en su base para eliminar los restos de Phytagel del medio de cultivo y se les eliminó de 1-2 mm de la base del tallo. Se colocaron en las soluciones de enraizamiento durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, fueron enjuagadas con agua desionizada estéril y trasladadas para su plantación inmediata en bandejas de polieturano de 70 alveolos (121 cm3 cada uno).
El sustrato empleado fue una mezcla de cachaza (40%), humus de lombriz (40%) y zeolita (20%) esterilizado en autoclave durante una hora a 121ºC y 1.5 atm de presión. Cada planta se cubrió con un frasco de vidrio transparente de 250 ml de capacidad para mantener la humedad relativa lo más próximo al 100% (Gallardo et al., 2002). Se efectuó un riego diario al sustrato sin retirar los frascos para evitar que el agua cayera sobre las plantas. Se programaron cuatro riegos diarios por aspersión (7 am, 11 am, 3 pm y 7 pm).
Se realizaron observaciones diarias. A los 15 días de plantadas se evaluaron las siguientes variables: longitud de la raíz más larga (cm), número de raíces por planta, número de hojas por planta, plantas enraizadas (%) y a los 30 días se evaluó la supervivencia (%).
Efecto de Trichoderma harzianum
El objetivo fue evaluar el efecto de la aplicación de un biopreparado de T. harzianum en la aclimatización de las plantas transgénicas de papaya. Se compararon las plantas de papaya aclimatizadas con la aplicación de T. harzianum y sin el empleo de este hongo antagonista.
El biopreparado fue obtenido en el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal de Villa Clara, con una concentración de 3.108 conidios.ml-1.
El tratamiento se realizó mediante la aplicación al sustrato de cada alveolo de 10 ml de una solución del biopreparado. La solución fue preparada mezclando un kilogramo del biopreparado en 10 l de agua deshionizada estéril (Stefanova, 2006).
Se sembraron 100 plantas por tratamiento en las mismas condiciones que en el experimento de enraizamiento ex vitro. Se empleó una solución acuosa de AIB (5 mg.l-1).
Las evaluaciones se realizaron a los 30 días de cultivo y se evaluó: longitud de la raíz más larga (cm), número de raíces por planta, número de hojas por planta, número de plantas enraizadas y número de plantas vivas (se expresó como porcentaje de supervivencia).
Procesamiento estadístico
Para el procesamiento estadístico de los resultados se realizó la prueba de ANOVA de clasificación simple para los efectos fijos. Para determinar los grupos homogéneos y/o significativamente diferentes a un nivel de 5% se utilizaron las pruebas de Tuckey, Mann Whitney y Kruskall Wallis.
El procesamiento estadístico de los datos se realizó con la ayuda del paquete estadístico computacional SPSS/PC versión 13.0 para Windows 2000.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Enraizamiento in vitro
Al comparar los medios de cultivo y realizar el análisis de los resultados de los tratamientos se comprobó que los mejores resultados el enraizamiento in vitro de las plantas transgénicas se alcanzaron con el tratamiento que emplea el medio de cultivo propuesto por Drew (1988) donde se obtuvo un 95% de plantas enraizadas (Tabla 1).
Se encontraron diferencias significativas en todas las variables evaluadas en los dos tratamientos. En el medio de cultivo propuesto por Drew (1988) se logró un mayor número de raíces por planta y raíces más largas, con medias de 3.24 y 1.97 respectivamente. Se observó geotropismo positivo.
Winnaar (1998) y Drew et al. (1991) obtuvieron buenos resultados con la aplicación de AIB para el enraizamiento de papaya in vitro, lo que lo convierte en el regulador de crecimiento muy usado para esta especie por su estabilidad, mayor espectro de acción y menor fotooxidación.
En cuanto al número de raíces por planta, los resultados concuerdan con los planteados por Rahaman et al. (1992), Islan et al. (1993) y Vianna (1996), lo que corroboró que el empleo de concentraciones más bajas del regulador de crecimiento, favorece la emisión de raíces. Taiz y Zeiger (2002) refirieron que altas concentraciones de auxinas no solo retarda el alargamiento celular sino que inhibe la formación de raíces. En relación con el largo de las raíces, los resultados se asemejan a los de Pires de Almeida et al. (2000) quienes lograron una media de 1.25 cm para esa concentración del regulador de crecimiento (2 mg.l-1).
Con el empleo del medio de cultivo propuesto por Posada (1995) se observó que el 63% de las plantas, a los 10 días de colocadas en el medio de cultivo sin el regulador del crecimiento, se mostraban cloróticas y con pérdida de las hojas por lo que fueron eliminadas. La abscisión de los órganos de las plantas es un fenómeno relacionado con el efecto de las auxinas (Taiz y Zeiger, 2002).
El aumento de la concentración de auxinas en el medio de cultivo provocó la caída de las hojas en las plantas cultivadas in vitro. Según Wächter et al. (1999) el incremento de este regulador del crecimiento produce un aumento de la síntesis de etileno, que conlleva a la abscisión de las hojas. Según Taiz y Zeiger (2002), las auxinas intervienen en la síntesis de etileno por su influencia en la formación de ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxilo sintasa. La transcripción de los genes encargados de la síntesis de esta proteína se ve favorecida por la aplicación exógena de auxinas en las plantas. El empleo de una alta concentración de AIB en el medio de cultivo debe influenciar en el desencadenamiento de este proceso. El etileno es una hormona gaseosa por lo que las condiciones de cultivo in vitro propician su acumulación dentro de los frascos de cultivo. El etileno activa la síntesis de clorofilasas (Taiz y Zeiger, 2002) lo que explica la apariencia adquirida por las plantas cultivadas en el medio de cultivo con mayor concentración del regulador de crecimiento. Ambas teorías apoyaron los resultados.
Solo el 37% de las plantas completaron el enraizamiento en medio de cultivo propuesto por Posada (1995) y no mostraban suficiente vigor para supervivir en la fase de aclimatización. La acción de los reguladores de crecimiento auxínicos en las raíces es similar a la acción que ejerce en los tallos, con la diferencia que la concentración estimuladora para el tallo es inhibitoria para la raíz. Se ha demostrado que la aplicación de altas concentraciones no solo retardan el alargamiento celular sino que inhiben la formación de raíces. A bajas concentraciones, estimula la formación de esbozos radiculares (Davies, 2004). Pires de Almeida et al. (2000) emplearon concentraciones de 1, 2 y 3 mg.l-1 de AIB para el enraizamiento in vitro de papaya y obtuvieron los mejores resultados con la concentración de 1 mg.l-1.
El número de hojas por planta, donde también existieron diferencias significativas entre los tratamientos es un parámetro que influye en el enraizamiento según los resultados de Drew (1988) y Reuveni et al. (1990) quienes obtuvieron más del 85% de plantas enraizadas empleando plantas con 3-5 hojas en crecimiento activo. Los resultados coinciden con lo planteado por Suksa et al. (1998) quienes lograron valores por encima de cuatro hojas solo con la adición de 2.0 mg.l-1 de AIB.
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La respuesta de las plantas en el tratamiento donde se emplea una menor concentración del regulador de crecimiento (2 mg.l-1), mostró mejores resultados en cuanto a las variables evaluadas. Se logró un 95% de plantas enraizadas y se obtuvieron plantas con mayor número de hojas, raíces y mayor longitud. Drew et al. (1991) plantearon que el AIB a esta concentración, tanto en medio de cultivo semisólido como líquido, estimuló conjuntamente con el contenido citoquinínico endógeno, un balance auxina-citoquinina favorable a los procesos de división, diferenciación y elongación celular. Pires de Almeida et al. (2000) (1-3 mg.l-1), Melo et al. (2001) (1mg.l-1) y Mosqueda et al. (2003) (2 mg.l-1) recomendaron la utilización de concentraciones bajas de AIB para especies lechosas de difícil enraizamiento como la papaya.
Enraizamiento ex vitro
Se logró el enraizamiento ex vitro de las líneas transgénicas con el empleo de AIB a las concentraciones de 5 y 8 mg.l-1 (Tabla 2).
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Se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos en los que se aplicó el regulador de crecimiento y el que no se aplicó en todas las variables evaluadas. Sin embargo, no existieron diferencias significativas entre las dos concentraciones del regulador de crecimiento empleadas en ningún caso.
Al evaluar el número de hojas por plantas, con las concentraciones de 5 y 8 mg.l-1 de AIB se obtuvo una media de 3.51 y 3.48 hojas por planta respectivamente, aspecto que repercutió al final del proceso. En el tratamiento sin la aplicación del regulador de crecimiento la media fue significativamente menor al evaluar este parámetro a los 15 días.
Las plantas que murieron a los 15 días en los tratamientos en los que se empleó el regulador, mostraban los esbozos radiculares. Grattapaglia y Machado (1998) plantearon el empleo de altas concentraciones de AIB para el enraizamiento ex vitro en especies donde esta fase del proceso es difícil, sin embargo, el empleo de 5 mg.l-1 fue suficiente para inducir el enraizamiento y alcanzar valores aceptables de plantas enraizadas así como su supervivencia.
La supervivencia de las plantas a las que no se les aplicó el regulador de crecimiento fue 0% a los 30 días. Este resultado demostró que es difícil que las plantas sin inducción del enraizamiento, logren la emisión de raíces y la supervivencia en condiciones ex vitro.
Los resultados reafirmaron lo planteado por Kataoka e Inoue (1991) sobre la factibilidad del empleo del enraizamiento ex vitro en la papaya, no solo por los altos costos del proceso in vitro sino, por la poca funcionalidad de las raíces obtenidas por esta vía.
El enraizamiento ex vitro puede representar un ahorro significativo por concepto de tiempo y reactivos. Según Orellana (1998) poder realizar esta fase ex vitro, representa una disminución entre el 20 y 25% de costos y un incremento de alrededor del 50% de la capacidad de las cámaras de cultivo in vitro. El desarrollo del enraizamiento en estas condiciones tiene ventajas tanto en la papaya como en otras especies propagadas mediante cultivo in vitro: a)
facilidad al manipular plantas sin raíces, b) el sistema de raíces producidas in vitro no siempre son funcionales, c) la posibilidad de dañar las raíces a la hora de extraerlas del frasco y durante la siembra es real, lo cual da la posibilidad para la penetración de patógenos y d) es más fácil y económico.
La aplicación del biopreparado de T. harzianum en el sustrato favoreció la aclimatización de las plantas transgénicas de papaya. Se pudo comprobar que el empleo de T. harzianum contribuyó de forma significativa a la adaptación a condiciones ex vitro de las plantas transgénicas de papaya (Tabla 3).
Se encontraron diferencias significativas entre ambos tratamientos, tanto en largo de las raíces como en el número de estas. Los resultados confirmaron lo planteado por Stefanova et al. (1999) y Stefanova (2006) quienes plantearon que este hongo antagonista actúa por medio de una combinación de competencia por nutrientes del sustrato, producción de metabolitos antifúngicos, enzimas hidrolíticas, micoparasitismo y además produce sustancias promotoras de crecimiento de las plantas por lo que su aplicación directa al suelo ofrece incluso una protección mayor a los cultivos.
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Los resultados confirman lo planteado por Herrera (1997) quien señaló a Trichoderma sp. como estimulador del crecimiento por el efecto que realiza sobre los procesos fisiológicos de la planta. Méndez (2006) planteó la influencia del T. harzianum en la absorción de nutrientes a través del mejoramiento y desarrollo radicular, aumentando la disponibilidad de nutrientes necesarios para la planta y como protector del sistema radicular del ataque de hongos patógenos y plagas.
Se comprobó la presencia de las hifas de T. harzianum en las raíces de las plantas de papaya mediante el empleo de un microscopio estereoscópico cuando se comparó con el control (sustrato donde no se había adicionado T. harzianum). Esta observación coincide con lo referido por Deacon (2006) que planteó que T. harzianum exhibe una fuerte competencia rizosférica, pues es capaz de colonizar todo el sistema radical y persistir durante todo el desarrollo del cultivo.
Stefanova et al. (1999) comprobaron que la forma más eficiente para su utilización sin duda es la transportación del bio-agente junto con el sustrato donde el mismo se encuentra previamente establecido como micobiota normal de la rizosfera. Este principio se aplica de manera efectiva a la tecnología de producción de postura en cepellones. La fase de aclimatización del proceso de micropropagación de plantas también ofrece la posibilidad de utilizar los beneficios de la aplicación de T. harzianum en cultivos que se propagan por esta vía.
CONCLUSIONES
Se logró el enraizamiento in vitro de plantas transgénicas de papaya al utilizar el medio de cultivo 2 mg.l-1 de AIB durante 20 días. A su vez, fue posible el enraizamiento ex vitro de plantas transgénicas de papaya mediante la inmersión de la base de las plantas en una solución de AIB a una concentración de 5 mg.l-1 e incrementar los porcentajes de supervivencia mediante la aplicación del biopreparado de T. harzianum al sustrato previo a la plantación.
AGRADECIMIENTOS
Los autores quieren agradecer la valiosa contribución de la Dra. Novisel Veitía (IBP) en el análisis estadístico de los resultados de esta investigación.
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