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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 7, No. 2: 67 - 79, abril - junio, 2007
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma vegetal
Leyanis García-Águila¹*, Manuel de Feria, Karen Acosta². *Autor para la correspondencia.
¹ Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Carretera a Camajuaní km. 5.5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: leyanis@ibp.co.cu
² Facultad de Ciencias Agropecuarias. Centro Universitario Vladimir I. Lenin. Las Tunas, Cuba.
RESUMEN
La conservación in vitro constituye parte esencial de la estrategia general de conservación y el intercambio de recursos genéticos en todo el mundo. Entre otras ventajas, ofrece la posibilidad de almacenar un gran número y variedad de muestras en un área reducida, además de garantizar la sanidad de las muestras e incrementa la posibilidad del intercambio de materiales vegetales. Existen dos métodos de conservación in vitro, cuya utilización varía en dependencia de la duración que requiera el almacenamiento. El método de crecimiento mínimo se emplea con más frecuencia para conservar durante un período de tiempo corto, mientras que la crioconservación garantiza la conservación in vitro por largos períodos de tiempo. En particular, la crioconservación ha sido aplicada en muchas especies para la conservación de polen, meristemos, ápices, embriones cigóticos, embriones somáticos y suspensiones celulares. Se reconocen dos grupos de técnicas en la crioconservación: las técnicas clásicas basadas en la deshidratación química parcial con el congelamiento programado y las técnicas basadas en la vitrificación con congelamiento rápido. Esta última técnica evita la formación de cristales de hielo en el interior de los tejidos, los cuales son los responsables del daño mecánico que se produce a las membranas celulares durante la congelación. Es por ello, que el éxito de la conservación in vitro se encuentra estrechamente relacionado con el período de tiempo requerido para el almacenamiento y con la adecuada selección del método de conservación. Este trabajo resume algunos aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma vegetal, así como los principales resultados descritos por la comunidad científica nacional e internacional en la conservación in vitro de diferentes especies vegetales.
Palabras clave: crecimiento mínimo, crioconservación, deshidratación, vitrificación
ABSTRACT
The in vitro conservation constitutes essential part of the general strategy for the conservation and the exchange of genetics resources in the entire world. It offers the possibility to store a great number and variety of samples in a reduced area. It guarantees the sanity of the samples and it increases the exchange of plant materials. Two conservation methods in vitro exist, whose use varies in dependence of the duration that requires the storage; the method of minimum growth is used with more frequency to conserve a little time, while, the cryopreservation guarantees the in vitro conservation for long periods of time. In particular, the cryopreservation has been applied in many species for the conservation of pollen, meristems, apexes, zygotic embryos, somatic embryos and cellular suspensions. Two groups of techniques in the cryopreservation are recognized: the classic techniques based on the partial chemical dehydration and the programmed freezing and the new techniques based on the vitrification that consist on the change from the liquid state to a vitreous denominated intermediate state and that it avoids the formation of glasses of ice responsible for the mechanical damage to the cellular membranes during the freezing. It is known that the membranes of the vegetable cells can be damaged by the action of different biophysical and biochemical factors and they need a special chemical protection during the cycle of freezing-unfreezing with treatments cryoprotectors with substances of a heterogeneous group of compounds that have great affinity for the water and that to certain concentrations they are not toxic. Some basic aspects of plant germplasm in vitro conservation and the main results decribed by the national and international scientific community about in vitro conservation of different plant species are sumarized in this research.
Key words: cryopreservation, dehydration, minimum growth, vitrification
INTRODUCCIÓN
La conservación de germoplasma vegetal como actividad científica fue propuesta en los años 70 del siglo XX con el objetivo de prevenir la erosión genética y mejorar la productividad agrícola de muchas especies a partir de la conservación de diferentes especies y genes de interés. Existen dos estrategias básicas para la conservación de germoplasma vegetal, la conservación in situ y la conservación ex situ (Nodarse et al., 1998).
En la conservación in situ las especies se mantienen en su hábitat natural, generalmente en parques nacionales, reservas biológicas y reservas ecológicas. Mientras que, en la conservación ex situ las especies se preservan fuera de su hábitat natural, en bancos de semillas botánicas, bancos de plantas en campo o en bancos de plantas in vitro.
Los bancos de semillas botánicas resultan de gran utilidad en especies que se propagan sexualmente y cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento, pero no deben aplicarse para conservar especies de plantas con semillas botánicas de corta supervivencia, ni pueden emplearse en caso de trabajar con plantas autoincompatibles, o plantas de propagación vegetativa obligada. En estos casos, la diversidad genética de estas especies se puede conservar mediante bancos de plantas en campo o mediante técnicas de conservación in vitro (Graudal et al., 1997).
Los bancos en condiciones de campo tienen como limitante que se necesitan grandes extensiones de tierra, los costos por mantenimientos asociados a las labores agrotécnicas son altos, se hace necesario controlar plagas y enfermedades y además son vulnerables a los desastres climáticos. Es por ello, que el desarrollo de nuevas técnicas de conservación, han permitido preservar mejor los recursos genéticos importantes para muchos países (Ortiz, 2000).
En particular, los avances alcanzados en el cultivo in vitro en diferentes especies vegetales dieron la posibilidad de desarrollar nuevas alternativa para la conservación ex situ, al permitir disponer de suficientes individuos en períodos de tiempo relativamente cortos y facilitar la manipulación del material vegetal al ser plantas con un desarrollo fisiológico homogéneo. Desde entonces, la conservación in vitro de germoplasma vegetal constituyó una herramienta de trabajo que apoyó la conservación de semillas botánicas y la conservación en campo, ya que permitió tener duplicados seguros de aquellos genotipos de particular interés (Engelmann y Takagi, 2000).
Esta vía de conservación puede efectuarse a través de dos métodos: el crecimiento mínimo y la crioconservación.
El método basado en el crecimiento mínimo es el más generalizado, se basa en modificar las condiciones óptimas de cultivo, para disminuir la velocidad de crecimiento normal de la especie objeto de estudio, con lo cual se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de cultivo fresco.
A mediados de los años 90 del siglo XX, la conservación de germoplasma vegetal implicó además, la inmersión directa de los explantes en nitrógeno líquido (crioconservación) y dentro de este método de conservación, el procedimiento de vitrificación demostró ser el más efectivo y empleado por muchos autores (Lambardi et al., 2000; Tsukazaki et al., 2000; Hirai y Sakai, 2003; Wang et al., 2004; Caccavale et al., 2005).
Teniendo en cuenta los aspectos anteriormente descritos este trabajo tuvo como objetivo mostrar a través de una descripción bibliográfica aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma vegetal, así como los principales resultados descritos por la comunidad científica nacional e internacional en la conservación in vitro de diferentes especies vegetales.
IMPORTANCIA DE LA CONSERVACIÓN IN VITRO DE GERMOPLASMA VEGETAL
La conservación in vitro constituye parte esencial de la estrategia general para la conservación y el intercambio de recursos fitogenéticos a nivel mundial. La misma ofrece la posibilidad de almacenar un elevado número y variedad de muestras en un área reducida y facilita el acceso a ellas para su evaluación. Sus condiciones asépticas garantizan mayor sanidad de las muestras y en consecuencia permiten incrementar el intercambio de materiales vegetales sanos. Sin embargo, para establecer cualquier estrategia de conservación in vitro, se hace indispensable el dominio de una metodología de propagación que garantice altos porcentajes de supervivencia.
El principal objetivo de los bancos de germoplasma in vitro es conservar las especies que presentan semillas botánicas de corta y poca viabilidad, cultivos de propagación vegetativa o clonal, o que son altamente heterocigóticos y requieren ser propagados vegetativamente para conservar su integridad genética. También se han incluido raíces y tubérculos de corta vida en el proceso de almacenamiento, como Solanum tuberosum L. (papa), Ipomoea batata L. (boniato) y Manihot esculenta Crantz (yuca) (Frankel, 1995).
Características fisiológicas de los tejidos vegetales para la conservación in vitro
El origen del material vegetal a conservar puede ser in vivo o in vitro, especialmente este último ofrece la ventaja de estar en condiciones asépticas, libres de microorganismos contaminantes (Dereuddre y Engelmann, 1987). Como regla general, debe ser escogido en estado juvenil. Las células meristemáticas en activa división son más resistentes a las bajas temperaturas por tener un tamaño pequeño, citoplasma denso y pocas vacuolas, razones por las cuales el contenido de agua intracelular es bajo, aspecto importante a tener en cuenta para evitar daños durante el proceso de congelación (Engelmann, 2000).
Las plantas cultivadas in vitro para ser conservadas deben haber sido objeto de un subcultivo reciente a medio de cultivo fresco. En este sentido, Harding y Staines (2001) expresaron que la susceptibilidad de los ápices de papa a la congelación aumentó a medida que las plantas in vitro tenían un mayor número de días de subcultivadas a medio de cultivo fresco.
MÉTODOS DE CONSERVACIÓN IN VITRO
Existen dos métodos de conservación in vitro cuya utilización varían en dependencia de la duración que requiera el almacenamiento.Para corto o mediano plazo el objetivo es reducir la velocidad de crecimiento del material vegetal, en este caso, puede ser empleado el método de crecimiento mínimo, por su parte la crioconservación garantiza la conservación in vitro por períodos prolongados de tiempo.
Método de crecimiento mínimo
El método de crecimiento mínimo ha sido ampliamente utilizado en la práctica para la conservación de germoplasma, existen varios ejemplos de su aplicación en la creación de bancos in vitro. Entre otros, se pueden mencionar los casos de Saccharum sp. (caña de azúcar) (Taylor y Dukin, 1993), yuca (Roca et al., 1994) y papa (Toledo y Golmirzaie, 1998).
Este método constituye una de las principales variantes que puede garantizar el éxito de un programa de conservación, debido a que es relativamente sencillo y puede ser establecido con facilidad con el equipamiento que normalmente existe en un laboratorio de cultivo de tejidos.
Para reducir la velocidad de crecimiento de las plantas in vitro es necesario alterar las condiciones óptimas de cultivo. Para ello se realizan modificaciones en la composición del medio de cultivo, como pueden ser la disminución del contenido mineral (Rayas et al., 2002), la adición de agentes osmóticos activos y/o la incorporación de retardadores de crecimiento (Espinosa et al., 2002).
Este método es conocido también como crecimiento reducido pues como se ha explicado se basa en la disminución de la división celular y el metabolismo de la planta. Tiene como objetivos incrementar la longevidad in vitro de los cultivos sin que se produzcan cambios genéticos, por tanto, no hay una detención total de los procesos celulares sino una disminución en la velocidad conque ocurren los mismos y así se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de cultivo fresco (Roca et al., 1994).
La modificación en la composición de los medios de cultivo es una forma de limitar el crecimiento, por ejemplo, el crecimiento in vitro de plantas de yuca disminuyó proporcionalmente con el contenido de nitrógeno total del medio de cultivo; concentraciones por debajo de 10mM, en término de número de tallos y nudos por tallos resultaron perjudiciales (Roca et al., 1994).
Autores como García et al. (2004) conservaron, con calidad y durante seis meses sin realizar subcultivos, plantas in vitro de caña de azúcar, con la reducción de las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) entre 25 y 50% de su concentración normal.
La limitación del crecimiento por efecto de la concentración osmótica se debe a la reducción de la adsorción de agua y nutrientes del medio de cultivo. La sacarosa como es altamente metabolizable, puede actuar como agente osmótico en concentraciones elevadas. Otros agentes osmóticos no metabolizables, como el manitol y el sorbitol, son más efectivos en la limitación del crecimiento, porque interactúan con el contenido de sacarosa y la temperatura de conservación (Bhat y Chandel, 1993).
Autores como Bertrand et al. (1992), estudiaron la respuesta de microesquejes de cafeto en presencia de diferentes concentraciones de sacarosa y su interacción con la temperatura, ellos observaron que las bajas concentraciones redujeron el crecimiento, enraizamiento y porcentaje de supervivencia, después de siete meses de conservados a 20 oC. Los mejores resultados los obtuvieron en un medio de cultivo que contenía como mínimo 20 g.l-1 de sacarosa y una temperatura para el crecimiento de 20 oC.
Por su parte, Panis et al. (1996) trabajando con Musa sp. indujeron la formación de brotes meristemáticos en presencia de altas concentraciones de 6-bencilaminopurina (6-BAP) y estas estructuras fueron más resistentes a las bajas temperaturas que los propios meristemos.
Suksa et al. (1997), lograron altos porcentajes de supervivencia en ápices in vitro de Carica papaya L. (papaya), después de 12 meses de conservación a 16 ºC y comprobaron que la adición 5.0 μM de ácido absícico al medio de cultivo influyó satisfactoriamente en la disminución del crecimiento de los ápices. Estos autores observaron además, una severa suculencia de los ápices de papaya conservados en medio de cultivo que contenía manitol y comprobaron que la adición de altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo no mejoró la resistencia de los ápices al frío.
De igual forma, García et al. (2004) redujeron el crecimiento en longitud de plantas in vitro de caña de azúcar con el incremento de la concentración de manitol en el medio de cultivo, de esta forma las plantas se pudieron conservar durante 12 meses consecutivos a una temperatura de 15 ºC.
Eventualmente en los cultivos conservados in vitro, debido a las bajas temperaturas, la alta concentración osmótica, la reducción de la concentración de sales inorgánicas y la presencia de inhibidores del crecimiento, se puede producir un oscurecimiento de los tejidos, seguido por desfoliación. Esto se atribuye a la oxidación fenólica y a la inducción de senescencia por la presencia de determinadas concentraciones de gases como el etileno, especialmente cuando se utilizan frascos pequeños o han sido sellados herméticamente. Roca et al. (1994), observaron una disminución de la desfoliación y una reducción de la tasa de crecimiento a la mitad, en dos variedades de yuca, al adicionar al medio de cultivo un 0.25% de carbón activado.
La intensidad y calidad de la luz, son otros factores importantes en el control de la velocidad de crecimiento, especialmente en su interacción con la temperatura, que como ya se ha expresado, es otro de los factores más utilizados en la conservación mediante el método de crecimiento mínimo.
Método de crioconservación
Para conservar a largo plazo se emplea la crioconservación (almacenamiento en nitrógeno líquido a -196 ºC), ya que se detienen todos los procesos metabólicos y la división celular, además, el material vegetal crioconservado se puede preserva en espacios reducidos, en condiciones seguras, sin variabilidad genética y sin grandes costos de mantenimiento (Hirai y Sakai, 2000).
Según Engelmann y Takagi (2000), se reconocen dos grupos de técnicas en la crioconservación: las técnicas clásicas basadas en la deshidratación química parcial con osmoprotectantes y congelamiento programado y las nuevas técnicas basadas en la vitrificación, que consisten en el cambio del estado líquido a un estado intermedio llamado vítreo que evita la formación de cristales de hielo, los cuales son la principal causa del daño mecánico a las membranas durante la congelación (Towill, 1996).
Dentro de estas nuevas técnicas se reconocen siete procedimientos que incluyen: encapsulación-deshidratación, vitrificación per se, encapsulación-vitrificación, desecación, precrecimiento, precrecimiento-desecación y técnica de la microgota (Engelmann, 2000).
La crioconservación en nitrógeno líquido, ha sido aplicada en muchas especies para la conservación de polen, meristemos, ápices, embriones cigóticos y somáticos, suspensiones celulares (Huarte y Rigato, 2001; Baek et al., 2003; Martínez et al., 2004; Keller et al., 2005; Ochatt, 2005).
Existen mecanismos que determinan cómo los sistemas biológicos responden ante la disminución de las temperaturas y la solidificación del agua líquida, por ello, es necesario conocer los aspectos básicos que tienen lugar durante la congelación del agua como evento decisivo para desarrollar una metodología de crioconservación. En este sentido, se destacan los procesos de nucleación y vitrificación.
Nucleación
Diferentes autores han realizado definiciones aclaratorias sobre los fenómenos que ocurren durante la formación de los cristales de hielo a bajas temperaturas. Por ejemplo, Zachariassen y Kristiansen (2000) explicaron que para ellos la definición de punto de congelación de una solución, es la temperatura donde el último y más pequeño cristal de hielo se derrite cuando una solución congelada se calienta lentamente, a este momento también se le denomina temperatura de congelación en equilibrio o punto de fusión.
Estos autores plantearon que el fenómeno por el cual las soluciones se encuentran aún en estado líquido a la temperatura de congelación en equilibrio se le conoce como subenfriamiento y la temperatura es denominada como punto de subenfriamiento de la solución. Además, diferencian que de manera no generalizada pueden aparecer cristales de hielo a determinada temperatura sin afectar el punto de fusión de la solución y denominan a este fenómeno como histéresis térmica y la temperatura a la que ocurre como punto de congelación de histéresis.
Otros autores como Belous et al. (1987) plantearon que existen diferencias entre los procesos de nucleación homogénea (formación espontánea de núcleos de cristales de hielo) y heterogénea (adición de algún catalizador para inducirlos). Zachariassen y Kristiansen (2000) apoyan estas diferencias y definen que la nucleación homogénea es causada por las propiedades de atracción electrostática entre las partes polares de las moléculas de agua para formar agregados en forma de cristales de hielo a medida que disminuye la temperatura y que la nucleación heterogénea es cuando la agregación de las moléculas de agua se cataliza por sustancias diferentes a estás moléculas.
Posteriormente, Wilson et al. (2003) se oponen a esta diferenciación y demostraron que la nucleación en las soluciones biológicas son todas heterogéneas y el término de nucleación homogénea debe ser evitado. Estos autores plantean que en la práctica la nucleación homogénea es poco probable de lograr en condiciones de laboratorio y solamente el término debe utilizarse en situaciones muy precisas como en el caso de pequeñas muestras de agua ultra-pura emulsionadas en aceite que tiene una temperatura alrededor de los -40 ºC.
Vitrificación
Cuando una solución está altamente concentrada y por ende viscosa, ésta no permitirá la iniciación de cristales de hielo ni su crecimiento. Si se disminuye rápidamente la temperatura a valores muy bajos, la solución puede llegar a convertirse en un sólido amorfo (vítreo) sin la formación de cristales de hielo (Franks, 2003). Este proceso se denomina vitrificación y tiene lugar a la temperatura de transición vítrea (Tg).
Para realizar la crioconservación mediante la vitrificación, Fahy et al. (2000) propusieron que se requiere de una congelación por debajo de la temperatura de transición vítrea de la mezcla crioprotectora y un recalentamiento sin la formación de hielo. Ellos plantean además, que el problema de la toxicidad del crioprotector se minimiza cuando se utiliza la menor concentración posible de la mezcla crioprotectora y que esta concentración mínima se determina por la concentración donde la temperatura de nucleación homogénea (Th) se intercepta con la temperatura de transición vítrea.
A concentraciones más bajas, la muestra debe atravesar la zona entre Th y Tg donde la nucleación homogénea del hielo es inevitable. A concentraciones altas, la vitrificación es teóricamente posible a cualquier velocidad de congelación o recalentamiento si la nucleación heterogénea no está presente.
Sin embargo, según Franks (2003), en la práctica la nucleación heterogénea siempre está presente como obstáculo a la vitrificación. Este autor explica, además, que después de la vitrificación se necesita una velocidad de calentamiento rápida para evitar el crecimiento de los cristales de hielo (desvitrificación) que comienza a temperaturas cercanas a la terminación de la congelación e inicio del recalentamiento.
El proceso de vitrificación es de gran importancia para la supervivencia de las células vegetales congeladas hasta -196 oC, ya que previene la formación intracelular de cristales de hielo. El sólido amorfo (vítreo) presenta una menor presión de vapor de agua que el correspondiente sólido cristalino, y no permite la sobre-deshidratación causada por la congelación extracelular. Como consecuencia, el sólido amorfo además disminuye la contracción celular, el aumento de la concentración de solutos internos y las alteraciones en el pH de la célula. Además, como la formación vítrea es muy viscosa, ésta puede detener todas las reacciones químicas que requiere una difusión molecular, de esta forma, la vitrificación de las células vegetales garantiza la dormancia y estabilidad durante el tiempo de almacenamiento en nitrógeno líquido (Franks, 2003).
Estrategia de deshidratación del material vegetal
Una metodología única de crioconservación que sea aplicable de manera exitosa para los diferentes tipos de tejidos vegetales aún no se ha desarrollado. Sakai (2000) distinguió cuatro estrategias posibles: I) deshidratación osmótica del material vegetal previa a la congelación; II) deshidratación del material vegetal por congelación lenta; III) deshidratación del material vegetal por vitrificación completa; IV) deshidratación del material vegetal por secado al aire. De las cuales, las más utilizadas se describen a continuación:
Estrategia de deshidratación del material vegetal por vitrificación completa
Se refiere a la formación tanto intracelular como extracelular de una estructura sólida amorfa estable (vítrea) cuando se someten las células a la temperatura del nitrógeno líquido (Sakai, 2000).
Ello se logra al deshidratar el material vegetal y de forma rápida por la acción de una solución vitrificadora altamente concentrada la temperatura del mismo se hace variar de 25 a 0 oC antes de colocar las muestras directamente en nitrógeno líquido. Las soluciones vitrificadoras no sólo reducen el contenido de agua en la célula sino que también penetran en los espacios intersticiales y contribuyen a inhibir la formación de los cristales de hielo en el medio intra y extra-celular durante el enfriamiento rápido (Panis, 1995). Sin embargo, el problema fundamental de la vitrificación completa radica en la necesidad de controlar la duración del tiempo de exposición a las soluciones vitrificadoras ya que pueden causar daños por una deshidratación excesiva o por toxicidad debido a una alta concentración de la misma (Reed, 2001).
Los primeros estudios sobre la crioconservación de plantas basada en la vitrificación completa fueron realizados por Uragami et al. (1989) con embriones somáticos de Asparagus officinalis L. y Langis et al. (1989) con suspensiones celulares de Brassica campestris. Desde entonces, la aplicación de esta estrategia ha permitido que hayan sido almacenados un elevado número de materiales vegetales como células nucleares de Citrus sinensis (Sakai et al., 1990) y protoplastos de Secale sereale (Langis y Steponkus, 1991), ápices vegetativos de Ananas comosus (piña) (González et al., 1998), yuca (Charoensub et al., 1999), boniato (Pennycooke y Towill, 2000) y Anigozanthos humilis (Turner et al., 2001), entre otros.
Diferentes soluciones vitrificadoras se han utilizado, pero la reconocida como Plant Vitrification Solution # 2 que contiene 30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de dimetilsulfóxido y 0.4 mol.l-1 de sacarosa ha sido la más empleada (Sakai, 2000).
Estrategia de deshidratación del material vegetal por congelación lenta
Se basa en la disminución de la temperatura mediante un enfriamiento lento hasta una temperatura de precongelación (-40 ºC), seguido de la inmersión rápida de las muestras en nitrógeno líquido (Sakai, 2000).
La reducción lenta de la temperatura durante el enfriamiento conduce a la deshidratación de las células por la aparición de cristales de hielo extracelulares, que causan la disminución del volumen celular isotónico y producen el incremento de la concentración de solutos.
Generalmente una velocidad entre 0.5-2.0 oC.min-1 se considera como lenta aunque en ocasiones velocidades tan bajas como 0.1oC.min-1 o tan rápidas como 10oC.min-1 también se aplican (Withers, 1980). Cuando se obtienen temperaturas entre -35 ó -40oC, el material vegetal se transfiere al nitrógeno líquido y se asume que en estas condiciones toda el agua congelable abandonó la célula y el medio intracelular está altamente concentrado (Sakai, 2000).
La principal limitante para aplicar la estrategia de deshidratación por congelación lenta en un gran número de laboratorios a nivel internacional radica en que se necesita un equipamiento programable de la velocidad de enfriamiento con un alto costo, por lo que los centros de investigación-desarrollo con escasos recursos no pueden utilizar esta modalidad criogénica (Reed et al., 2001).
Tratamientos crioprotectores
La mayoría de los tejidos vegetales hidratados necesitan una protección química especial durante el ciclo de congelación-descongelación, para ello se emplean tratamientos crioprotectores con sustancias de un grupo heterogéneo de compuestos que tienen gran afinidad por el agua y que a determinadas concentraciones no resultan tóxicos al sistema (Chen y Kartha, 1986). Estos tratamientos pueden aplicarse mediante pre-cultivos en base semisólida o líquida que sirven de medio de suspensión para las células y los tejidos durante la congelación.
Han sido descritas dos categorías de sustancias crioprotectoras: penetrantes y no penetrantes (Panis, 1995). En el primer grupo se encuentran el dimetilsulfóxido, metanol y el glicerol y en el segundo están presentes los azúcares, alcoholes azucarados y aditivos de alta masa molecular.
La aplicación de los crioprotectores penetrantes incrementa el volumen de la solución intracelular, evitan una excesiva concentración de electrólitos tóxicos en la fase no congelable o aumentan la permeabilidad de la membrana citoplasmática contribuyendo a la deshidratación. Adicionalmente, a los crioprotectores penetrantes se les atribuye la acción de disminuir el punto de fusión de la solución intracelular, factor decisivo para evitar la formación de cristales de hielo en el medio intracelular (Mazur, 1984).
Los compuestos no penetrantes actúan fundamentalmente como agentes osmóticos desde el medio externo y contribuyen a reducir la cantidad de agua intracelular que puede congelarse. Sin embargo, según Panis (1995), no existía una explicación convincente de cómo funcionaban las sustancias crioprotectoras o dónde se encontraban los sitios críticos de protección. Estas interrogantes aún no cuentan con respuestas comprobadas.
Generalmente, se han empleado con buenos resultados las mezclas de sustancias crioprotectoras. Esto se debe a las ventajas que ofrece la combinación de las sustancias clasificadas como penetrantes y las no penetrantes, como por ejemplo, la mayor estabilidad física de las mezclas a las bajas temperaturas en relación con la de un componente simple y la acción protectora ante la toxicidad de unos compuestos con respecto a otros (Kartha et al., 1988). Sin embargo, según Reed et al. (2001) hasta entonces, la selección del tipo y concentración de los agentes crioprotectores aún se realizaba de manera empírica en dependencia de la tolerancia de las células a crioconservar.
Descongelación
La descongelación es un proceso sencillo, pero está considerado como el paso más crítico durante la crioconservación. Mazur (1984) explicó que el objetivo fundamental es evitar la fusión de los microcristales de hielo formados durante la congelación, fenómeno conocido como re-cristalización. Si tal fusión llegara a ocurrir, entonces se podrían formar grandes cristales de hielo que dañarían la integridad celular.
Tratamientos de post-congelación
Se basan en cultivar el material vegetal descongelado en condiciones que permitan una correcta recuperación. En general, es importante tomar todas las medidas para recuperar la especie vegetal en cuestión en esta etapa del proceso, por ejemplo, incubar a niveles bajos de luz o en algunos casos en la completa oscuridad (Benson, 2000); atenuar el choque osmótico causado por una inmediata transferencia a un medio de cultivo con bajo potencial osmótico mediante la sucesiva transferencia a medios de cultivo con menos concentración de sacarosa (Schrijmakers y Van Iren, 1995); utilizar cambios de medio de cultivo semisólido a líquidos para mejorar el recrecimiento (Dussert et al., 1992) y eliminar progresivamente las sustancias crioprotectoras mediante lavados (Gnanapragasam y Vasil, 1992).
Se recomienda que posterior a la descongelación los explantes se cultiven sobre papel de filtro colocado en un medio de cultivo semisólido. Esto posibilita la transferencia simple del material vegetal hacia un medio de cultivo fresco y la lenta difusión de los crioprotectores, lo cual es beneficioso para la recuperación celular ya que evita un estrés osmótico (Withers, 1987).
Efecto del genotipo
Autores como Reed et al. (2001) plantearon que se necesita siempre tener en cuenta el factor genotipo para validar cualquier protocolo de crioconservación. Turner et al. (2001) demostraron que resultó eficiente utilizar primero una especie indicadora (en su caso Anigozanthos viridis que tenía un alto coeficiente de multiplicación in vitro) para mejorar un protocolo de crioconservación y después aplicarlo a otras especies relacionadas, pero clasificadas como material vegetal de gran valor. Engelmann (2000) explicó que en una metodología de crioconservación se debe tener en cuenta el genotipo y que existe un rango de temperatura en que la especie vegetal se puede conservar mejor y que sobre esa base podría ser conveniente mejorar la eficiencia del procedimiento para un genotipo élite, lo cual justificaría la realización de ajustes al protocolo de crioconservación.
CRIOCONSERVACIÓN DE ÁPICES
Método de vitrificación
El principio del método por vitrificación es deshidratar un ápice por la exposición de este a una solución de vitrificación con alto potencial osmótico (Wang y Deng, 2004). El método incluye básicamente los siguientes pasos: 1) Preparar y seleccionar los ápices; 2) precultivar los ápices para el desecado con agentes osmóticos; 3) tratamientos con soluciones con crioprotectores; 4) deshidratar por exposición a una solución de vitrificación con una disminución de la temperatura desde 25 hasta 0.0oC; 5) inmersión directamente en nitrógeno líquido y almacenaje; 6) descongelación rápida; 7) remover la solución de vitrificación y finalmente poner los ápices en condiciones apropiadas para su recuperación.
Este método ha sido descrito para la crioconservación de cultivos embriogénicos de especies de coníferas (Cyr, 2000; Häggman et al., 2000; Touchell et al., 2002).
Método de encapsulación-deshidratación
Este método se basa en la encapsulación del ápice para protegerlo y precultivarlo en un medio de cultivo enriquecido con agentes osmóticos lo cual lo hace más tolerante al desecado con aire (Wang et al., 2005).
El método consiste básicamente en: 1) preparar y seleccionar los ápices; 2) encapsular los ápices de brotes desecados en gotas de alginato; 3) precultivar en presencia de agentes osmóticos (sacarosa, sorbitol, glicerol, entre otros); 4) desecar en una cabina de flujo laminar o con sílica gel; 5) inmersión rápida en nitrógeno líquido y almacenar; 6) descongelación rápida y 7) colocar los ápices en condiciones apropiadas para su recuperación.
Este método ha sido aplicado para suspensiones celulares, embriones somáticos y ápices de numerosas especies vegetales de orígenes templado y tropical (Shibli et al., 2001).
Otros métodos desarrollados y aplicados con éxito
Existen otros métodos que a pesar de ser operacionalmente simples, han sido aplicados a un limitado número de casos para ápices de brotes. Ejemplo de ello es el método de precrecimiento-desecación descrito en Asparagus officinalis L. por Uragami et al. (1990) que consistió en: 1) Precultivo con agentes osmóticos, 2) deshidratado en cabina de flujo laminar, (3) inmersión directa en nitrógeno líquido, (4) descongelación rápida y 5) cultivo en condiciones apropiadas de recuperación, o el método mejorado por Escobar et al. (1997) para ápices de brotes de yuca que combinó además de los pasos anteriores, una lenta congelación en sustitución del tercer paso anteriormente descrito.
Con la aplicación de otros métodos como la encapsulación-vitrificación se han podido crioconservar brotes apicales de plantas in vitro de boniato (Pennycooke y Towill, 2001) y yuca (Danso y Ford, 2003; Charoensub et al., 2004). Otros autores como Wang et al. (2005) se han referido a este método de encapsulación-vitrificación como el procedimiento de mayores resultados en la crioconservación de brotes apicales in vitro para la especie Rubus idaeus L. (frambuesa) donde obtuvieron una alta supervivencia (85%) y regeneración (75%) de los brotes apicales crioconservados.
La papaya (Carica papaya L.)es uno de los cultivos en los que se han experimentado notables avances. Autores como Ashmore et al. (2000) desarrollaron técnicas y procedimientos para la conservación in vitro y crioconservación de brotes axilares y yemas apicales de plantas in vitro través de un simple protocolo de vitrificación. Igualmente, Buerhing (2003) desarrolló un protocolo de crioconservación para el suministro continuo de cultivos embriogénicos para realizar transformación genética y Wang et al. (2004) emplearon ápices de cuatro a seis semanas de cultivo de plantas in vitro de seis cultivares que fueron crioconservados con éxito también por vitrificación.
DETERMINACIONES ANALÍTICAS COMO INDICADORES DE LOS DAÑOS INDUCIDOS POR LA CRIOCONSERVACIÓN EN LAS MEMBRANAS CELULARES
Durante la crioconservación, las membranas celulares de las células vegetales pueden dañarse por la acción de diferentes factores (Leunufna y Keller, 2005) entre los que se encuentran la exposición de las células a las bajas temperaturas, la formación de cristales de hielo y una severa deshidratación durante la congelación. Además, puede ocurrir la formación de radicales libres, desacoplamiento metabólico y peroxidación lipídica.
Para todas las células, Mazur (1970) propuso la hipótesis de dos factores de daño por congelación basado en los efectos biofísicos de la formación de los cristales de hielo y en los efectos dinámicos de la velocidad de enfriamiento. Al utilizar una velocidad de enfriamiento rápida aparecen cristales de hielo intracelulares de un tamaño considerable que causan daños irreversibles y por lo tanto, constituyen el primer factor de esta hipótesis.
El segundo factor se atribuye a la deshidratación causada por la formación de los cristales de hielo. Si se emplea una velocidad lenta de enfriamiento, la formación de los cristales de hielo se induce primero en el compartimiento extracelular, el daño se atribuye entonces a una extrema deshidratación osmótica (también denominada efecto de solución), provocada por la salida del agua hacia el exterior de la célula para compensar el déficit de vapor que produce el evento de congelación (Steponkus y Webb, 1992).
La respuesta de las células a la congelación, depende de las propiedades de las membranas celulares. Los lípidos de las membranas sufren una transición de fase desde líquida-cristalina hasta gel. La coexistencia de ambas fases, en la estructura de las membranas, causa la pérdida de electrolitos y por lo tanto, las células mueren (Steponkus y Webb, 1992). Debido a que no todos los lípidos tienen la misma temperatura de transición de fase, la separación de las fases puede tener lugar, formando dominios ricos en fases en estado de gel.
Durante el calentamiento, estos dominios pasarán a formar estructuras no-lamelares, lo cual causa también la pérdida de electrolitos y la muerte celular (Quinn, 1985). Según Usami et al. (1995) durante la exposición a las bajas temperaturas, las proteínas de las membranas se pueden inactivar.
Una crioconservación exitosa durante una congelación lenta de las células vegetales con sustancias crioprotectoras puede ser posible, si se evita la formación del hielo en las células con la nucleación en el medio extra-celular. Sin embargo, las membranas pueden sufrir daños por las fuerzas mecánicas de los cristales de hielo en crecimiento y su adhesión a la superficie de las membranas (Grout, 1995).
La etapa de deshidratación es necesaria para evitar la formación de hielo intracelular, que provoca el aumento de la concentración de solutos en las células y una fuerte plasmólisis de éstas (Towill, 1990). Los problemas asociados a las plasmólisis aumentan durante la congelación, cuando las células se desplasmolizan. Por ejemplo, la contracción osmótica conlleva a la formación de vesículas endocitóticas, lo cual provoca la lisis celular durante la expansión osmótica debido a que el material membranoso no está disponible rápidamente para facilitar la desplasmólisis. También, las membranas pueden sufrir fusiones cuando están en contacto cercano durante la plasmólisis (Steponkus y Webb, 1992).
Eventos bioquímicos tales como la formación de radicales libres, desacoplamiento metabólico y peroxidación lipídica promueven varios cambios sub-letales como el desacoplamiento metabólico que conlleva a la producción de radicales libres tóxicos. Estas moléculas tienen electrones impares que causan daño por la extracción de electrones en macromoléculas esenciales como lípidos, proteínas y ácido desoxirribonucleico. El acoplamiento metabólico estable y una protección antioxidante eficiente, bajo condiciones fisiológicas normales para las células, aseguran que los daños por los radicales libres no ocurran (Dumet y Benson, 2000).
El estrés a que está sujeto el material vegetal durante la crioconservación puede promover la producción de radicales libres (Benson, 2000). Los más importantes son el radical hidroxilo, el radical superóxido y el peróxido de hidrógeno. Estos radicales libres atacan la fracción lipídica de las membranas, lo que trae como resultado la formación de los peróxidos de lípidos y éstos a su vez son inestables y forman productos tóxicos de la oxidación secundaria (Esterbauer et al., 1988). Los productos de la peroxidación lipídica son aldehídos muy citotóxicos, entre los más dañinos se encuentran el malondialdehido y el hidroxi-2-nonenal (Adams et al., 1999).
Existen evidencias que sugieren la presencia de los radicales libres mediados por el estrés oxidativo durante la aplicación de protocolos de crioconservación, desecación y manipulación en el cultivo de tejidos (Benson, 2000). Esto se ejemplifica por la detección indirecta (Benson y Dutra, 1988) y directa (Magill et al., 1994) de los radicales libres en células vegetales que han sufrido tratamientos de congelación, crioconservación y desecación. También, se han detectado productos de peroxidación lipídica secundaria en suspensiones celulares (Benson et al., 1995) y en tejidos estresados por el cultivo in vitro (Robertson et al., 1995).
Debido a la pérdida de agua, los componentes celulares se concentran y se convierten en agentes tóxicos, que coagulan o se precipitan. Varios trabajos sobre el estudio del comportamiento de las proteínas durante la deshidratación por la congelación convergen en que las enzimas solubles, las proteínas asociadas a la membrana y al citoesqueleto y las subunidades ribosomales se encuentran sujetas a cambios con el incremento de los solutos celulares (Guy, 1999).
Importancia de las técnicas analíticas para elucidar las bases biofísicas y bioquímicas de los daños inducidos por la crioconservación
Como se ha mencionado, los daños a la membrana durante la congelación-descongelación son numerosas; por lo tanto, un estudio mediante técnicas analíticas ayudaría a comprender y elucidar las bases biofísicas y bioquímicas de los daños inducidos por la crioconservación. Sin embargo, hasta la fecha las investigaciones realizadas no son numerosas y algunas que se ejecutaron son caras y complejas (Dumet y Benson, 2000) y tuvieron como objetivo detectar y visualizar en tiempo real los daños celulares, razón por la cual, la mayoría de las investigaciones solo hacen uso de técnicas analíticas indirectas.
Entre estas técnicas utilizadas para evaluar el efecto del estrés de la deshidratación y las bajas temperaturas, se encuentran la determinación de la pérdida de electrolitos (Sun, 1999), de la peroxidación lipídica (Ait Barka et al., 2000) y la de cambios en el metabolismo de las proteínas (Sun et al., 2002; Svensson et al., 2002).
La pérdida de electrolitos, se ha utilizado para estudiar la sensibilidad a la desecación y al frío en semillas botánicas poco viables de Quercus rubra (Sun, 1999). Además, se han usado para evaluar los daños en las membranas por las bajas temperaturas a diferentes genotipos de Coffea sp. (Scotti et al., 2003).
Los cambios de peroxidación lipídica por su parte, traen asociado la formación de aldehídos tóxicos durante una oxidación secundaria (Cassells y Curry, 2001; Gaspar et al., 2002). Entre los aldehídos más citotóxicos se encuentra el malondialdehído (Adams et al., 1999).
Otras investigaciones han involucrado también los cambios en el metabolismo de las proteínas, los cuales pueden resultar en la adquisición de tolerancia al proceso de crioconservación (Thierry et al., 1999; Watanabe et al., 1999). Además, se ha informado que las plantas poseen proteínas anticongelantes que son potentes inhibidores de los cristales de hielo (Clarke et al., 2002).
ESTABILIDAD GENÉTICA EN EL FENOTIPO DE MATERIALES VEGETALES CRIOCONSERVADOS
Harding (2004) manifestó que el concepto de estabilidad genética aún no tiene una correcta definición científica cuando se refiere a juzgar la estabilidad de las plantas después de la crioconservación. Este autor propone el término de Criobionómica a la ciencia biológica que estudia el comportamiento de los organismos crioconservados y su hábitat después de su reintroducción a las condiciones naturales del medio ambiente.
Esto se debe básicamente a que existe poca información sobre los efectos de la crioconservación en la estabilidad genética del material vegetal y las diferentes técnicas utilizadas para medirla poseen algunas limitaciones lo que hace muy difícil una evaluación acertada (Engelmann, 2000; Turner et al., 2001; Helliot et al., 2002a; Harding, 2004).
Además, Harding (2004) plantea que son necesarias las investigaciones sobre la estabilidad genética de las plantas regeneradas a partir del material vegetal crioconservado para que se inicien las bases aceptables de un consenso internacional donde sea aprobada su liberación y reintroducción en el medio ambiente y su uso en las diferentes aplicaciones tecnológicas.
Autores como Fukai et al. (1994) encontraron modificaciones fenotípicas que afectaron el color en las flores del crisantemo después de la regeneración de ápices crioconservados. Sin embargo, la mayoría de los estudios realizados indicaron que las plantas no presentaron cambios morfológicos después de la crioconservación.
De igual forma, plantas regeneradas in vitro a partir de ápices de plantas del género Prunus mostraron un desarrollo competente normal y crecieron iguales al progenitor (Helliot et al., 2002b).
En otras muchas especies como caña de azúcar (Paulet et al., 1993), cafeto (Dussert et al., 1998), papa (Benson et al., 1998), arroz (Al-Forkan et al., 2001), kiwi (Wu et al., 2001), uva (Zhao et al., 2001) y Eucalyptus (Blakesley y Kiernan, 2001), tampoco se han observado diferencias en el desarrollo de los caracteres morfológicos y agronómicos entre las plantas derivadas de un control no crioconservado y las obtenidas de ápices crioconservados.
Sin embargo, la mayoría de los estudios fenotípicos carecen de exámenes detallados cuando se comparan las plantas controles y las obtenidas del material vegetal crioconservado y se caracterizan como análisis cualitativos sin realizar análisis estadísticos de los aspectos morfológicos (Harding y Staines, 2001). La aplicación de estudios biométricos de conjunto con los caracteres fenotípicos se ha utilizado por pocos autores para evaluar las variaciones genéticas, aunque éstos son más indicadores de los cambios fenotípicos como resultado de las interacciones totales del genotipo y de los cambios temporales en la expresión génica (Harding, 2004).
CONCLUSIONES
La aplicación de diferentes métodos de conservación in vitro se ha convertido en una alternativa para la preservación de material vegetal con fines investigativos, para la propagación masiva de plantas e intercambio de germoplasma y han permitido el fomento y desarrollo de bancos de germoplasma in vitro que han tributado a la comunidad científica y al mantenimiento de una importante biodiversidad.
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