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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 7, No. 3: 155 - 159, julio-septiembre, 2007
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Establecimiento in vitro de yemas axilares de Bambusa vulgaris var Vittata
Yudith García-Ramírez1, Marisol Freire-Seijo1, Lillien Fajardo2, Marisol Tejeda1, Maritza Reyes1 *Autor para correspondencia
1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. e-mail: yudith@ibp.co.cu
2Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal y Medio Ambiente. Universidad de Granma. e. mail: lillien@udg.co.cu
RESUMEN
La micropropagación constituye una alternativa viable para la propagación del bambú, por el potencial que este tipo de planta posee para la construcción, desarrollo de artesanías y protección de suelos. Esta técnica es una alternativa para la propagación eficiente de plantas con alto valor genético y calidad. La presente investigación se desarrolló con el objetivo de lograr el establecimiento in vitro deBambusa vulgaris var. Vittata a partir de yemas axilares. Para la desinfección de las yemas axilares se emplearon tres concentraciones de Hipoclorito de Sodio (1.0, 2.0 y 3.0 %) y tres tiempos de desinfección (10, 15, 20 minutos). Los mayores porcentajes de yemas establecidas se obtuvieron al emplear Hipoclorito de sodio al 2.0% durante 20 minutos para la desinfección de las yemas. Entre el 86% y el 100% de las yemas brotaron y se obtuvo un 93.7 % de explantes libres de contaminantes microbianos visibles a partir de yemas axilares introducidas en condiciones in vitro.
Palabras clave: bambú, desinfección, hipoclorito de sodio
ABSTRACT
Micropropagation is a viable alternative for bamboo propagation due to the potentialities this type of plant has for building, handicrafts confection and soil protection. The technique is an efficient alternative to plants propagation with a high genetic value and quality. The current research was developed focused on the in vitro establishing of axillary buds of Bambusa vulgaris var. Vittata. Three concentrations of sodium hypochlorite (1.0, 2.0 and 3.0%) and three different times (10, 15, 20 minutes) were used for disinfection of axillary buds. The highest rates of established buds were achieved using sodium hypochlorite to 2.0% during 20 minutes for disinfection. Between 86% and 100% buds sprouted, and a 93.7% of explants free of visible microbial contaminants were obtained from axillary buds introduced to in vitro conditions.
Keywords: bamboo, disinfection, sodium hypochlorite
INTRODUCCIÓN
El bambú es un recurso natural que ha sido aprovechado por el hombre durante milenios por su rápido crecimiento, gran versatilidad y resistencia. Posee un gran valor ornamental y puede ser usado bajo diferentes aspectos como consolidación del suelo, reforestación, reducción del CO2, en la fabricación de mobiliario artesanal e industrial, extracción de celulosa, presenta un valor alimenticio a partir del follaje y presenta propiedades medicinales (Barbaro, 1997).
En Cuba, la distribución del Bambú se extiende en todo el territorio nacional mostrando gran adaptabilidad y potencial productivo en las provincias más orientales. Los cultivares de bambú más adaptados son Dendrocalamus asper, Guadua angustifolia Kuth, Gigantochloa verticilata entre otras, pero Bambusa vulgaris se conoce como la más adaptada y abundante en el territorio, especialmente en áreas con fuentes permanentes o temporales de agua. Esta es una especie eficaz en la protección de las aguas, cuando se utiliza como faja forestal hidrorreguladora y en forma de plantones (Anónimo, 2007).
La propagación convencional de bambú se hace por medio de semillas, secciones de culmos o de rizomas. En general, esta forma de propagación tiene varias desventajas entre las cuales se pueden citar una floración impredecible o muy espaciada en el tiempo, así como el alto costo (por mano de obra, espacio y transporte) y la baja eficiencia (número limitado de propágulos y baja tasa de multiplicación) (Gielis et al., 2001). La micropropagación constituye una alternativa viable para la propagación del bambú. La embriogénesis somática y la organogénesis a partir de yemas axilares han sido utilizados en la multiplicación in vitro de Bambusa vulgaris var. Vittata. Gielis et al. (1995) expresan la importancia del desarrollo de protocolos para la micropropagación de especies de bambú tales como: Dendrocalamus strictus, Dendrocalamus asper y Bambusa laucescens, con el fin de aprovechar el potencial que estos tipos de plantas poseen. La mayoría de los protocolos conocidos son en especies asiáticas (Saxena, 1990; Prutpongse y Gavinlertvana, 1992; Chang y Hung-Lan, 1995; Saxena y Dhawan, 1999) . Son pocos los trabajos que hacen alusión a la multiplicación in vitro de las especies americanas (Manzur, 1986; Ramanayake et al., 2001).
La presente investigación se realizó con el objetivo de establecer in vitro yemas axilares de Bambusa vulgaris var. Vittata como primer paso para desarrollar un protocolo para la propagación in vitro.
MATERIALES Y MÉTODOS
Fase preparativa o Fase 0
Para el establecimiento del banco de plantas donantes rejuvenecidas se colectó material vegetal de plantones de Bambusa vulgaris var. Vittata, ubicados en la región oriental de Cuba.
Se estableció un banco de plantas donantes en las casas de cultivo del Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP). Se realizó una fertilización diaria de fórmula completa empleando el fertilizante comercial Bayfolan ® Forte (25 ml.l-1). Con un régimen de riego de 81 segundos, cada cinco minutos.
El plan de manejo fitosanitario consistió en la aplicación combinada de fungicidas sistémicos y de contacto distribuidos de la siguiente manera:
1. Silvacurt
2. Mancosef + Cupraflow
La formulación de los productos químicos utilizados se relaciona más ampliamente en la tabla 1.
La aplicación de cada uno de las combinaciones de fungicidas se realizó cada tres días y fue repetido cada quince días.
Fase de establecimiento o fase 1
Influencia de la concentración del Hipoclorito de Sodio
Con objetivo de establecer in vitro yemas axilares se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de Hipoclorito de Sodio (NaClO) en su desinfección.
Se emplearon yemas axilares rejuvenecidas de plantas de Bambusa vulgaris var. Vittata. Para cortar las yemas se empleó una tijera de poda. Se cortó a ambos lados de la yema 1.5cm del tallo .Solamente se tomaron aquellas yemas axilares que estaban bien diferenciadas y se colocaron en un frasco con agua para ser llevadas al laboratorio.
Posteriormente, las yemas fueron lavadas con agua corriente por tres horas, seguidamente, se sumergieron en etanol (70.0%) durante tres minutos. Luego de enjuagarlas tres veces con agua destilada estéril estas fueron colocados en una solución de NaClO a diferentes concentraciones (1.0, 2.0 y 3.0%) durante 20 min, posteriormente se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril.
Al concluir la desinfección se eliminaron los extremos dañados de cada sección de tallo que contenía la yema axilar. Cada explante (yema axilar) se colocó individualmente en tubos de ensayo (20 x 1.5 cm) que contenían 5ml de medio de cultivo compuesto por las sales y vitaminas propuestas por Murashige y Skoog (1962), con 0.2 mg.l-1 de 6-bencilaminopurina (6-BAP), 100 mg.l-1 de mio-inositol, 30 g.l-1 de sacarosa, se empleó como gelificante Gelrite® (SIGMA), en concentración de 2.5 g.l-1.
El pH del medio de cultivo fue ajustado a 5.7±1 con el uso de HCl y KOH, previo a la esterilización. Se colocaron cinco semillas por frasco de cultivo y cada uno contenía 5ml de medio de cultivo.
Los frascos de cultivo fueron colocados en cámaras de crecimiento de luz solar donde la densidad de flujo de fotones fotosintéticos (DFFF) osciló entre 48.0-62.5 μmol.m-2 s-1 y una temperatura de 27± 2º C.
A los ocho días se realizaron las evaluaciones para determinar la influencia de la concentración del NaClO en los siguientes aspectos:
· Número de yemas libres de contaminantes microbianos (Porcentaje de explantes sin contaminación fúngica y bacteriana visible).
· Número de yemas brotadas (Porcentaje de brotación de las yemas).
Todo el proceso estadístico fue realizado a través del paquete estadístico computacional Statgraphics 4.1. Se realizaron pruebas de análisis de varianza de clasificación simple, previa comprobación de los supuestos de homogeneidad de varianza y normalidad y las tablas de contingencias (crosstab) con sus respectivos parámetros para las variables de niveles de medición discretos (LSD), comparación de proporciones y prueba de hipótesis.
Influencia del tiempo de desinfección
El objetivo en este experimento fue determinar la influencia en el establecimiento del tiempo de inmersión de los explantes en NaClO.
La selección de yemas y la desinfección, se realizó tal como se describió en el experimento anterior con la concentración de mejores resultados. Se aplicaron tres tiempos de inmersión (10, 15, 20 minutos), posteriormente se enjuagaron tres veces las yemas con agua destilada estéril.
Las evaluaciones y el procesamiento estadísticos fueron realizadas tal como se describió en el experimento anterior.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia de la concentración del Hipoclorito de Sodio
La brotación de las yemas axilares se inició a los cinco días de cultivo. Los resultados de este experimento indicaron que el mayor porcentaje de brotación se alcanzó en el tratamiento donde se empleó NaClO al 1.0% (88.0%) con diferencias estadísticas respecto al resto de los tratamientos. El mayor porcentaje de yemas libres de de microorganismos contaminantes visibles (93.7%) se obtuvo en el tratamiento donde se empleó hipoclorito de sodio al 3.0% con diferencias significativas con el resto (Tabla 2).
Este comportamiento pudo estar dado por la utilización de una menor concentración de NaClO, que provocó menor daño de los tejidos de los explantes durante la desinfección,ya que mayores concentraciones de NaClO, pudieron haber tenido un efecto tóxico.
El hipoclorito de sodio es uno de los desinfectantes más comúnmente utilizados en la desinfección superficial de los tejidos vegetales, y resulta importante determinar la concentración con la cual se garantiza el control de los microorganismos contaminantes y la supervivencia de los tejidos del explantes (Castillo et al., 1997).
Influencia del tiempo de desinfección
En cuanto al tiempo de inmersión del material vegetal en la solución de hipoclorito de sodio se observó una disminución de la brotación de yemas en la misma medida que se aumentó el tiempo de desinfección. El mayor porcentaje de brotación de las yemas axilares se alcanzó con la disminución del tiempo de desinfección a diez minutos con un 100% de yemas brotadas, sin diferencias estadísticas con el resto de los tratamientos. La brotación de las yemas se inició entre los 10 y 20 días de cultivo, en cada explante las yemas se encuentran en óptimas condiciones fisiológicas, para alcanzar la brotación in vitro como se muestra en las figuras 1 y 2.
El mayor porcentaje de explantes libres de contaminantes se obtuvo con el tratamiento donde se emplearon 20 minutos de tiempo de desinfección (88.0%) con diferencias estadísticas con el resto de los tratamientos donde se emplearon 10 y 15 minutos de tiempo de desinfección (Tabla 3).
Los resultados coinciden con los descritos por Nidiye et al. (2006) quienes obtuvieron entre un 80100% de yemas brotadas en diferentes medios de cultivo para Bambusa vulgaris. Marulanda et al. (2005) para la especie de Guadua angustifolia Kuth informaron resultados al emplear HgCl2 al 0.3% y obtuvieron un 74.0% de yemas brotadas para 10 minutos de tiempo de desinfección y un 52.0% de yemas brotadas para 5 minutos. Además, al emplear NaClO a una concentración del 2.0% alcanzaron un 12.9% y un 11.0% de yemas brotadas.
Resultados similares fueron obtenidos por Andrade (1998), quien utilizó como desinfectante NaClO a una concentración de 1.0% durante 10 minutos para la desinfección de yemas axilares de Guadua angustifolia Kunth.
En otras especies de bambúes como: Dendrocalamus strictus, Bambusa arundinacea, Dendrocalamus asier, Phyllostachys edulis, Dendrocalamus giganteus y Bambusa polymorfa,
para la desinfección se han obtenido los mejores resultados al emplear hipoclorito de sodio 0.1% durante 5 min, combinándose con inmersión en Bicloruro de mercurio (0.1%), durante 5 min (ICFRE, 2002).
En diferentes especies de bambú se han informado altos porcentajes de establecimiento. Por ejemplo, Ravikumar y Ananthakrishnan (1998) obtuvieron entre un 85-90% de brotes a partir de yemas axilares de plantas adultas de Dendrocalamus strictus. Por su parte, Ramanayake et al. (2001) alcanzaron un 77.5% de plantas in vitro a partir de yemas axilares de Dendrocalamus giganteus.
Nadgaudar et al. (1997) obtuvieron un 70% de plantas a partir de yemas axilares de Bambusa arundinacea y Das y Pal (2000) obtuvieron una rápida propagación in vitro para la especie de Bambusa vulgaris empleando medios de cultivo líquido para las diferentes fases.
De igual forma, Arya (2002) obtuvo múltiples brotes de Dendrocalamus asper a partir de yemas axilares y Malay y Amita (2005) describieron la formación de brotes múltiples con el empleo de medio de cultivo líquido a partir de yemas axilares de Bambusa balcooa.
CONCLUSIONES
Fue posible establecer in vitro yemas axilares de Bambusa vulgaris var. Vittata con altos porcentajes de yemas establecidas (86.6-100%) al emplear hipoclorito de sodio al 2.0% durante 20 minutos para la desinfección.
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