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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 7, No. 3: 187 - 190, julio-septiembre, 2007
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Evaluación del efecto del aceite esencial de Cymbopogon nardus para el control de microorganismos contaminantes del cultivo in vitro de plantas
Cynthia Sánchez-García1*, Mileidy Cruz-Martín1, Yelenys Alvarado-Capó1, Misleidy Pérez2, Mildrey Medinilla2, Mayra Acosta-Suárez1, Michel Leiva-Mora1, Berkys Roque1. *Autor para correspondencia
¹ Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Carretera a Camajuaní km. 5.5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: cynthia@ibp.co.cu
2Kurhotel Escambray. Topes de Collantes, Sancti Spíritus. Cuba
RESUMEN
La contaminación microbiana es uno de los problemas que más afecta en la micropropagación de especies vegetales en el mundo, es por eso que se buscan nuevas alternativas a partir de productos naturales, con el fin de sustituir o atenuar el uso de compuestos químicos, empleados frecuentemente para el control de microorganismos. Los aceites esenciales de plantas aromáticas han mostrado un amplio espectro de actividad contra microorganismos. Por ejemplo, el aceite esencial de Citronela que se extrae de las hojas y el tallo de la planta Cymbopogon nardus, posee propiedades antisépticas, desodorantes, insecticidas y estimulantes. En este trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana del aceite esencial de C. nardus frente a cepas de hongos y de bacterias aisladas del cultivo in vitro de especies vegetales; mediante los métodos de Difusión en Agar y Dilución en Agar. Con este último se determinó la Mínima Concentración Inhibitoria (MCI). El aceite esencial inhibió el crecimiento del 100% de las cepas de hongos y bacterias analizadas. El 75% de la cepas bacterianas fue controlada a una concentración de 0.03% del aceite. Estos resultados pueden constituir un punto de partida en el desarrollo de estrategias para el control de microorganismos contaminantes frecuentes del cultivo in vitro de plantas.
Palabras clave: actividad antibacteriana, actividad antifúngica, aceite de Citronela, productos naturales
ABSTRACT
Microbial contamination is one of the main problems faced in the micropropagation of plant species in the world. New alternatives are being looked for the use of natural products to substitute or to attenuate the frequent use of chemical compounds. Essential oils from several aromatic plants have shown a wide spectrum activity to microorganisms. Essential oil from leaves and stem of Cymbopogon nardus is a volatile oil with antiseptics, deodorants, insecticidal, tonics and stimulants properties. C. nardus essential oil was tested for antimicrobial activity against fungi and bacteria isolated from in vitro plant culture by using disc- diffusion and agar dilution by Minimal Inhibitory Concentration (MIC) assays. The essential oil inhibited 100% of microbial growth of fungi and bacteria strains tested. A 0.03% concentration of the essential oil controlled 75% of bacterial strains. These results could be a valuable alternative solution to control contaminant microorganism for in vitro plants culture.
Key words: antibacterial activity, antifungal activity, citronella oil, natural products
INTRODUCCIÓN
La contaminación microbiana es uno de los problemas más graves en la propagación in vitro de especies vegetales en el mundo, ya que produce cuantiosas pérdidas de material vegetal tanto en la micropropagación comercial como en los trabajos de investigación. Los contaminantes más frecuentes in vitro son los hongos, bacterias y levaduras, que en muchos casos no son patógenos en condiciones de campo (Herman, 1987).
Se han establecido numerosos procedimientos tecnológicos para controlar o disminuir la presencia de contaminantes y el empleo de productos químicos (fungicidas y antibióticos) ha constituido una vía rápida tanto para atenuar como para eliminar estos microorganismos (Carrazana et al., 1997). Con el fin de atenuar el uso de estos compuestos y sus consecuentes efectos negativos, se buscan nuevas alternativas sobre la base de productos naturales.
Se cree que la producción de aceites esenciales por las plantas está fundamentalmente justificada como un mecanismo de defensa contra los patógenos y plagas (Oxenham, 2003) y han mostrado un amplio espectro de actividad contra microorganismos patógenos de plantas y humanos (Qamar y Choudhary, 1991).
Por ejemplo, el aceite esencial de Cymbopogon nardus que es extraído de las hojas y el tallo de la planta, es un aceite volátil con propiedades antisépticas, desodorantes, insecticidas, tónicas y estimulantes (Shahi y Tava, 1993).
Se ha demostrado que aceites esenciales de plantas del género Cymbopogon, poseen propiedades antimicrobianas, incluyendo a C. nardus (Saikia et al., 2001), es por eso que este trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de C. nardus para el control de microorganismos contaminantes, aislados del cultivo in vitro de especies vegetales.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron microorganismos procedentes de la colección de cultivos microbianos del Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP). Hongos: Penicillium sp.(CCIBP-Pen18), Aspergillus niger (CCIBP-Asp10) , Aspergillus sp. (CCIBP-Asp11), Helmintosporium sp. (CCIBP-Hel1), Rhizopus sp. (CCIBP-Rhi 1) Bacterias: Proteus vulgaris (ATCC 25923), Pseudomonas stuzeri (CCIBP-CC2), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922), Bacillus pumilus (CCIBP-Sp53), Corynebacterium sp. (CCIBP-Sp100) y Staphylococcus aureus ( ATCC 25923).
Se empleó el aceite esencial de Citronela puro, suministrado por el Laboratorio de Plantas Medicinales, Kurhotel Escambray, Topes de Collantes, Sancti Spíritus, Cuba, el cual se esterilizó el aceite por filtración con membranas de 0.45 μm.
Las diluciones del aceite esencial en alcohol al 75% se prepararon a partir de una concentración del 100%.
Para ambos ensayos de actividad antimicrobiana se utilizó medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) para hongos y Agar de Muller- Milton (AMH) para las bacterias.
Se evaluó la actividad antimicrobiana del aceite de Citronela mediante el método de Difusión en Agar (Bauer et al., 1966). Para ello se empleó una suspensión conidial a una concentración aproximada de 106 ufc x ml-1 para el caso de los hongos y 2x108ufcxml-1 para las bacterias. Se sembraron placas de Petri de 90 mm de diámetro que contenían 20 ml de medio de cultivo. Se agregaron 5 μl de cada solución (aceite puro, aceite diluido, alcohol al 75% y agua estéril) a discos de papel de filtro Whatman 1 de 5 mm y se colocaron en la superficie de la placa de Petri, con ayuda de una pinza y se incubaron a 28 ºC durante 7-14 días en el caso de los hongos y a 30 ºC durante 7 días en el caso de las bacterias. Se realizaron tres réplicas de cada cepa. Además se incluyeron placas con medio de cultivo, libres del aceite de Citronella y con alcohol al 75% como controles de crecimiento. Se utilizaron como controles positivos Higromicina B (Sigma) (50 μg/ml) frente a los hongos y Ampicilina (Sigma) (50 μg.ml-1) frente a las bacterias.
La evaluación se realizó a partir de los 7 hasta los 14 días en el caso de los hongos y a partir de las 24h hasta los 7 días para las bacterias. Se midió el valor del diámetro del halo o zona de inhibición en milímetros, restándole el diámetro del disco de papel de filtro (5mm.)
Para el ensayo de Dilución en Agar, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (MCI), empleando el método de las diluciones dobles seriadas (Jorgensen et al., 1993). Se ensayaron concentraciones decrecientes del aceite de Citronela en diluciones dobles seriadas en alcohol al 75% partiendo de una concentración del 100%, siguiendo el esquema que incluye una dilución final del aceite en el medio de cultivo de 1:10. Además, se incluyeron placas de Petri con medio de cultivo, libres del aceite de Citronela y con alcohol al 75%, como controles de crecimiento.
Para el caso de los hongos se colocó en el centro de cada placa de Petri de 50 mm de diámetro, un disco de micelio de 7 mm de diámetro proveniente de colonias crecidas durante 7-14 días. Se realizaron tres réplicas de cada concentración. Las mismas se incubaron a 28ºC y oscuridad constante durante 14 días. Las evaluaciones se realizaron a partir de las 72 horas.
En el caso de las bacterias se seleccionaron de 2 a 3 colonias aisladas de un cultivo, crecido en placa a 30°C por 18-24 h. La turbidez de la suspensión bacteriana se ajustó por comparación óptica con el tubo 0.5 de la escala de Mc. Farland (aprox. 1-2x108ufc ml-1). De los inóculos preparados se tomaron 3.5 μl y se depositaron en pocillos sobre la superficie del agar con una pipeta (Gilson). Se incubaron a 30ºC en la oscuridad durante 48 h. Las evaluaciones se realizaron a las 24 y 48h. En ellas se comprobó el crecimiento bacteriano en los controles.
En ambos casos las placas se colocaron sobre una superficie que no reflejara la luz y se determinó la menor concentración del aceite esencial que inhibió completamente el crecimiento microbiano en cada caso, la cual fue tomada como la MCI.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El aceite esencial de Citronela mostró actividad antimicrobiana frente a los hongos y bacterias seleccionadas, expresada en la capacidad de inhibir el crecimiento de las cepas a las concentraciones probadas. Esta sustancia inhibió el crecimiento de todas las cepas de hongos filamentosos utilizadas. El valor del halo de inhibición y MCI para cada cepa se muestra en la tabla 1.
Según Osorio y Suárez (1999) los hongos filamentosos constituyen un problema serio en cuanto a las pérdidas que ocasionan en el cultivo in vitro de plantas. Los géneros Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Curvularia, Fusarium y Chaetomium han sido descritos por George (1993) y por Leifert et al. (1994) como los contaminantes fúngicos más comúnmente introducidos al cultivo de tejidos.
En este trabajo se obtuvo una valor del diámetro del halo de inhibición de Aspergillus niger frente al aceite puro de 9 mm, el cual fue semejante al obtenido por Saikia et al. (2001), que fue de 8 mm en condiciones similares.
Shimoni et al. (1993) encontraron que una gran cantidad de aceites esenciales de plantas tales como: Syiriaca Majorana, Satureja timbra, Micromeria fructicosa y Salvia triloba exhibieron actividad antifúngica in vitro contra varios hongos patógenos.
Por su parte, Cruz-Martín et al. (2002) evaluaron concentraciones de 512 mg.l-1 (p/v) del complejo Carbendazim -Ciclodextrina que fue eficaz para el control in vitro de los géneros Aspergillus, Penicillium, Spicaria, Chaetomium, Trichoderma, Fusarium, Pestalotia y Colletotrichum. Estos mismos autores demostraron que esta concentración del complejo no controló los géneros Curvularia, Cladosporium, Helminthosporium, Oidiodendron, Rhizopus y Monilia. Sin embargo, el aceite de Citronela inhibió el crecimiento de las cepas de Helmintosporium sp. y de Rhizopus sp. a una concentración del 2.5%.
Se comprobó que el aceite de Citronela inhibió el crecimiento de 100% de las cepas bacterianas. El valor de la zona de inhibición y MCI para cada cepa se muestra en la tabla 1.
Este aceite resultó más eficaz para el control de las bacterias que de los hongos. El crecimiento del 75% de las cepas bacterianas fue inhibido a una concentración del 0.03% de aceite esencial.
Otros autores han informado sobre el efecto antibacteriano del aceite esencial de especies de Cymbopogon. Entre estos, Lemos et al. (1990) encontraron una actividad potente del aceite esencial de Cymbopogon citratus frente a B. subtilis, S. aureus, mientras que frente a E. coli y P. aeruginosa fue muy baja. Sin embargo, en este estudio el aceite esencial de Cymbopogon nardus mostró actividad frente a E. coli y P. aeruginosa a bajas concentraciones (2.5% y 0.03%, respectivamente).
El aceite de Citronella es un aceite esencial muy explotado comercialmente y su forma de obtención y composición química son bien conocidas, por lo que estos resultados pueden constituir una alternativa para el control de la contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas.
REFERENCIAS
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Cruz-Martín, M, Acosta Suárez M, Leiva-Mora M, Alvarado Capó Y, Lezcano M (2002) Evaluación del complejo Carbendazim-âCiclodextrina para el control de hongos filamentosos contaminantes del cultivo in vitro de plantas. Biotecnología Vegetal 2 (2): 73-76
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