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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 7, No. 4: 199 - 203, octubre - diciembre, 2007
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Influencia del aislado en la fitotoxicidad del filtrado del cultivo de Alternaria solani Sor. sobre plantas de papa var. Desirée
N. Veitía, I. Bermúdez-Caraballoso, L. R. García, M. Acosta-Suárez, Y. Alvarado-Capó, D. Torres, Y. Padrón. *Autor para correspondencia.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5 . Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e.mail: novisel@ibp.co.cu
RESUMEN
Con el objetivo de evaluar la influencia del aislado en la fitotoxicidad del filtrado del cultivo de Alternaria solani Sor., se estudió el crecimiento en medio de cultivo PDA de seis aislados de A. solani provenientes de la colección de cultivos microbianos del IBP así como, la fitotoxicidad del filtrado del cultivo de cada uno de estos aislados sobre plantas de papa var. Desirée cultivadas in vitro. Los resultados mostraron que el filtrado de cultivo de los seis aislados fue fitotóxico sobre las plantas de papa var. Desireé cultivadas in vitro. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas en los grados de afectación provocados por los filtrados del cultivo de cada aislado sobre las plantas de dicho genotipo. Estos resultados confirmaron la influencia del aislado en la producción del filtrado del cultivo de A. solani. Sobre esta base se seleccionó el aislado CCIBP-Vas4, ya que provocó los mayores valores en el grado de afectación. Por otro lado no se encontró correspondencia con el crecimiento in vitro de los aislados y la fitotoxicidad de sus filtrados del cultivo.
Palabra clave: hongo, selección in vitro, Solanum tuberosum L.
ABSTRACT
Growth in a PDA medium of six isolate of A. solani, coming from the microbial cultivation collection of the IBP, and the phytotoxic of culture filtrate of each one were studied to evaluate the influence of isolate in the culture filtrate phytotoxity of A. solani. Results showed that the six isolates were phytotoxic on potato plantlets var. Desireé. However, significant differences were observed in the degree of affectation caused by culture filtrates of each isolate on plants of this genotype. These results confirmed the influence of isolate in the production of culture filtrates of A. solani. Isolate CCIBP-Vas4 was selected based on the results, since it caused the highest degrees of affectation. Besides, no correspondence among isolates in vitro growth and phytotoxicity of culture filtrates on potato plantlets var. Desirée were found.
Keywords: fungus, in vitro selection, Solanum tuberosum L.
INTRODUCCIÓN
El tizón temprano en la papa (Solanum tuberosum L.), causado por el hongo Alternaria solani Sor., constituye desde el punto de vista económico la enfermedad más importante en Cuba (Castellanos, 2000). La aplicación de fungicidas es el principal método de control de esta enfermedad, empleado en el mundo (Gent y Schwartz, 2003). Es por ello, que el uso de variedades resistentes podría reducir el número de aplicaciones continuas de estos productos químicos mientras mantienen el control de la enfermedad (Rodríguez et al., 2006).
En la interacción papa-Alternaria solani Sor. varios métodos han sido utilizados para evaluar la resistencia de diferentes genotipos, tales como: pruebas en campo y en casa de cultivo en plantas completas y en hojas arrancadas (Bussey, 1991; Steward y Bradshaw, 1993) así como otros ensayos con las toxinas o los filtrados del cultivo de A. solani (Lynch et al., 1991; Hernández et al., 1993; Martínez y Matell, 1994). Con estos últimos las principales investigaciones se han encaminado fundamentalmente a evaluar el efecto fitotóxico de los filtrados del cultivo de dicho hongo patógeno. Sin embargo, existen pocos trabajos donde se tiene en cuenta el aislado para la producción de un filtrado del cultivo fitotóxico y los referidos en Cuba con diferentes aislados de A. solani han sido sobre plantas de tomate (Bernal et al., 2002). Estas investigaciones serían de gran importancia ya que ha sido detectada variabilidad genética entre aislados de Alternaria solani (van der Waals, 2004). Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado el presente trabajo tuvo como objetivo determinar la influencia del aislado en la fitotoxicidad del filtrado del cultivo de Alternaria solani para su utilización en el programa de mejoramiento genético de la papa que se desarrolla en el Instituto de Biotecnología de las Plantas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislados de A. solani
Se utilizaron los aislados CCIBP-HAs46, CCIBP-PA s 114, CCIBP-VAs4, CCIBP-VAs9, CCIBP-CAs241, CCIBP-CAs242 de Alternaria solani Sor. pertenecientes a la colección de cultivos microbianos del Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Biotecnología de las Plantas. Los aislamientos se realizaron de campos comerciales de papa var. Desirée en zonas productoras del país.
Material vegetal
Los experimentos se realizaron con plantas de papa (Solanum tuberosum L.) variedad Desirée cultivadas in vitro, susceptible al tizón temprano (Lorenzo et al., 1992). Las plantas fueron propagadas in vitro según la metodología propuesta por Espinosa et al. (1992) en medio de cultivo semisólido.
Evaluación del crecimiento de aislados de A. solani
Los aislados se cultivaron en placas de Petri de 9.0 cm de diámetro que contenían 15 ml de medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) (Duchefa Biochemie). Cada placa de Petri fue inoculada con un disco de micelio de 1.0 cm de diámetro y se incubaron en cámaras climáticas (Gallenkamp) a 26±2 oC y oscuridad constante según Izquierdo (1979). Se utilizaron cinco placas por cada aislado. Para determinar el crecimiento de los aislados se midió, con una regla graduada, el diámetro de las colonias en milímetros a los siete días de cultivo.
Obtención del filtrado del cultivo
Se emplearon erlenmeyers de 500 ml de volumen que contenían 200 ml de medio de cultivo líquido Richard (Martínez y Mantell, 1994), los cuales se inocularon con un disco de micelio de 1 cm de diámetro tomado de los bordes de las colonias de cada aislado crecidas en medio de cultivo PDA (durante siete días a 26±2 0C y oscuridad constante). Los erlenmeyers se incubaron por un período de 30 días a 28oC en condiciones de cultivo estático y oscuridad constante. El pH del medio de cultivo se ajustó a 5.6. Pasado este período de tiempo se separó el estroma y se filtró el cultivo a través de papel de filtro Whatman No. 4 (Whatman). Posteriormente se concentró diez veces su volumen inicial por rotoevaporación al vacío a 40oC con un rotoevaporador (Heidolph, Bioblock), se filtró por un filtro de porcelana para eliminar posibles restos de micelio y finalmente por un filtro de 0.22 μm (Millipore).
La aplicación de los filtrados de los cultivos sobre las plantas se realizó por inmersión de raíces según lo descrito por Hernández et al. (1991). Se empleó la dilución 1:1 v/v (Filtrado del cultivo del aislado: agua destilada estéril) y como controles se incluyeron el medio de cultivo Richard sin inocular y agua destilada estéril.
Se utilizaron plantas en fase de multiplicación con no menos de 8.0 cm de altura, y al menos cinco yemas axilares sin contar la yema del explante original (segmento de tallo de aproximadamente 1.0 cm con una yema axilar). Se colocó una planta por tubo de ensayo (150 x 20mm) que contenía 4.0 ml de la concentración del filtrado del cultivo del hongo y los controles. Se emplearon 15 plantas por filtrado del cultivo.
Posteriormente las plantas se colocaron en cámaras de cultivo a 22 ±2 oC, luz artificial con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) de 62 μE.m-2 .s-1 y un fotoperíodo de 16 horas luz, durante 72 horas hasta la evaluación de las afectaciones.
Se evaluó el grado de afectación provocado por el filtrado del cultivo de cada aislado de acuerdo con la escala descriptiva para la evaluación in vitro propuesta por Veitía et al. (2001) sobre las plantas de papa var. Desirée cultivadas in vitro.
Análisis estadísticos
Los datos relativos al diámetro de las colonias de los aislados de A. solani así como, los grados de afectación presentados por las plantas fueron analizados mediante una prueba no paramétrica de Kruskall Wallis previa comprobación de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza utilizando el paquete estadístico SSPS versión 13.0 sobre Windows.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Todos los aislados de A. solani crecieron sobre el medio de cultivo PDA. Sin embargo, se observaron diferencias entre estos en el diámetro de las colonias (Tabla 1). Los aislados CCIBP-HAs46 y CCIBP-CAs242 difirieron significativamente de los aislados CCIBP-VA s 4 y CCIBP-PAs11 4 y no mostraron diferencias significativas con el resto.
Pryor y Michailides (2001), en la caracterización morfológica de aislados de Alternaria sp. observaron colonias con diámetros mayores de 70.0 mm, entre 50.0 y 70.0 mm y menores de 50.0 mm en evaluaciones realizadas entre los siete y diez días de incubación en medio de cultivo PDA. De igual forma, Pérez (2003) encontró variabilidad en el crecimiento in vitro entre aislados de A. solani y observó colonias con diámetros desde menores de 46.0 mm hasta más de 72.0 mm, lo que se corrobora con los resultados obtenidos en el presente estudio.
Por otro lado, al analizar el efecto fitotóxico de los filtrados del cultivo de los seis aislados de A. solani se observó que estos provocaron síntomas sobre las plantas de papa var. Desirée cultivadas in vitro (Tabla 2) tales como: necrosis y clorosis. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas en los grados de afectación provocados por los filtrados de cada uno de los aislados.
Los filtrados de los aislados CCIBP-VAs241 y CCIBP-VA s 242 produjeron síntomas en la zona inferior de las plantas (grados uno y dos) mientras que los filtrados de los cultivos de los aislados CCIBP-VAs9 y CCIBP-HAs46 provocaron clorosis en el centro de las hojas en la zona media y necrosis en borde de las hojas en la zona inferior (grado tres). Estas afectaciones se correspondieron con valores promedios del grado de afectación que difirieron significativamente con los mostrados por las plantas a las cuales se les aplicó el filtrado del cultivo obtenido de los aislados CCIBP-VAs241 y CCIBP-VAs242.
El filtrado del cultivo del aislado CCIBP-PAs11 4 provocó afectaciones más severas sobre las plantas de papa var. Desirée los cuales se correspondieron con grados de afectación superiores, con diferencias significativas a los mostrados por los cuatro aislados mencionados anteriormente (Tabla 2). Los síntomas se acentuaron en la zona media ya que se observaron hojas necróticas y en la zona apical se produjo clorosis (grado cinco).
El filtrado del cultivo del aislado CCIBP-VAs4 fue el que produjo los mayores valores en el grado de afectación con diferencias significativas con el resto de los aislados evaluados. Este ocasionó síntomas en toda la planta (las tres zonas). Especialmente en la zona apical se observó clorosis en el centro de las hojas y necrosis en los bordes (grado seis).
De forma general, a las 72 horas de aplicado el filtrado del cultivo de todos los aislados, se observó marchitez en las plantas.
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Por otro lado, al analizar la correspondencia entre los resultados relacionados con la fitotoxicidad de los filtrados del cultivo de los aislados de A. solani y las características culturales de estos, se encontró que aislados con un crecimiento similar en medio de cultivo PDA, mostraron diferencias en cuanto a la fitotoxicidad de sus filtrados del cultivo. Por ejemplo, los aislados CCIBP-VAs4 y CCIBP-PAs11 4 ; CCIBP-VAs9 y CCIBP-CAs241. Los dos restantes: CCIBP-HAs46 y CCIBP-CAs242 fueron los de menor crecimiento in vitro en comparación con los cuatro aislados mencionados anteriormente y sin embargo, estos difirieron en las afectaciones que provocaron sobre las plantas de papa var. Desirée cultivadas in vitro. Estos resultados no permitieron establecer una relación entre el crecimiento en medio de cultivo PDA de los aislados de A. solani y la fitotoxicidad de sus filtrados del cultivo. Ello indica que no resulta adecuado seleccionar los aislados para la producción de los filtrados del cultivo de este hongo fitopatógeno sobre la base del crecimiento en medio de cultivo micológico.
Otros autores han descrito síntomas similares después de la aplicación de filtrados del cultivo de A. solani sobre plantas de papa y tomate. Hernández et al. (1991) en plantas de papa (var. Desirée) in vitro observaron necrosis en los bordes de los foliolos y Martínez y Mantell (1994) en yemas apicales (2-3 cm) de plantas de papa (S. phureja Juz. et Buk) cultivadas in vitro informaron de la presencia de necrosis en la base de los explantes colocados en el medio de cultivo que contenía el filtrado del cultivo de A. solani.
Pérez (2003) observó síntomas tales como: necrosis en forma de manchas foliares oscurecidas, marchitez y necrosis, pero en plántulas de tomate al sumergirlas en el filtrado del cultivo de este patógeno. Se ha descrito que las toxinas hospedero no específicas que produce A. solani como el ácido alternárico, zinniol, antraquinonas, solanapironas A, B y C y alternasol A son las principales responsables de la acción fitotóxica (Chaerani y Voorrips, 2006). En general, este tipo de toxina tiene un moderado efecto fitotóxico, actúan como un factor de virulencia e intensifican los síntomas de la enfermedad (Thoma, 2003). Es por ello, que se han probado tanto los filtrados del cultivo como las toxinas; para seleccionar genotipos resistentes en papa (Lynch et al., 1991; Hernández et al., 1991; Martínez y Martell, 1994) y tomate (Maeiro et al., 1991).
Según la literatura científica existen pocos trabajos donde se utiliza el filtrado del cultivo para la diferenciación de aislados de A. solani y hasta la fecha los referidos en Cuba han sido sobre genotipos de tomate. Por ejemplo, Bernal et al. (2002), observaron diferencias entre cuatro aislados de A. solani a través del efecto del filtrado de cultivo sobre plantas de tomate cultivadas in vitro, resistentes y susceptibles al patógeno in vivo.
Las diferencias observadas entre los aislados pudieran estar relacionadas con la variabilidad intraespecífica en A. solani, que es un hongo de reproducción asexual, sujeto al fenómeno de la heterocariosis que le proporciona una gran diversidad genética (Stall, 1958). De igual forma, las diferencias en la producción de toxinas en Alternaria se le atribuyen a esta misma causa (Kusaba y Tsuge, 1995).
Estudios realizados en los últimos años aportan elementos que confirman la diversidad genética en Alternaria. Por ejemplo, Roberts et al. (2000), en estudios genéticos mediante marcadores moleculares (RAPD) en especies de Alternaria encontraron una gran diversidad genética la cual fue congruente con las características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas observadas en los aislados. Por su parte, Pérez (2003) con el empleo de marcadores moleculares (AFLP) detectaron diversidad genética entre aislados cubanos de A. solani provenientes de tomate y papa. Otros autores han informado de la variabilidad genética de A. solani en aislados procedentes de África del Sur (van der Waals et al., 2004). Sin embargo, según Chaerani y Voorrips (2006), la asociación de marcadores moleculares con la variabilidad morfológica, fisiológica y la virulencia no es conocida en A. solani.
Los resultados indicaron que a partir de diferentes aislados de A. solani fue posible obtener filtrados del cultivo fitotóxicos sobre plantas de papa var. Desirée cultivadas in vitro. Todos produjeron síntomas tales como: clorosis y necrosis y se observaron diferencias en cuanto a los grados de afectación según la escala utilizada. Ello confirmó que el aislado tiene influencia en la fitotoxicidad del filtrado del cultivo. En este sentido el aislado CCIBP-VA s 4 fue el más fitotóxico y se seleccionó para obtener filtrado del cultivo para su utilización en el programa de mejoramiento genético del cultivo de la papa. No se encontró correspondencia entre el crecimiento in vitro de los aislados y su capacidad de ocasionar síntomas en las plantas a través de su filtrado del cultivo.
CONCLUSIONES
Se demostró que el aislado influyó en la fitotoxicidad del filtrado del cultivo y se seleccionó el CCIBP-VAs4 ya que produjo las mayores afectaciones sobre las plantas de papa var. Desirée cultivadas in vitro. No se encontró correspondencia entre el crecimiento de los aislados y la fitotoxicidad de sus filtrados del cultivo.
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