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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 7, No. 4: 205 - 210, octubre - diciembre, 2007
ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Empleo de los agentes selectivos Geneticina G-418 e Higromicina B para la transformación genética en Phaseolus vulgaris variedad CIAP 72-47
I. Bermúdez-Caraballoso1*, R. Collado1, L. R. García1, N. Veitía1, D. Torres1, C. Romero1, G. Angenon2 * Autor para correspondencia.
1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas (UCLV). Carretera a Camajuní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e.mail: idalmis@ibp.co.cu
2Laboratory of Plant Genetics. Vrije Universiteit Brussel. Belgium
RESUMEN
Las leguminosas son una fuente de proteína muy importante en la dieta tanto humana como animal y de estas las del género Phaseolus son las más empleadas en la nutrición. La mayoría de los sistemas de transformación genética descritos hasta el momento requieren seleccionar las plantas que contengan el transgen introducido mediante un marcador de selección. La utilización de uno u otro, requiere que primero se determinen las concentraciones adecuadas de este y su efecto inhibitorio en el crecimiento de los explantes. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la concentración mínima inhibitoria de los antibióticos Geneticina G-418 e Higromicina B que inhibieran el crecimiento de explantes de Phaseolus vulgaris var. CIAP 72-47. Como material vegetal se utilizaron segmentos de tallo de 5-6 mm de longitud que contenían el nudo cotiledonal y habían sido obtenidos a partir de semillas maduras. Para la selección se empleó el medio de cultivo de inducción de brotes al que se adicionaron diferentes concentraciones de Geneticina G-418 (0, 20, 30, 40, 50 y 60 mg.l-1) o Higromicina-B (0, 10, 15, 20 y 25 mg.l-1). Las evaluaciones se realizaron a las ocho semanas y se determinó el número de explantes con yemas múltiples regeneradas, así como el número de explantes necrosados. Se encontró que el antibiótico Geneticina G-418 inhibió totalmente el desarrollo de las yemas múltiples y el tejido se necrosó (100%) a partir de la concentración de 50 mg.l-1. No se logró la regeneración de yemas en el segmento de tallo, y esto difirió estadísticamente del resto de los tratamientos, por lo que se seleccionó como la concentración mínima inhibitoria. Para el caso del antibiótico Higromicina-B, se logró la inhibición del desarrollo de las yemas múltiples a concentraciones por encima de 20 mg.l-1, el explante se tornó necrótico y no fue posible la regeneración de yemas múltiples, por esta razón se seleccionó como la mínima concentración inhibitoria de este agente selectivo para ser utilizada en los experimentos de transformación genética de Phaseolus vulgaris variedad CIAP 72-47.
Palabras clave: frijol, transformación genética, yemas múltiples
ABSTRACT
Leguminous are a very important source of protein in the diet of human and animal. Phaseolus gender is the most used in the nutrition among them. Most of the systems for genetic transformation described up to the moment require selecting the plants that contain the transgen introduced by means of a selection marker. The selection of the system requires determining first their appropriate concentrations and inhibitory effect in the growth of the explants. Therefore, the objective of the present work was to determine the minimal inhibitory concentration of the antibiotics Geneticin G-418. Also the Hygromicin B that inhibited the growth of the explants of Phaseolus vulgaris var. CIAP 72-47. Stem segments of 5-6 mm with the cotyledonal nude obtained from mature seeds were used as plant material. Culture medium for buds induction with different concentrations of Geneticin G-418 (0, 20, 30, 40, 50 and 60 mg.l-1) and Hygromicin B (0, 10, 15, 20 and 25 mg.l-1) was used for the selection. Evaluations were carried out after eight weeks. Explants number with multiple buds, as well as number of necrotic explants were determined. Antibiotic Geneticin G-418 inhibited development of multiple buds. Explants were totally necrosed (100%) starting from concentration of 50 mg.l-1. Formation of buds in the stem segment was not achieved.This differed statistically from the rest of treatments. According to results these one was selected as the minimal inhibitory concentration. Development of multiple buds was reached at a concentration superior to 20 mg.l-1 of antibiotic Hygromicin B. Explants turned necrosed and regeneration of multiple buds was not possible. That is why it was selected to be used in the experiments of genetic transformation of Phaseolus vulgaris variety CIAP 72-47 as minimal inhibitory concentration of this selective agent .
Keywords: beans, genetic transformations, multiple buds
INTRODUCCIÓN
Las leguminosas son una fuente de proteína muy importante en la dieta tanto humana como animal y de estas, las del género Phaseolus son las más empleadas en la nutrición (Singh, 1999). Según Zambre et al. (2005) Phaseolus vulgaris es la segunda legumbre más importante en el mundo.
Las especies de Phaseolus han sido transformadas genéticamente con resultados limitados (Christon, 1997) con la mayoría de los esfuerzos concentrados en la transformación de Phaseolus vulgaris (Nagl et al., 1997). El sistema de transformación genética mediante el bombardeo de partículas ha sido desarrollado (Russell et al., 1993; Aragao et al., 1996) para obtener plantas transgénicas de P. vulgaris, sin embargo, las frecuencias de transformación obtenidas han sido muy bajas (Christon, 1997). La transformación mediante Agrobacterium tumefaciens en P. vulgaris ha sido inútil (Franklin et al., 1993; Zhang et al., 1997). Hasta el presente solo ha sido desarrollado un método reproducible para la obtención de plantas transgénicas mediante A. tumefaciens en Phaseolus (Dillen et al., 1997). Este procedimiento fue mejorado por De Clercq et al. (2002) pero solo restringido al genotipo silvestre Phaseolus acutifolius y más recientemente Zambre et al. (2005) han trabajado en la obtención de un método de transformación genética en Phaseolus más reproducible y eficiente para obtener plantas morfológicamente normales, fértiles y estables genéticamente en el mismo cultivar.
La gran mayoría de los sistemas de transformación genética descritos hasta el momento requieren seleccionar las plantas que contengan el transgen introducido mediante un agente de selección. Los marcadores de selección o agentes de selección son de gran utilidad en el estudio de la integración, expresión y herencia de genes foráneos en plantas.
Los genes marcadores más comúnmente usados son aquellos que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas. De ellos los han sido usados el neo y npt que codifican para la enzima neomicina fosfotransferasa II (NPT II) y la higromicina fosfotransferasa (HPT) respectivamente y existe además el gen bar que codifica para la enzima fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) (D Halluin et al., 1992).
La expresión de estos genes garantiza que las células transformadas crezcan en presencia del agente selectivo, mientras que las células no transformadas mueran durante el proceso de selección. Los artículos científicos que abordan la transformación en plantas revelan que tres de estos sistemas de selección fueron usados en más del 90% de los casos. Estos fueron, los genes que confieren resistencia a los antibióticos kanamicina, higromicina, geneticina y al herbicida fosfinotricina (Miki y Hugh, 2004).
Para la selección eficiente en los experimentos de transformación genética es importante determinar la mínima concentración inhibitoria del agente selectivo que logre el máximo de células no transformadas muertas ya que a bajas concentraciones pueden aparecer quimeras y por otro lado a altas concentraciones se podría inhibir el desarrollo de las células transformadas porque la resistencia conferida sea más baja que la concentración del agente selectivo usada (Screemanan et al., 2006).
La utilización de uno u otro marcador de selección en experimentos de transformación genética de Phaseolus vulgaris requiere que primero se determinen las concentraciones adecuadas del agente selectivo y su efecto inhibitorio en el crecimiento de los explantes utilizados en el proceso de transformación genética. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la concentración mínima inhibitoria de los antibióticos Geneticina G-418 e Higromicina B que inhibieran el crecimiento de los explantes de Phaseolus vulgaris var. CIAP 72-47, con el fin de usarlos como agentes selectivos en el proceso de transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en esta variedad comercial.
MATERIALES Y MÉTODOS
Como material vegetal se utilizaron segmentos de tallo de 5-6 mm de longitud que contenían el nudo cotiledonal de Phaseolus vulgaris variedad CIAP 72-47. Los mismos fueron obtenidos a partir de semillas maduras germinadas durante tres días en un medio de cultivo de germinación compuesto por las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) (MS) 100%, tiamina 1 ml.l-1, 6- Bencilaminopurina (6-BAP)1.13 mg.l-1, sacarosa 45 g.l-1 y Phytagel 2.5 g.l-1. Posteriormente, fueron colocadas durante cinco días en el medio de cultivo de pretratamiento en estado líquido (Sales MS 100%, Vitamina Heinz 10 ml.l-1, mio-inositol 100 mg.l-1, tidiazuron (TDZ) 0.2 mg.l-1 y sacarosa 30 g.l-1). En todos los casos el pH fue ajustado a 5.7 y los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave.
Para el proceso de selección se empleó el medio de cultivo para la inducción de brotes (Sales MS 100%, Vitamina Heinz 10 ml.l-1, mio-inositol 100 mg.l-1, TDZ 1 mg.l-1, sacarosa 30 g.l-1 y Phytagel 2.5 g.l-1) al que se adicionaron diferentes concentraciones de Geneticina G-418 (0, 20, 30, 40, 50 y 60 mg.l-1) o Higromicina-B (0, 10, 15, 20 y 25 mg.l-1). La solución inicial de los agentes selectivos se preparó a concentraciones de 50 mg.ml-1, se esterilizó por filtración y fue añadido al medio de cultivo en la cabina de flujo laminar después que este alcanzó una temperatura de aproximadamente 45ºC.
Se utilizaron cinco placas de Petri de 9.0 cm de diámetro por cada tratamiento, con cinco segmentos de tallo por placa. Las placas fueron selladas con Parafilm y colocadas en la cámara de luz solar por ocho semanas. Se realizaron cambios a medio de cultivo fresco cada dos semanas.
Las evaluaciones se efectuaron a las ocho semanas de cultivo y se determinó el número de explantes con yemas múltiples, así como el número de explantes necrosados por tratamiento.
El análisis estadístico de los datos experimentales se realizó con la ayuda del Paquete estadístico SPSS versión 15.0 sobre Windows. Se utilizó un análisis de varianza simple y para detectar diferencias entre los porcentajes se empleó la prueba de Tukey.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En los explantes evaluados se encontró que el antibiótico Geneticina G-418 inhibió totalmente el desarrollo de las yemas múltiples y el tejido se necrosó (100%) a partir de la concentración de 50 mg.l-1 por lo cual no se logró la formación de estas, en el segmento de tallo y difirió estadísticamente del resto de los tratamientos a las ocho semanas de cultivo. Con concentraciones de 30 y 40 mg.l-1 solo se alcanzó un 28% de formación de yemas múltiples en ambos casos con diferencias estadísticas significativas con respecto al control, además, se observó una marcada necrosis del explante, por encima del 70%. En la menor concentración evaluada (20 mg.l-1) se logró un 64% de yemas regeneradas difiriendo también del control y del resto de los tratamientos (Figura 1).
Estos resultados coinciden con los obtenidos en otras especies donde se observa que el nivel de inhibición del crecimiento, así como la concentración del agente selectivo varía de acuerdo con el genotipo y al explante de la especie estudiada (Fernández y Menéndez, 2004).
Zambre et al. (2005) realizaron la selección en diferentes explantes de dos variedades de Phaseolus acutifolius, utilizando el mismo marcador de selección, es decir la geneticina G-418 y determinaron que la mínima concentración inhibitoria de este antibiótico para el eje embriogénico fue de 5 mg.l-1 y para el caso de los callos nodulares verdes inhibió totalmente la proliferación de estos en el genotipo TB1 a 20 mg.l-1 y a 15 mg.l-1 para el genotipo PI440795.
La presencia del gen NPT II en la construcción genética utilizada en los experimentos de transformación provoca que se le confiera a los tejidos transformados la resistencia a antibióticos aminoglicósidos por fosforilación de un grupo hidroxil específico de este, esto sugirió la utilización de la geneticina G-418 a una concentración de 100 mg.l-1 en medio de cultivo semisólido y de 50 mg.l-1 en medio de cultivo líquido para la selección efectiva de yemas transformadas de banano (Screemanan et al., 2006).
Finalmente, se seleccionó como la concentración mínima inhibitoria para este antibiótico 50 mg.l-1 ya que provocó la necrosis y muerte total de los explantes. Sin embargo, teniendo en cuenta los resultados alcanzados por Zambre et al. (2005) se decidió reducir la presión de selección a partir de 30 mg.l-1 de geneticina G-418 en el primer subcultivo después del cocultivo y luego se fue aumentando a 40 mg.l-1 en el segundo y los dos últimos subcultivos en 50 mg.l-1, ya que con la reducción de la presión de selección se evitarán los niveles altos de toxicidad para las células transformadas y la muerte excesiva de estos explantes lo que enmascararía los resultados finales del evento de transformación (Figura 2).
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Resultados similares obtuvieron Gurel y Gozukirmizi (2000) al utilizar este mismo antibiótico pero en cebada. Estos autores con las concentraciones letales de 80-100 mg.l-1, lograron cinco plantas que fueron resistentes al antibiótico, sin embargo, en los análisis moleculares no se logró amplificar la secuencias de los genes introducidos. Por otra parte, de ocho plantas que crecieron en 40 mg.l-1 de geneticina G-418, en una se logró la amplificación de los dos genes y en tres solo se detectó uno.
Tsukazaki et al. (2002) al realizar la selección a nivel de callos organogénicos provenientes de líneas doble haploides transformadas genéticamente de col (Brassica oleraceae), encontraron que reducir la presión de selección en los primeros subcultivos y al final aumentarla les permitió obtener un número de plantas transgénicas mayor que cuando utilizaron las concentraciones altas desde el inicio de la selección. Estos autores lograron gran cantidad de yemas múltiples regeneradas a partir de callos en un medio de cultivo de regeneración de yemas al que se le adicionaron 25 mg.l-1 de kanamicina a los dos meses de cultivo. Sin embargo, las plantas tolerantes a Kanamicina se obtuvieron a los cuatro meses en un medio de cultivo de maduración de las yemas con 50 mg.l-1 de este antibiótico.
Zambre et al. (2005) compararon dos esquemas en la selección de callos nodulares verdes de Phaseolus acutifolius frente al agente de selección geneticina G-418. En el primer esquema realizaron la selección directa al exponer los callos a la dosis letal de geneticina G-418 de 20 mg.l-1 desde el primer subcultivo después del cocultivo y un segundo esquema cuando expusieron los callos a una concentración inicial del antibiótico más baja (5 mg.l-1) y luego la incrementaron en los sucesivos subcultivos hasta la dosis letal. Ambos esquemas de selección produjeron líneas transgénicas a partir de los callos transformados, sin embargo, el mayor número de líneas por callo se obtuvo usando el segundo esquema. Estos autores plantean que la reducción de la presión de selección es un factor que puede mejorar el procedimiento de transformación.
El antibiótico Higromicina-B, con la concentración de 15 mg.l-1 solo logró inhibir la regeneración de las yemas múltiples alrededor del 50%, sin embargo, a concentraciones de 20 mg.l-1 o más, el explante se tornó totalmente necrótico y no fue posible la regeneración, con diferencias estadísticas respecto a las concentraciones inferiores de 10 y 15 mg.l-1. Por esta razón se seleccionó como la mínima concentración inhibitoria de este agente selectivo la de 20 mg.l-1 (Figuras 3 y 4).
Resultados similares obtuvieron Sreeramanan et al. (2006) usando este antibiótico para la selección de yemas simples de banano cultivar Pisang Rastali (Musa AAB), donde la higromicina B a la concentración de 20 mg.l-1 inhibió totalmente el crecimiento en medio de cultivo sólido, después de cuatro semanas en la selección. Así mismo, Men et al. (2003) encontraron que la higromicina B a concentraciones por encima de 30 mg.l-1 inhibió completamente el crecimiento de las células de orquídea (Dendrobium spp.).
Por su parte, Hagio et al. (1995) en el cultivo del trigo encontraron que este antibiótico usado como agente selectivo no produjo albinismo en las plantas regeneradas. Sin embargo, Yu et al. (2003) al usar kanamicina encontraron un gran número de plantas albinas.
Igualmente, en el cultivo de la yuca (Manihot sculenta) se ha usado eficientemente este antibiótico para la selección de suspensiones celulares (Zhang et al., 2000).
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CONCLUSIONES
Los resultados demostraron que ambos antibióticos son agentes selectivos que pueden ser utilizados en la transformación genética de Phaseolus vulgaris variedad CIAP 72-47, usando como tejido blanco los segmentos de tallo. Ambos mostraron signos rápidos de toxicidad e inhibición del crecimiento a bajas concentraciones, siendo 50 mg.l-1 y 20 mg.l-1 las mínimas concentraciones inhibitorias para la geneticina G-418 y la Higromicina B, respectivamente.
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