Vol. 4, No. 2 2004.p65 
Artículo Científico                                                                           Biotecnología Vegetal Vol. 4, No. 2: 77 - 84, abril - junio, 2004

 

 

Evaluación en casa de cultivo de la respuesta a la Sigatoka negra de dos cultivares de Musa mediante la inoculación artificial de suspensiones conidiales de Pseudocercospora fijiensis

Mayra Acosta Suárez*, Yelenys Alvarado Capó, Mileidy Cruz Martín, Michel Leiva Mora y Berkis Roque Morales. * Autor para correspondencia. e-mail: mayra01a@yahoo.es

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5 ½ .Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830

RESUMEN

Para la evaluación de la resistencia a la Sigatoka negra en genotipos procedentes de programas de mejoramiento genético se han empleado diferentes métodos entre los que se encuentra la inoculación artificial con estructuras de reproducción del patógeno. Sin embargo, se precisa estandarizar las condiciones para su obtención in vitro y conocer la respuesta en casa de cultivo de cultivares de respuesta conocida en campo a dicha enfermedad. Con ello se podrán establecer métodos adecuados de evaluación y selección de nuevos genotipos resistentes. Con los objetivos de evaluar diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación para la obtención de conidios de P. fijiensis así como la respuesta de dos cultivares de Musa a la inoculación artificial con suspensiones conidiales de este hongo, se realizó este trabajo. Se probaron diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación para la obtención de conidios y se utilizaron los cultivares Grande naine (susceptible) y FHIA-18 (parcialmente resistente). Los conidios de P. fijiensis pudieron ser obtenidos in vitro a 20ºC y luz constante a partir de los 10 días de incubación en los medios de cultivo Agar Papa Zanahoria, Agar V-8 modificado y Agar Papa y Dextrosa, no obstante la mayor concentración se alcanzó en Agar Papa y Dextrosa a los 20 días de incubación a 20ºC y luz fluorescente blanca continua. Mediante el empleo de una escala cualitativa del estado de los síntomas y las variables cuantitativas tiempo de evolución de los síntomas y tiempo de desarrollo de la enfermedad se pudieron diferenciar ambos cultivares que mantuvieron en casa de cultivo una respuesta similar a la observada en campo.

Palabras clave: conidios, esporulación, FHIA-18, Grande naine, medios de cultivo

ABSTRACT

For evaluating the resistance of Black sigatoka in genotypes from breeding programmes different methods have been used, the artificial inoculation of pathogens reproduction structures is one of them. Nevertheless, is necessary the standardization of condition for it in vitro production and to know the response of cultivars to the diseases in greenhouse. It will permit to establish methods for evaluating and selecting the new resistant genotypes. This work was carried out with the objectives to evaluate different culture media and incubation conditions for obtaining P. fijiensis conidia and for evaluating the response of two cultivars to the artificial inoculation with conidial suspensions of this fungus. Different culture media and incubation conditions for obtaining the conidia and the cultivars Grande naine (susceptible) and FHIA-18 (partially resistant) were used. The conidia of P. fijiensis could be obtained in vitro at 20ºC and constant light from 10 days of incubation in culture media Potato Carrot Agar, modified V-8 Agar and Potato Dextrose Agar. However, the greatest concentration was reached in Potato Dextrose Agar after 20 days of incubation at 20ºC under continuous white fluorescent light. The artificial inoculation of conidial suspensions of P. fijiensis allowed to evaluate the response of Grande Naine and FHIA-18 cultivars in greenhouse. By the use of qualitative scale of symptoms stages and the quantitative variables symptoms evolution time and disease development time was possible to differentiate both cultivars. They maintained in greenhouse similar response to the disease that in the field.

Key words: conidia, culture medium, FHIA-18, Grande naine, sporulation

INTRODUCCIÓN

La Sigatoka negra es producida por el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet (Peudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton, anamorfo). También se conoce como el estriado negro de la hoja y es considerada la enfermedad foliar más destructiva y costosa de los plátanos y bananos a nivel mundial (Carlier et al., 2000, Pasberg-Gauhl et al., 2000).

Para la evaluación de la resistencia a esta enfermedad en genotipos procedentes de programas de mejoramiento genético se han empleado diferentes métodos entre los que se encuentra la inoculación artificial con estructuras de reproducción del patógeno (Mobambo et al., 1994). Sin embargo, se precisa estandarizar las condiciones para su obtención in vitro.

La inoculación artificial de plantas procedentes del cultivo de tejidos mediante el empleo de suspensiones conidiales del hongo resulta ser un método fácil, rápido y reproducible para conocer la respuesta de diferentes cultivares frente a M. fijiensis.

Sin embargo, a menudo la producción de conidios de este patógeno se ve limitada por el carácter fluctuante de la esporulación in vitro durante los subcultivos sucesivos (Mourichon et al., 1987; Cruz, 2003) y por la pérdida de la capacidad de producción de conidios bajo estas condiciones (Meredith y Lawrence,1969). Es por ello que se precisa estandarizar las condiciones para su obtención in vitro.

Con los objetivos de evaluar diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación para la obtención de conidios Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton y evaluar la respuesta de dos cultivares de Musa a la inoculación artificial con suspensiones conidiales de P. fijiensis se realizó este trabajo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Evaluación de diferentes medios de cultivo para la obtención de conidios de P. fijiensis

Aislado

Se utilizó el aislado CCIBP-Pf39 de Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton perteneciente a la colección de cultivos microbianos del Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Biotecnología de las Plantas.

Medios de cultivo

Se utilizaron los medios de cultivo sólido: Agar Mycophil (BBL), Agar Papa y Dextrosa (BioCen), Agar Dextrosa de Sabouraud (BioCen), Agar V-8 modificado (Mourichon et al., 1987), Agar Extracto de Malta (extracto de malta: 50 g.l-1, dextrosa: 5 g.l-1, pH 5.6±0.2) y Agar Papa Zanahoria (papa: 200g.l-1, zanahoria: 200g.l-1, pH 5.6±0.2). Los tres últimos solidificados con 20g.l-1 de agar.

Inoculación

Se inocularon 300μl de una suspensión micelial (105 fragmentos de micelio.ml-1) en tubos de ensayo de 150 x 22 mm con 15ml de los medios de cultivo inclinado. Estos se incubaron a 20ºC en cámara climatizada Gallenkamp con luz fluorescente blanca fría continua de 60 μmoles.m-2.s-1 durante 10 días, según lo descrito por Carlier et al. (2002) (Figura 1).

Transcurrido este período de tiempo, se adicionaron a los tubos 5ml de agua desionizada estéril más Tween 80 al 0.05%. Se removieron en agitador vortex (Heidolph Top Mix 94 323) a 7 rpm durante 1 minuto para la separación de los conidios del micelio del hongo (Figura 2).

Se evaluó la concentración de conidios. ml-1 en cada medio de cultivo. Esta se determinó en cámara de Neubauer por observación al microscopio óptico Olympus (aumento 100x).

Evaluación de dos temperaturas de incubación para la obtención de conidios de P. fijiensis

Este ensayo se realizó con el objetivo de conocer la temperatura de incubación adecuada para obtener la mayor concentración de conidios de P.fijiensis.

Se utilizaron para ello, los medios de cultivo de mejores resultados del experimento anterior y se siguió un protocolo similar al descrito en el mismo. Se evaluó la concentración de conidios a las temperaturas de incubación de 20ºC y 25ºC.

Evaluación de tres tiempos de incubación para la obtención de conidios de P. fijiensis

Con el objetivo de determinar el tiempo de incubación adecuado para la obtención de conidios de P. fijiensis se realizó este experimento.

Se utilizaron los medios de cultivo de mejores resultados del experimento anterior y se siguió un protocolo similar al descrito en el mismo. Se evaluó la concentración de conidios a los 10, 20 y 30 días de incubado.

Procesamiento estadístico de los datos

El procesamiento estadístico de la variable evaluada se realizó con el paquete estadístico Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 9.0 para Windows. Los datos se analizaron por medio de un ANOVA de clasificación simple y las diferencias entre las medias se procesaron a través de la Prueba de Dunnett´s C.

Evaluación de la respuesta de dos cultivares de Musa a la inoculación artificial con suspensiones conidiales de P. fijiensis

Se utilizaron plantas obtenidas in vitro de los cultivares de banano: Grande naine (susceptible) y FHIA-18 (parcialmente resistente). Las mismas se mantuvieron en fase de aclimatización durante 45 días en bandejas de polieturano (70 alvéolos) con sustrato compuesto por 50% de casting, 30% de compost y 20% de zeolita. Posteriormente se transfirieron a recipientes plásticos de 10 cm de diámetro con 500 ml de capacidad con igual sustrato por 45 días más hasta alcanzar como mínimo 20 cm de alto y al menos tres hojas activas(Figura 3).

Las mismas se inocularon con suspensiones conidiales (105 conidios.ml-1) con gelatina al 1%. La inoculación se realizó con un pincel sobre el envés de las tres hojas más jóvenes totalmente extendidas (Figura 4).

Se esperaron dos horas hasta que se secaran las hojas, luego se elevó la humedad relativa al 100% durante tres días y después se garantizó una humedad relativa por encima del 70%. Se inocularon 10 plantas y, además, se incluyeron 10 plantas sin inocular para ser utilizadas como controles. Las mismas se ubicaron completamente al azar en una casa de cultivo. Diariamente se registró la temperatura y la humedad relativa mínima y máxima mediante un Termo-higrómetro electrónico (EM-913) (Oregon Scientifit). El experimento se evaluó cada siete días desde la inoculación hasta los 63 días. En cada cultivar, se evaluaron los siguientes aspectos:

- Período de incubación: Tiempo entre la infección y la aparición de las primeras lesiones puntiformes por el envés de la hoja (días).

- Período de transición o tiempo de evolución de los síntomas: Número de días entre la aparición de los primeros síntomas (lesiones puntiformes) y la aparición de manchas necróticas con centros secos.

- Desarrollo de la enfermedad en el tiempo: Período entre la inoculación y la aparición de lesiones maduras (manchas necróticas con centros secos). Para la evaluación cualitativa del desarrollo de los síntomas se utilizó la escala propuesta por Alvarado et al. (2003) (Tabla 1).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación de diferentes medios de cultivo para la obtención de conidios de P. fijiensis

Se obtuvieron conidios de P. fijiensis en todos los medios de cultivos ensayados a partir de los 10 días de incubación a la temperatura de 20°C y luz constante y sus características coincidieron con las referidas en la literatura científica para esta especie (Carlier et al., 2002) (Figura 5).

La mayor concentración de conidios se logró en los medios de cultivo Agar Papa y Dextrosa, Agar Papa Zanahoria y Agar V-8 modificado y no existieron diferencias estadísticas significativas entre ellos (Tabla 2). Estos resultados constituyen una alternativa para la obtención de conidios in vitro ya que se pueden utilizar otros medios de cultivo sintéticos como el Agar Papa y Dextrosa y no solo el Agar V-8 referido en la literatura científica para estos fines (Carlier et al., 2002).

Hadana et al. (2002) no lograron esporulación en el medio de cultivo Agar Papa Zanahoria a diferencia de los resultados obtenidos en este trabajo.

El medio de cultivo V-8 ha sido empleado por varios investigadores para la obtención de conidios con buenos resultados (Mourichon et al.,1987; Mata et al.,1994; Ceres y Menezes, 2001). También Fullerton y Olsen (1995); González (1999); Ceres y Menezes (2001) y Hadana et al. (2002) lograron obtener conidios en medio de cultivo Agar Papa y Dextrosa.

Además de estos medios de cultivo, se han utilizado otros para la obtención de conidios de P. fijiensis. Entre ellos se encuentran el Agar Czapek y el Agar Maltosa Peptona Avena (Ceres y Menezes, 2001).

Evaluación de dos temperaturas de incubación para la obtención de conidios de P. fijiensis

Al evaluar la concentración de conidios en los medios de cultivo de mejores resultados del experimento anterior (Agar Papa y Dextrosa, Agar Papa Zanahoria y Agar V-8 modificado) a 20ºC y a 25ºC se comprobó que no existieron diferencias estadísticas significativas a las dos temperaturas para los medios de cultivo Agar Papa Zanahoria y Agar V-8 modificado a los 10 días de incubación. Sin embargo, en Agar Papa y Dextrosa a 20ºC se observó la mayor concentración de conidios (Tabla 3).

Diferentes temperaturas de incubación se han utilizado in vitro para la producción de conidios de P . fijiensis. Williams (1990) probaron 21ºC y 30ºC. Por su parte, Jacome y Schuh (1993) utilizaron 20°C y obtuvieron 5x103 conidios.ml-1 en el medio de cultivo Mycophil. En cuanto a esto, Carlier et al. (2002) demostraron que la esporulación de P. fijiensis ha sido lograda en algunos medios de cultivo sólido siendo óptima a 20°C. Por otra parte, Mouliom-Pefoura (1995) y Cruz (2003) alcanzaron una concentración de 105 conidios.ml-1 a 20°C.

Otros investigadores obtuvieron conidios de P. fijiensis a la temperatura de 25°C (Mourichon et al.,1987; Jacome y Schuh,1992; Fullerton y Olsen, 1995; Romero y Sutton, 1997; Ceres y Menezes, 2001 y Hadana et al., 2002)

 

Evaluación de tres tiempos de incubación para la obtención de conidios de P. fijiensis

Según los resultados de varias investigaciones es posible obtener conidios de P. fijiensis en diferentes tiempos de incubación, sin embargo la mayoría coincide en que se requieren al menos diez días para lograr una cantidad apreciable de dichas estructuras de reproducción (Carlier et al., 2000). Los resultados de este experimento corroboraron el planteamiento anterior.

En el medio de cultivo V-8 se pudieron cuantificar 2.29 x105 conidios. ml-1 a los 10 días y se mantuvieron en ese orden hasta los 30 días sin diferencias estadísticas significativas entre ellos. En Agar Papa Zanahoria la mayor concentración de conidios se logró a los 10 días de incubación, mientras que en Agar Papa y Dextrosa se obtuvieron a los 20 días 5.91 x105 conidios. ml-1, valor que resultó ser el más alto de todos los tratamientos (Tabla 4).

Mourichon et al. (1987), plantearon que colonias de 10-21 días podían producir conidios. En cuanto a esto, Jacome y Schuh (1992) obtuvieron conidios de 14 a 18 días de incubación. Estos mismos investigadores pero en el año 1993, a los 24 días, en medio de cultivo Agar Mycophil lograron hasta 106 conidios.ml-1. Por su parte, Mata et al. (1994) y Leiva (1998) observaron conidios a los 14 días de incubación, mientras que Fullerton y Olsen (1995) emplearon un tiempo 14 a 21 días para su colecta. Romero y Sutton (1997) en 15 días cuantificaron 0.23-2.23x103 conidios.día-1.

Evaluación de la respuesta de dos cultivares de Musa a la inoculación artificial con suspensiones conidiales de P. fijiensis

Al inocular suspensiones conidiales de P. fijiensis sobre hojas de los cultivares Grande naine y FHIA-18 se logró reproducir el comportamiento de ambos frente a la enfermedad en condiciones naturales.

Para los dos genotipos de Musa spp. evaluados los primeros síntomas se observaron a los 14 días después de la inoculación (periodo de incubación). En el cultivar Grande naine los síntomas, después de su aparición (pequeñas lesiones puntiformes por el envés, estado 1, Alvarado et al., 2003), evolucionaron hacia manchas necróticas (manchas negras circulares, con halo clorótico o centro seco gris, (estados 4 ó 5, Alvarado et al., 2003) en 35 días. En el FHIA-18 los síntomas evolucionaron más lentamente y no se observaron manchas necróticas con centro seco. Al final del periodo de evaluación (63 días) cuando ya las plantas de Grande naine habían perdido la totalidad de su área foliar por los daños ocasionados por el patógeno, en este cultivar solo se habían observado manchas de contornos regulares o irregulares de coloración pardo-rojiza por el haz. Este comportamiento de los dos cultivares se correspondió con el observado en condiciones naturales donde el Grande naine muestra una evolución rápida de los síntomas y el FHIA-18 un progreso lento de los mismos. Atendiendo a este resultado no pudieron ser calculados el tiempo de evolución de los síntomas y el tiempo de desarrollo de la enfermedad. Las variables cuantitativas utilizadas aún cuando no pudieron ser calculadas para el FHIA-18 (no se alcanzó el estado de mancha con centro seco en 63 días de evaluación) permitieron diferenciarlos (Tabla 5).

Romero y Sutton (1997) utilizaron suspensiones conidiales de M. fijiensis para estudiar la respuesta de FHIA-01 y FHIA-02 a la Sigatoka negra. Ellos encontraron que la evolución de los síntomas en estos cultivares fue lenta en correspondencia con su respuesta a la enfermedad (parcialmente resistentes) y señalaron que el mecanismo de resistencia de los FHIA a la Sigatoka negra aun se desconoce pero se supone que factores morfológicos y bioquímicos tales como la baja densidad estomática, producción de suberinas o ligninas, el aumento de los depósitos epicutilares de cera en las hojas, así como la producción de fitoalexinas, pueden ser posibles mecanismos de resistencia parcial en dichos híbridos.

El período de incubación no resultó ser adecuado para diferenciar los cultivares de bananos evaluados ya que fue el mismo para ambos. Este resultado coincidió con los obtenidos por Gauhl (1994) en condiciones de campo.

En inoculaciones artificiales Mourichon et al. (1987) determinaron que el período de incubación para plantas in vitro de Grande naine, Fougamou y Yangambi km 5 fue de 19 días. Por su parte Mouliom-Pefoura (1995) al inocular plantas provenientes del cultivo in vitro de Grande naine con suspensiones conidiales determinó que el período de incubación fue de 17 días.

Las variables tiempo de evolución de los síntomas y tiempo de desarrollo de la enfermedad han sido utilizadas para evaluar genotipos de Musa spp. en campo (Mobambo et al. 1994; Gauhl et al., 2000) pero poco se han empleado en casas de cultivo con plantas provenientes del cultivo in vitro. Molina y Castaño (2003) las usaron para evaluar la resistencia de cultivares FHIA frente a M. fijiensis y M. musicola inoculados con suspensiones conidiales de estos patógenos. Estos investigadores obtuvieron tiempos de evolución de los síntomas en FHIA-01 y FHIA-17 superiores a los 55 días para el primer patógeno.

La escala de evaluación cualitativa permitió diferenciar los cultivares Grande naine (susceptible) y FHIA-18 (parcialmente resistente) en casa de cultivo (Tabla 6).

En las evaluaciones realizadas se observó que en las hojas inoculadas predominó un mismo estadio de síntoma. Además, se distribuyeron uniformemente sobre toda la superficie foliar. Esto evidenció que el tipo de inóculo (suspensiones conidiales) y el método de inoculación utilizados (aplicación con pincel sobre el envés de la hoja) fueron válidos para la obtención de síntomas de la enfermedad sobre plantas in vitro en casa de cultivo. Estos aspectos unidos a las condiciones ambientales donde se mantuvo una humedad relativa por encima del 60% y la temperatura media del día de 27ºC sentaron las bases para profundizar en el estudio de la inoculación artificial con el patógeno como vía para conocer la respuesta de cultivares de Musa a la enfermedad.

En la literatura científica sobre el tema cuando se refiere el uso de suspensiones conidiales, generalmente se hace alusión a la concentración de conidios sin tener en cuenta el número de fragmentos de micelio que pueden estar presentes debido al procedimiento por el cual se hayan colectado (Fullerton y Olsen, 1995). Sin embargo, en este estudio el método utilizado para separarlos del micelio (aplicación de Vortex) garantizó que solo se inocularan dichas estructuras de reproducción asexuales.

La calidad y características del inóculo para el desarrollo de estrategias de evaluación temprana de la resistencia de cultivares de plátanos y bananos han sido definidos por el Programa Global para el Mejoramiento de Musa (PROMUSA, INIBAP) entre los factores prioritarios que requieren atención e investigación.

CONCLUSIONES

Los conidios de P. fijiensis pueden ser obtenidos in vitro a 20ºC a partir de los 10 días de incubación en los medios de cultivo Agar Papa Zanahoria, Agar V-8 modificado y Agar Papa y Dextrosa, no obstante la mayor concentración de conidios se alcanzó en Agar Papa y Dextrosa a los 20 días de incubación a 20ºC.

Fue posible obtener síntomas sobre los cultivares Grande naine y FHIA-18 a partir de la inoculación artificial de suspensiones conidiales de P. fijiensis en casa de cultivo.

Mediante el empleo de una escala cualitativa del estado de los síntomas y las variables cuantitativas tiempo de evolución de los síntomas y tiempo de desarrollo de la enfermedad se pudieron diferenciar ambos cultivares que mantuvieron en casa de cultivo una respuesta similar a la observada en campo.

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