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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 6, No. 1: 9 - 14, enero - marzo, 2006
Análisis de diversidad genética mediante microsatélites (SSR) en cultivares del germoplasma cubano de yuca
Yoel Beovides1*, Martin Fregene2, Alfredo Alves3, Janneth P. Gutiérrez2, Charles Buitrago2, Jaime A. Marin2, Marilys D. Milián1, Sergio Rodríguez1, José A. Cruz1, Elianet Ruiz1, Dablys Guerra1, Humberto Toledo1, Omayra Roca1, Julia Albert1, Jesús García1, María Oliva1. *Autor para correspondencia.
1Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT), Apdo. 6, Santo Domingo. CP 53 000, Villa Clara, Cuba. e-mail: yoelbeovides@yahoo.es
2Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Cali. Colombia.
3Cassava Biotechnology Network (CBN).
RESUMEN
Se realizó un estudio con el objetivo de profundizar en el conocimiento de la diversidad genética de la yuca (Manihot esculenta Crantz), y para evaluar sus relaciones filogenéticas con parientes cultivados de África, Sur y Centroamérica, con vistas a garantizar un manejo sostenible de los recursos genéticos de que dispone Cuba. Se estudiaron 94 cultivares pertenecientes a la Colección Cubana de Yuca de acuerdo con su importancia económica y genética, además, se incorporaron 54 clones procedentes de África y América y otros 13 genotipos de interés genético. Los análisis de diversidad y diferenciación genética fueron desarrollados a partir de los datos de 34 marcadores microsatélites (SSR). Los índices de diversidad genética evidenciaron el alto polimorfismo observado para los microsatélites ensayados, el material vegetal procedente de Cuba mostró el mayor número promedio de alelos por loci con 5.8 y al igual que Guatemala presentó el 100% de los loci polimórficos; Cuba y Tanzania presentan los mayores índices de heterocigocidad media observada (Ho). La proporción promedio de individuos heterocigotos observados (Ho) fue alta (0.5918 ± 0.0351). Estos resultados, alcanzados por primera vez en Cuba en yuca, son importantes para su programa de mejoramiento genético y para el manejo sostenible de la diversidad genética en Cuba y en la región del Caribe.
Palabras clave: diferenciación genética, Manihot, marcadores, polimorfismo, relaciones filogenéticos
ABSTRACT
A study was carried out in order to make a deep analysis of the current knowledges cassava (Manihot esculenta Crantz) genetic diversity, and to evaluate its phylogenetic relationship with relatives cultivated in Africa, and South and Central America in order to facilitate a sustainable management of the genetic resources available in Cuba. A number of 94 cultivars from the Cuban cassava germplasm were studied according to their genetic or economic importance; besides, 54 clones from Africa and America, and 13 genotypes of genetic interest were incorporated. Diversity and genetic differentiation analysis were developed from data of 34 microsatellite markers (SSR). Genetic diversity indexes evidenced the high polymorphism observed for the tested microsatellites. The plant material, coming from Cuba, showed the highest allele average number per locus with 5.8 and as Guatemala, it illustrated 100% polymorphic loci. The highest mean heterozygosity indexes (Ho) are presented by Cuba and Tanzania. The mean rate of heterozygous individuals observed (Ho) was high (0.5918 ±0.0351). These results reported in Cuba for the first time in cassava, offer an important contribution to the genetic breeding program and to the sustainable management of the cassava genetic diversity in Cuba and in the Caribbean area.
Key words: genetic differentiation, Manihot, markers, polymorphism, phylogenetic relationship
INTRODUCCIÓN
Para facilitar la explotación y conservación de las colecciones de germoplasma, se hace necesario mantener una constante profundización en el entendimiento de la diversidad genética dentro de ellas, así como de la naturaleza de las relaciones genéticas existentes entre cada una de los genotipos que la conforman (He et al., 1995).
En el caso de la yuca (Manihot esculenta Crantz), con el desarrollo de la biología molecular, diversos
marcadores moleculares han sido utilizados exitosamente en el estudio de cultivares procedentes de diferentes regiones y países (Fregene et al., 1997; Fregene et al., 2003).
La novedosa técnica de microsatélites o de Secuencias Simples Repetidas (SSR) resulta atractiva para estudiar debido a su abundancia en el genoma vegetal, su alto polimorfismo y adaptabilidad a la automatización, y a su vez, ha resultado adecuada para la caracterización de germoplasma de yuca (Dixon et al., 2002; Azudia et al., 2002).
Aunque en Cuba dicha técnica no ha sido explotada con esa finalidad, la existencia de una amplia Colección de Germoplasma de Manihot esculenta Crantz con un rico patrimonio genético (Milián et al., 2000), su alto valor en la alimentación de los cubanos y la importancia de profundizar en el conocimiento de este acervo de genes en función de potenciar su conservación y explotación sostenible, así como la necesidad de establecer relaciones entre estas accesiones y sus parientes cultivados, justifican la realización de continuas investigaciones donde pueda ser incluida.
Por tanto, el presente estudio tuvo como objetivo profundizar en el conocimiento de la diversidad genética del cultivo en Cuba y evaluar sus relaciones filogenéticas con parientes cultivados de África, Centro y Suramérica, con vistas a garantizar el manejo sostenible de los recursos de que se dispone y como contribución al programa internacional de mejoramiento genético de la yuca.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Un total de 94 cultivares de acuerdo con su importancia económica y genética, fueron colectados en la Colección Cubana de Yuca, custodiada por el Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT, Cuba). Además se incorporaron 54 clones procedentes de África y América (12 de Nigeria, 10 de Tanzania, 12 de Guatemala y 20 de Suramérica) y otros 13 genotipos de interés genético recomendados por el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Colombia).
Extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) y microsatélites (SSR)
El ADN total de los clones cubanos se obtuvo por el método de Dellaporta et al. (1983), en el caso del resto de las accesiones estudiadas este fue cedido gentilmente por el Programa de Genética de Yuca del CIAT; su concentración y calidad se evaluó por fluorometría y por electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, respectivamente. Diluciones a una concentración final de 10 ng.ul-1 fueron usadas para los análisis de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por su sigla del inglés Polimerase Chain Reaction). Se evaluaron 36 marcadores SSR que representan una amplia cobertura del genoma de yuca (Fregene et al., 1997), elegidos por su patrón claro de bandeo y robustez en varios estudios de diversidad y seleccionados de un conjunto desarrollados en CIAT por Mba et al. (2001).
El coctel para el PCR se preparó como sigue: 50 ng de ADN, 0.2 mM de dNTPs, 2.5 ml de solución amortiguadora 10X, 2 mM de MgCl2, 1.25 mM cebador R, 1.25 mM cebador F, 1U de ADN polimerasa Taq. y H2O (calidad HPLC) hasta volumen final de 25 ml. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador PTC-100, utilizando el programa YUCADIV (con algunas variaciones según las condiciones específicas de cada microsatélite) que contiene los siguientes pasos: 1) 94 oC por 1 min, 2) 94oC por 30 seg 3) 55oC por 1 min. 4) 72oC por 2 min, 5) Desde el paso 2, se repite 29 veces, 6) 72 oC por 5 min, 7) queda a 4 oC durante tiempo indeterminado. Los productos de la amplificación fueron desnaturalizados y corridos a 100 watt en geles de poliacrilamida al 4%, usando un secuenciador automático ABI modelo 377 (Pelkin Elmer Inc.). Para el revelado se empleó la tinción con nitrato de plata según Fregene et al. (2002). La información de cada gel fue obtenida usando el paquete GENESCAN de ABI PRISM para Windows y el software GENOTYPER (Pelkin Elmer Inc.).
Los datos obtenidos (número de bandas, presencia o ausencia y peso de las bandas) fueron exportados a Microsoft Excel (Microsoft Inc.) y como peso de bandas para los análisis estadísticos correspondientes. Se utilizó un modelo de herencia estrictamente dialélico, por lo que las accesiones que mostraron tres o más alelos no fueron tomadas en cuenta (Fregene et al., 2003). Los marcadores monomórficos fueron excluidos del análisis final.
Estimación de la diversidad y diferenciación genética
Los análisis de diversidad y diferenciación genética fueron desarrollados a partir de los datos de 34 marcadores SSR, seleccionados por su naturaleza dialélica, patrones bien definidos y amplia cobertura del genoma de yuca.
La lectura de las bandas y la determinación de su peso se realizó con el programa Quantity one (Bio-Rad. Inc). Las distancias genéticas basadas en la proporción de alelos compartidos (Bowcock et al., 1994) fueron estimadas con la ayuda del programa MICROSAT (Minch, 1996). La matriz de distancias fue sujeta a un análisis de componentes principales (ACP) con el fin de obtener una estructura de las relaciones entre las accesiones usando el programa JMP (SAS Institute, 1995).
Los parámetros de diversidad genética y diferenciación fueron calculados mediante los paquetes estadísticos GENSURVEY (Vekemans et al., 1997) y FSTAT (Goudet, 1990), respectivamente. La diversidad genética dentro de las accesiones fue estimada usando los siguientes estadísticos: porcentaje de locus polimórficos, número promedio de alelos por locus polimórfico, heterocigocidad promedio observada (Ho), y la diversidad génica promedio (He) (Nei, 1978). Dado el pequeño tiempo de divergencia evolutiva para las accesiones, el modelo de alelos infinitos (MAI) (Kimura y Crow, 1964) fue asumido para todos los cálculos.
La diferenciación genética fue estimada por el estadístico FST (theta) (Wright, 1951) descrito por Weir y Cockerman (1984), con ayuda del software FSTAT (Goudet, 1995) y por el estadístico GST (Nei, 1978). Los estadísticos-F (FST, FIS e FIT) fueron estimados por alelo, por locus y en total. FSTAT realiza boottsrapping sobre loci y dado el gran número de loci no ligados empleados en este estudio, provee de rigurosas pruebas para las hipótesis de diferenciación genética. Intervalos de confianza fueron calculados por locus sobre muestras y sobre loci por jacknifing (200 replicaciones) y por boottstraping (1000 bootstraping) sobre loci. Se diseñó una matriz de comparación entre países con los valores de FST con la ayuda de FSTAT (Goudet, 1995) y la relación fue analizada por un análisis de cluster, usando el método UPGMA de NTSYS-PC (Rohlf, 1993).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De un total de 36 microsatélites (SSR) evaluados, dos resultaron monomórficos (SSRY-127 y SSRY-132), mientras que en el resto de los oligonucleótidos se pudo apreciar un alto nivel de amplificación y de polimorfismo para los 142 genotipos de yuca (Manihot esculenta Crantz) estudiados en cinco grupos de diferente origen geográfico: Cuba, Guatemala, Colombia, Nigeria y Tanzania.
El número de alelos observado en cada locus fluctúa entre dos y diez. Se encontraron 17 alelos únicos con baja frecuencia de aparición (en todos los casos menores al 25 %) en las accesiones cubanas, en 12 de los 34 marcadores polimórficos evaluados: SSRY 4 (0.04), SSRY 20 (0.006), SSRY 38 (0.005), SSRY 59 (0.006 y 0.079), SSRY 63 (0.033), SSRY 69 (0.023), SSRY 100 (0.011), SSRY 103 (0.052, 0.012, 0.012 y 0.006), SSRY135 (0.005), SSRY 151 (0.05), SSRY 171 (0.012 y 0.036) y SSRY 177 (0.014). También se encontraron alelos únicos en los genotipos de Colombia (6), Nigeria (3), Tanzania (3) y Guatemala (1).
Estimación de diversidad y diferenciación genética
Los índices de diversidad genética (Tabla 1) evidencian el alto polimorfismo observado para los microsatétiles ensayados, Cuba muestra el mayor número promedio de alelos por loci con 5.8 y al igual que Guatemala presenta el 100% de los loci polimórficos. Cuba y Tanzania presentaron los mayores índices de heterocigocidad media observada (Ho), la heterocigocidad media esperada (He) fue de 0.6292 ± 0.0120 (corregida para tamaños de muestra pequeños de acuerdo con Nei, 1978).
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Esto indica que, probablemente, la condición de isla ha provocado un proceso de diferenciación típico en los clones cubanos que les confieren características peculiares distintivas, y confirman la idea de un proceso de diferenciación entre materiales Africanos y Latinoamericanos, con una subestructura más pronunciada en las poblaciones Africanas (Fregene et al., 2000; 2003).
La proporción promedio de individuos heterocigotos observados (Ho) fue alta (0.5918 ± 0.0351). Los estimadores de diversidad genética He y Ho de la yuca cultivada tradicionalmente en Latinoamérica no fueron significativamente diferentes a los de África, lo que revela un nivel comparable de polimorfismo en Cuba respecto al encontrado en las otras poblaciones estudiadas. Resulta interesante que aunque la heterocigocidad total (Ht) fue alta (0.6538 ± 0.1770), sólo un 7.4 % de ésta se debe a diferenciación entre accesiones, el resto se debe a variaciones entre países (Hs).
Al evaluar la diferenciación genética cuando se realizaron estimaciones de comparación de valores Fst (theta) sobre todos los loci entre los países para evaluar el intercambio de material genético; todos los valores fueron superiores a 0.4 y comparables entre sí, el valor más alto se alcanzó entre Colombia y Tanzania (0.605), seguido de Guatemala y Colombia (0.561) y por Nigeria y Tanzania (0.560).
En el dendograma (UPGMA) de la comparación del índice de fijación (FST) entre genotipos de yuca cultivada de Cuba, Nigeria, Colombia, Guatemala y Tanzania se pudo observar la cercanía genética existente entre los clones cubanos, nigerianos y colombianos.
Al analizar las relaciones genéticas entre accesiones de diferente origen geográfico, la figura 1 muestra la distribución de las accesiones a partir del cálculo de las distancias genéticas basado en la proporción de alelos compartidos (PAC) y estimados como 1-PAC. Este es el estimador más apropiado cuando se usan datos de microsatélites, asumiendo el modelo de alelos infinitos (MAI) (Kimura y Crow, 1964) y cuando las relaciones son estrechas (Bertin et al., 2000).
Al evaluar la diferenciación genética cuando se realizaron estimaciones de comparación de valores Fst (theta) sobre todos los loci entre los países para evaluar el intercambio de material genético; todos los valores fueron superiores a 0.4 y comparables entre sí, el valor más alto se alcanzó entre Colombia y Tanzania (0.605), seguido de Guatemala y Colombia (0.561) y por Nigeria y Tanzania (0.560).
En el dendograma (UPGMA) de la comparación del índice de fijación (FST) entre genotipos de yuca cultivada de Cuba, Nigeria, Colombia, Guatemala y Tanzania se pudo observar la cercanía genética existente entre los clones cubanos, nigerianos y colombianos.
Al analizar las relaciones genéticas entre accesiones de diferente origen geográfico, la figura 1 muestra la distribución de las accesiones a partir del cálculo de las distancias genéticas basado en la proporción de alelos compartidos (PAC) y estimados como 1-PAC.Este es el estimador más apropiado cuando se usan datos de microsatélites, asumiendo el modelo de alelos infinitos (MAI) (Kimura y Crow, 1964) y cuando las relaciones son estrechas (Bertin et al., 2000).
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La representación gráfica de las relaciones genéticas entre las accesiones se obtuvo gracias a un análisis de componentes principales (ACP) apoyado en la matriz de distancias genéticas, donde los dos primeros componentes explican el mayor porcentaje de la variación total.
El ACP representa gráficamente las relaciones entre accesiones de diferente origen geográfico con la particularidad de que el mayor número de accesiones le corresponde a Cuba, el resto de los genotipos representan una estructura propia previamente estudiada por otros autores en su ACP correspondiente (Castelblanco, 2003; Fregene et al., 2003) y en la que se insertaron los genotipos cubanos.
Resulta interesante la tendencia de los clones cubanos a formar dos grupos y a presentar genotipos en posiciones particulares y alejadas de esos grupos. Igualmente sugerente se muestra la estrecha relación de algunos clones cubanos con dos genotipos de Guatemala y Tanzania en el cuarto cuadrante. Se sabe que la yuca guatemalteca, por estar en uno de los centros de origen, posee características muy peculiares y de interés genético (Castelblanco et al., 2004; Monte et al., 2004). En cuanto a los países africanos, tienen un punto de contacto con la yuca cultivada en Cuba, luego de muchos años de coincidencia en programas de mejoramiento con sede en el CIAT (Colombia), desde donde llegan cada año nuevos clones que evalúan los productores cubanos (Rodríguez et al., 2000).
Teniendo en cuenta el comportamiento de los genotipos provenientes de Cuba en comparación con el resto de los países africanos y latinoamericanos estudiados, se realizó un análisis de componentes principales (ACP) para evaluar la variación genética dentro de la población cubana de yuca estudiada. Pudo apreciarse que existe una amplia variabilidad entre las accesiones, aunque se formaron dos grupos bien definidos; algunos clones se alejan de esa estructura, debido a que en la mayoría de los casos se trata de materiales vegetales con características muy peculiares dentro del germoplasma cubano de yuca. Sobre estos aspectos deberá profundizarse en estudios futuros.
Los resultados encontrados en Cuba se corresponden con características peculiares de este germoplasma cultivado durante muchos años (desde los aborígenes) en el ambiente insular (Borda, 1975; Rodríguez et al., 2000), lo que ha generado diferenciación de esta población respecto a las que se encuentran en los continentes, independientemente de que se confirma el entrecruzamiento y la alta heterocigocidad presentes en la yuca antes expuesto.
La estrecha relación entre los clones cubanos y de ellos con el resto de los genotipos estudiados pudiera estar vinculado al propio proceso de extensión de la yuca por el mundo, hecho que se produce casi sobre los mismos criterios de selección de los productores lo cual los hace parecerse mucho entre sí. A su vez, muchos de los clones tienen un origen común o emparentado a través del programa de mejoramiento genético establecido en CIAT y que vincula diversos países y regiones.
Estos resultados se obtienen por primera vez en Cuba y la ubican dentro del selecto grupo de países que ha utilizado esta técnica para profundizar en el conocimiento de la diversidad genética presente en colecciones de germoplasma de yuca, lo cual es de incalculable valor científico y estratégico para desarrollar el programa nacional de fitomejoramiento del cultivo. También facilitaría el intercambio de germoplasma y incorpora una contribución concreta para su protección y uso sostenible.
De manera general, los análisis moleculares mostrados en este trabajo se realizan por primera vez con genotipos cubanos, colectados en diferentes zonas del país y significan aportes científicos importantes para perfeccionar las estrategias de conservación y utilización de los recursos genéticos custodiados en la colección cubana de yuca durante casi 40 años.
CONCLUSIONES
Los clones cubanos de yuca estudiados mediante microsatélites, muestran una alta diferenciación genética entre ellos y aunque su diversidad es alta, evidencian sus relaciones de parentesco con los genotipos cultivados de África, Centro y Suramérica.
Se confirmó que los genotipos cultivados de yuca muestran mayores diferencias dentro de las poblaciones que entre ellas, debido al propio proceso evolutivo del cultivo desde sus centros de origen.
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