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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 4, No. 2: 97 - 100, abril - junio, 2004
Empleo de sistemas de inmersión temporal para la multiplicación in vitro de brotes de Anthurium andraeanum Lind. var. Lambada
Nydia del Rivero Bautista1*, Elisa Quiala1, Daniel Agramante1, Raúl Barbón1, Wilder Camacho2, Lester Morejón1 y Marta Pérez1. *Autor para correspondencia.
1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de las Villas. Carretera a Camajuaní km 5½. Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e-mail: delriverobautista@yahoo.com.mx
2Dirección General de Estudios Tecnológicos Agropecuarios (DGETA). Carretera Cumuapa, Cunduacán, Tabasco, México.
RESUMEN
Dos métodos para mejorar la eficiencia en la multiplicación de brotes de Anthurium andraeanum Lind., fueron empleados para optimizar las frecuencias de inmersión de los explantes utilizando un Sistema de Inmersión Temporal. La relativa eficiencia del método convencional de cultivo en medio de cultivo semisólido para la multiplicación de brotes se comparó con el método de Sistema de Inmersión Temporal. El más alto índice de multiplicación de brotes se alcanzó con seis inmersiones al día cada cuatro horas durante dos minutos. Controlando los ciclos de inmersión se lograron plantas mejor desarrolladas y mayor coeficiente de multiplicación. Las plántulas multiplicadas a través de este método fueron cosechadas con 2 a 3 cm de longitud y de dos a cinco hojas después de un período de cultivo de 50 días. La formación de callos, hiperhidricidad y otras anormalidades no se observaron durante el proceso. Las plántulas obtenidas por este método fueron llevadas a enraizamiento en medio de cultivo semisólido. Este sistema evita riesgos de contaminación microbiana, aumenta rendimientos, reduce costos de mano de obra y de contenedores. Esta técnica por su relación beneficio-costo tiene significativas implicaciones para la propagación comercial del Anthurium.
Palabras clave: coeficiente de multiplicación, medios de cultivo, plántulas
ABSTRACT
Two methods to improve the efficiency in the multiplication of shoots of Anthurium andraeanum Lind., they were used to optimize the frequencies of immersion of the explants using a System of Temporary Immersion. The relative efficiency of the method conventional means of culture semisolid for the multiplication of shoots was compared with the method of System of Temporary Immersion. The highest rate of multiplication of shoots was reached using six immersions four times a day during two minutes, controlling the immersion cycles achieves plants better developed and bigger multiplication coefficient. The plantlets multiplied through this method were harvested with 2 to 3 cm of longitude containing from two to five leaves after a period of culture of 50 days. The formation of callus, hiperhidricity and other abnormalities were not observed during the process. The plants obtained by this method were taken to rooting in medium of culture semisólid. This system avoids risks of contamination, it increases yields, it reduces manpower costs and of containers. This technique for its relationship benefit-cost has significant implications for the commercial propagation of the Anthurium.
Key words: Culture medium, multiplication rate, plantlets.
INTRODUCCIÓN
Dentro de la familia de las Araceae el género Anthurium es el más popular y económicamente importante; estos son producidos y comercializados como flores de corte y plantas de maceta por lo vistoso de sus flores y follaje (Kuenhle, 1992). El método convencional de propagación de Anthurium es por semilla, pero éstas no pueden almacenarse y el tiempo de desarrollo de las plantas es muy largo. Las plantas propagadas por semillas presentan heterogeneidad (Geier, 1990). Muchos laboratorios comerciales de cultivo de tejidos utilizan técnicas de propagación por multiplicación de yemas; sin embargo, existen problemas de contaminación microbiana; además el índice de multiplicación es bajo (Hamidah, 1997). El desarrollo de un método que mejore este último aspecto para material vegetal élite de Anthurium es una contribución importante para países en vías de desarrollo.
Una técnica viable para la propagación de plantas ornamentales es la utilización de Sistemas de inmersión temporal (SIT) ya que los efectos positivos proporcionados por la misma en la multiplicación de brotes, microcortes, microtubérculos y germinación de embriones somáticos está limitada por factores como el tiempo de la inmersión (duración y frecuencia), el volumen del medio de cultivo y el volumen del recipiente, los cuales pueden, de una u otra forma, ser controlados por el investigador. La inmersión temporal mejora generalmente la calidad de la planta al aumentar el vigor del brote producido. La hiperhidricidad que afecta las especies en el medio de cultivo líquido puede eliminarse con estas técnicas (Hamidah et al., 1996; Berthouly y Etienne, 2002). Numerosos sistemas automatizados para la propagación in vitro basados en la adición y eliminación de medio de cultivo líquido han sido desarrollados por Tisserat y Vandercook (1985), Aitken-Christie y Jones (1987) y Aitken-Christie y Davies (1988). Alvard et al. (1993) demostraron la aplicación potencial de los sistemas de inmersión temporal por primera vez en la micropropagación de banano.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la utilización de los Sistemas de inmersión temporal para la multiplicación de brotes de A. andraeanum Lind.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y condiciones de cultivo
Los explantes utilizados en esta investigación fueron brotes obtenidos a partir de callos formados in vitro en hojas jóvenes de A. andraeanum Lind según Pierik (1976) (Figura 1). La variedad utilizada fue Lambada y las plantas donantes se obtuvieron en la empresa Varaflor, en la Provincia de Matanzas, Cuba.
El medio de cultivo utilizado contenía las sales inorgánicas propuestas por Murashige y Skoog (1962) (MS) al 100%, suplementadas con 1.0 mg. l-1 de tiamina, 30 g.l-1 de sacarosa y 2.5 g.l-1 de Gelrite como gelificante. Para los Sistemas de inmersión temporal el medio de cultivo empleado fue en estado líquido y para el control en estado semisólido. El pH de los medios de cultivo fue ajustado a 5.8 y esterilizado a 1.2 kgf.cm-2 durante 25 minutos para el medio de cultivo en estado líquido y 20 min para el medio de cultivo en estado semisólido. Los cultivos fueron incubados en cámara de luz solar con una densidad de flujo de fotones sintéticos (DFFF) que oscilaron entre 100-125 μmol m-2s-1 y una temperatura de 28±2 ºC.
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Descripción del Sistema de Inmersión Temporal (SIT)
El sistema fue diseñado con dos frascos de vidrio (Erlenmeyers) con un volumen cada uno de 1.0 litro. Se empleó un frasco que contenía los explantes y el otro funcionaba como reservorio del medio de cultivo. Ambos frascos estaban conectados uno del otro por medio de un tubo de silicona que fue insertado a través de la cubierta de cada recipiente y descendía hacia el fondo del frasco permitiendo el intercambio del medio de cultivo. El sistema contó con una conexión a través de filtros hidrofóbicos de 0.2 μm que garantizaban la esterilidad con la entrada del aire, mientras la presión del aire era controlada por un manómetro y el tiempo de inmersión era regulado por un software Biosys el cual controla dos válvulas eléctricas de tres pasos que permiten indistintamente la circulación de aire cuando abren y consecuentemente la circulación del medio de cultivo de un frasco a otro.
Efecto de la frecuencia de inmersión en la multiplicación de brotes
Se emplearon SIT con 500 ml de medio de cultivo líquido y brotes de plantas cultivadas in vitro con cuatro subcultivos. En cada SIT se colocaron 20 brotes como inóculo y se evaluó el efecto de las frecuencias de inmersión (cuatro y seis inmersiones por día) sobre la cantidad final de brotes obtenidos.
Los SIT se colocaron en cámara de crecimiento de luz solar con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos que oscilaron entre 100-125 μmol m-2s-1 y una temperatura de 28±2 ºC.
Después de 50 días de cultivo se evaluó el número promedio de brotes por sistema y el coeficiente de multiplicación se determinó dividiendo el número final de brotes obtenidos entre el número inicial de brotes colocados en cada SIT. También se evaluó la altura de las plantas (cm).
Los resultados fueron comparados con un tratamiento control en medio de cultivo semisólido en el cual se multiplicaron brotes de la misma especie vegetal mediante la metodología descrita por Pierik (1976) para la micropropagación de Anthurium andraeanum Lind., vía organogénesis para la fase de multiplicación.
Para el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el paquete estadístico de la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México (FAUANL) (Olivares, 1995). Los mismos se analizaron por medio de un ANOVA simple. Para detectar las diferencias entre las medias de los tratamientos a un nivel de significación del 5% se usó la prueba DMS.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de la frecuencia de inmersión en la multiplicación de brotes
En todos los tratamientos que se encontraban en SIT la formación de nuevos brotes se estimuló, así como el incremento en la altura de las plantas con respecto al control en medio de cultivo semisólido (Tabla 1).
Los intervalos de tiempo en la inmersión tuvieron un impacto significativo sobre el coeficiente de multiplicación de los brotes en el Sistema de inmersión temporal. El mayor coeficiente de multiplicación se obtuvo cuando se utilizó una frecuencia de seis inmersiones al día (Tabla 1); además el número de brotes y longitud de las plantas mostraron un mejor desarrollo expresado en la calidad de las plantas.
Usando esta frecuencia de inmersión el incremento en el número de brotes fue mayor que en el tratamiento donde se utilizaron cuatro inmersiones al día y el control.
En la frecuencia de inmersión de cuatro veces al día el coeficiente de multiplicación de los brotes disminuyó. De esta forma los intervalos de tiempo de inmersión juegan un papel decisivo en los coeficientes de multiplicación, esto concuerda con Berthouly y Etienne (2002) quienes afirmaron que la duración o frecuencia de inmersión es el parámetro más importante para la eficiencia del sistema y la inmersión también mejora la calidad del material vegetal produce un incremento en el vigor del brote o en el desarrollo de la planta y reduce la hiperhidricidad (Ziv, 2002) (Figura 2A).
Al comparar el Sistema de inmersión temporal con el método convencional se observó que n el coeficiente de multiplicación de brotes difirió entre los dos métodos probados. En el SIT se alcanzó un coeficiente de multiplicación de cerca de cuatro y ocho veces superior, en dependencia del número de inmersiones, al método convencional (Tabla 1). En el tratamiento donde se realizaron inmersiones seis veces al día se alcanzó el coeficiente más alto de multiplicación de los brotes con respecto al tratamiento de cuatro inmersiones al día y con el control en medio de cultivo semisólido. Este resultado se fundamenta según Debergh y Maene (1981), Robert y Smith (1990) y Preil y Hempfling (2002) en que los cultivos que se encuentran en medio de cultivo líquido la superficie del explante entra en contacto directo con el medio de cultivo lo que permite la captación más eficaz de nutrientes y liberar los metabolitos tóxicos que pudieran acumularse en el área del tejido que se dispersan más eficientemente en el medio de cultivo líquido que en el semisólido.
En este estudio no se observaron anormalidades en los brotes formados (Figura 2A). Hamidah et al. (1996) utilizando diferentes tipos de explantes (meristemoides, cultivo de brotes retardados, embriogénesis somática y nódulos) en medio de cultivo líquido para reducir los costos de producción y aumentar la propagación masiva; no observaron diferencias fenotípicas ni genotípicas en las plántulas obtenidas a través de los diferentes sistemas de regeneración in vitro. Estos autores concluyeron que estos cultivos son multiplicados rápidamente en medio de cultivo líquido y mantienen su estabilidad genética.
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CONCLUSIONES
Fue posible multiplicar brotes de A. andraeanum Lind., variedad Lambada en SIT. En el mismo se obtuvieron coeficientes de multiplicación mayores en comparación con el método convencional que emplea el medio de cultivo en estado semisólido.
AGRADECIMIENTOS
Los autores dejan explícito su agradecimiento a ANUIES por el soporte financiero de la beca doctoral de la autora principal de la cual forma parte este resultado.
REFERENCIAS
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Alvard, D, Cote F y Teisson C (1993)Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagation. Effect of temporary immersion of explants. Plant Cell Tissue Organ Cult 32: 55-60
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Debergh, P y Maene L (1981) A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture. Sci. Hort 14: 335-345
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Kuehnle, RA, Chen FCH y Sugii N (1992) Somatic embryogenesis and plant regeneration in Anthurium andraeanum hybrids. Plant Cell Reports 11: 438-442
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Tisserat, B, y Vandercook CE (1985)Development of an automated plant culture system. Plant Cell Tissue Organ Cult 5:107- 117
Ziv, M (2002) Simple Bioreactors for Mass Propagation of Plants. 1st Int. Symp. Liquid Systems for in vitro Mass Propagation of Plants, As, Norway
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