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Biotecnología vegetal 1: 57-60, enero-abril 2001
Control de la contaminación bacteriana en la semilla artificial de caña de azúcar a través de métodos de detección temprana
Yelenys Alvarado Capó*, Nayanci Portal, Leyanis García Aguila, Yudith Martínez, Marisol Freire Seijo, Elisa Quiala, Tatiana Pichardo, Idalia Herrera.* Autor para correspondencia
Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní Km 5½ Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e.mail yalvarado@uclv.etecsa.cu
RESUMEN
Los estudios para el establecimiento de la tecnología de la semilla artificial en caña de azúcar (Saccharum spp hibrido) no han estado exentos de las afectaciones producidas por la contaminación bacteriana, principalmente en los estadíos previos a la encapsulación de los embriones somáticos. Este trabajo tuvo como objetivo el control de la contaminación en líneas de plantas in vitro, callos y suspensiones celulares (variedad Cuba 87-51) que se utilizarían para obtener semillas artificiales de este cultivo. Para ello se emplearon dos métodos de detección temprana: siembra de fragmentos de tejido vegetal en medios de cultivo bacteriológicos y observación al microscopio óptico. Los mismos permitieron controlar la contaminación bacteriana antes de que se expresara en los medios de cultivo y garantizó que los materiales vegetales empleados para formar embriones somáticos de caña de azúcar estuvieran libres de contaminantes detectables.
Palabras clave: bacterias, callos, micropropagación, microscopía, suspensiones celulares
ABSTRACT
The studies for stablishment of artificial seed technology in sugarcane (Saccharum spp hybrido) have not been free of damage produced by bacterial contaminations, principally in the stage before somatic embryos encapsulation. The aim of this paper was the control of bacterial contamination on in vitro plant lines, callus and cell suspensions (var Cuba 87-51) that will be used for obtained artificial seed is this crop. For these purpose two methods for early detection of bacterial contamination were used: transfer plant material onto bacteriological media and microscopic observation. These methods permitted bacterial contamination control before bacterial growth expressing on the media and guarantied that plant material utilized for sugarcane somatic embryos formed were free of detectable contaminants.
Key words: bacteria, callus, cell suspension, micropropagation, microscopy
De forma general la contaminación bacteriana continúa siendo una de las principales causas de pérdidas en el cultivo de tejidos vegetales y la que ocasiona los daños más serios porque las bacterias pueden ser sistémicas y su detección es más difícil (George, 1993; Leifert et al., 1994). Numerosos géneros que han sido encontrados asociados a las plantas in vivo epifítica o endofíticamente se refieren frecuentemente como contaminantes in vitro. Estas bacterias pueden escapar al efecto de los desinfectantes y se introducen al cultivo in vitro con el explante inicial. Algunas especies tienen la capacidad de expresarse en el medio de cultivo de las plantas pero otras permanecen latentes en el interior de las células, en los espacios intercelulares o en los haces conductores y así quedan protegidos de los agentes químicos. A través de este mecanismo se propagan con el material vegetal y no se observa crecimiento bacteriano sobre el medio de cultivo por largos períodos de tiempo debido a la inhibición ocasionada por las altas concentraciones de sales, la sacarosa o el pH y solo se manifiestan en condiciones de estrés (Cassells, 1991; George, 1993).
La caña de azúcar (Saccharum spp hibrido) es un cultivo de gran importancia económica para muchos países. La incorporación de técnicas biotecnológicas novedosas tales como la embriogénesis somática (Ho y Vasil, 1983) y los sistemas de inmersión temporal (Lorenzo et al., 1998) junto a la micropropagación tradicional han contribuido a incrementar su productividad e introducir nuevas variedades a la producción comercial. No obstante, su cultivo in vitro no está exento de las afectaciones producidas por contaminantes microbianos y dentro de estos por las bacterias. Este es el mayor problema que atenta contra el éxito del cultivo de tejidos en las especies del género Saccharum (Taylor, 1997).
Desde que el concepto teórico original de semilla sintética (semilla artificial) fue propuesto por Murashige (1977), esta tecnología usando embriones somáticos ha sido desarrollada en especies como alfalfa (Fujji et al., 1989), zanahoria (Molle et al., 1993), abeto (Robert et al., 1993) y apio (Janick et al., 1993) entre otros. Los estudios para su establecimiento en la caña de azúcar han sido llevados a cabo por investigadores cubanos (Quiala et al., 1997; Tapia et al.,1998) y la contaminación bacteriana también ha producido afectaciones principalmente en los estadíos previos a la encapsulación de los embriones somáticos.
Por las ventajas que reviste contar con esta tecnología para la propagación de dicha especie vegetal, de gran importancia económica para el país, este trabajo tuvo como objetivo el control de la contaminación en líneas de plantas in vitro, callos y suspensiones celulares que servirían como material vegetal de partida para obtener semillas artificiales de caña de azúcar.
Se empleó la variedad de caña de azúcar Cuba 87-51 y los ensayos se realizaron con:
líneas de plantas in vitro (en fase de multiplicación) saneadas por electroterapia (Hernández et al., 1997), propagadas según la metodología propuesta por Jiménez (1995) y diagnosticadas como libres de patógenos sistémicos (Peralta, 1997).
callos con estructuras embriogénicas formados a partir segmentos de hojas inmaduras de plantas de campo (Freire, 1998).
suspensiones celulares establecidas a partir de callos con estructuras embriogénicas (establecidos a partir de segmentos de hojas inmaduras de plantas de campo o segmentos de la vaina de hojas enrolladas de plantas in vitro (Freire, 1998).
Para el control de la contaminación bacteriana se emplearon dos métodos de detección temprana: siembra de fragmentos de tejido vegetal en medios de cultivo bacteriológicos (Knauss, 1976, Leifert et al., 1994) y observación al microscopio óptico. Los contaminantes bacterianos detectados no fueron identificados.
Siembra de fragmentos de tejido vegetal en medios de cultivo bacteriológicos
A partir de resultados de ensayos preliminares se empleó el medio de cultivo Agar Wilbrink (g. l-1; Peptona bacteriológica 5, KH2PO4 0.5, NaSO3 0.05, MgSO4. 7H2O 0.25, sacarosa 20, agar 20, pH 7.4). Se tomaron discos de tejido vegetal de la base de las plantas in vitro así como pequeños fragmentos de callos ( aprox. 5mm de diámetro) que se dispusieron en la superficie del medio de cultivo en placas de Petri a razón de tres fragmentos por muestra. Las placas se incubaron a la oscuridad a 30°C hasta dos semanas. Fueron examinadas 208 muestras de callos y 125 de plantas in vitro en fase de multiplicación (Fase II).
El crecimiento bacteriano se observó alrededor de los fragmentos de tejido, principalmente en las áreas donde se realizaron los cortes. El mismo se distinguió por la coloración blanquecina, amarilla, rosada o morada. La textura varió de aguachenta a cremosa. Con respecto a las propiedades ópticas se observaron crecimientos transparentes, brillantes u opacos.
Se comprobó que este método puede ser utilizado para la detección de contaminantes del cultivo in vitro de la caña de azúcar antes de que se expresen en el medio de cultivo (Tabla 1). Además es fácil de realizar favorece el crecimiento de los posibles contaminantes y puede ser interpretado sin dificultad.
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El resultado del análisis corroboró la mayor calidad fitosanitaria que poseen las plantas propagadas in vitro (92% libres de contaminantes detectables) sobre los callos formados a partir de material vegetal de campo (78.32%). Además permitió desechar para el establecimiento de las suspensiones celulares las líneas de plantas y callos que presentaban contaminantes.
La detección temprana de los contaminantes bacterianos contribuye notablemente a su control y por tanto a disminuir las pérdidas in vitro. Este es uno de los métodos más usados ya que permite el crecimiento de un gran número de representantes bacterianos y aunque algunas especies tienen requerimientos específicos se obtienen buenos resultados utilizando dos o tres medios de cultivo ( Leifert et al., 1994; Reed et al., 1995 y Borrás et al., 1996).
Observación al microscopio óptico
Se examinaron muestras de suspensiones celulares con el objetivo de determinar al microscopio óptico (OLYMPUS) si presentaban contaminación por bacterias. De ellas 330 procedían de callos formados a partir de segmentos de hojas inmaduras de plantas de campo y 148 de segmentos de la vaina de hojas de plantas propagadas in vitro. Se realizaron preparaciones sobre portaobjetos con agua destilada estéril o se observaron directamente alícuotas de las suspensiones celulares al microscopio óptico con los objetivos de 40x y 100x.
El uso del microscopio óptico en el análisis de suspensiones celulares resultó una herramienta de trabajo útil y sencilla. Se logró discriminar entre las suspensiones que estaban contaminadas y las que no (Tabla 1). Es un método no destructivo, rápido y requiere de pequeñas cantidades de muestras. Se aplicó en el momento del subcultivo de las suspensiones o en los cambios de medio de cultivo. Para ello solo se utilizó el medio que normalmente se desecha. Esto permitió continuar trabajando solo con aquellas suspensiones en las cuales no se observaron células bacterianas.
Las bacterias comúnmente encontradas presentaban morfología bacilar y motilidad. Se observaron solas o agrupadas formando parejas y cadenas alrededor de las células y agregados celulares de caña de azúcar. No obstante, en algunas ocasiones se apreciaron también cocos solos, en tétradas y racimos así como levaduras. La aparición de estos últimos refleja inadecuados procederes en el laboratorio (Leifert et al., 1994).
Entre las características de las suspensiones celulares contaminadas se destacaron: aspecto viscoso o lechoso, turbidez en el medio de cultivo después de dejar sedimentar las células y en algunos casos fetidez. Se observaron diferentes grados de contaminación, no obstante, aún la presencia escasa de bacterias en el medio de cultivo alrededor de las células vegetales se registró como positiva.
Es significativo señalar que la turbidez en las suspensiones celulares no siempre fue sinónimo de contaminación por bacterias. Esto corroboró que el método de observación visual en este caso no resulta confiable. El análisis de las suspensiones al microscopio óptico resultó también una vía efectiva para detectar la contaminación por bacterias que en algunos casos pueden ser recalcitrantes al cultivo en el laboratorio.
Se comprobó además que el establecimiento de suspensiones celulares a partir de plantas in vitro (Freire, 1998) garantizó una disminución considerable de la contaminación bacteriana, en correspondencia con los resultados obtenidos por el método de siembra de fragmentos de tejido vegetal en medios de cultivo bacteriológicos.
Con los métodos utilizados se pudo controlar la contaminación bacteriana antes de que se expresara en los medios de cultivo, se desecharon las suspensiones celulares donde se observaron células bacterianas y se garantizó que los materiales vegetales empleados para la obtención de embriones somáticos de caña de azúcar encapsulados estuvieran libres de contaminantes detectables.
Estos resultados corroboraron el criterio de Kunneman y Faaij-Groenen (1988) de que el control efectivo de la contaminación consiste en la detección de los contaminantes en las primeras fases y luego prevenir su diseminación a través del cultivo.
REFERENCIAS
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