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Artculo Cientfico Biotecnologa Vegetal Vol. 6, No. 4: 203 - 206, octubre - diciembre, 2006
Susceptibilidad de aislados de Mycosphaerella fijiensis a los agentes de seleccin Higromicina B y Carbendazim
Mileidy Cruz-Martn1*, Yelenys Alvarado-Cap1, Mayra Acosta-Surez1, Michel Leiva-Mora1, Berkis Roque1, Minerva Lezcano2. *Autor por correspondencia.
1Instituto de Biotecnologa de las Plantas (IBP). Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuan km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: mileidy@ibp.co.cu
2Departamento de Qumica. Facultad de Qumica- Farmacia. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas.
RESUMEN
El estudio de las interacciones Musa - Mycosphaerella fijiensis asistido por herramientas moleculares como la transformacin gentica, puede contribuir a dilucidar nuevos mecanismos relacionados con la patognesis y con ello permitir el desarrollo de fungicidas altamente selectivos, as como, la elaboracin de estrategias de resistencia ms duraderas. El trabajo desarrollado tuvo como objetivo, determinar la Mnima Concentracin Inhibitoria (MCI) de dos sustancias antimicrobianas utilizadas comnmente como agentes de seleccin en ensayos de transformacin gentica de diferentes especies de Mycosphaerella (Higromicina B y carbendazim). Para ello se utiliz el mtodo de dilucin en agar y como inculo se emplearon suspensiones miceliales de nueve aislados de M. fijiensis procedentes de varias regiones de la provincia de Villa Clara y Ciego de vila. Se ensayaron concentraciones decrecientes de estos desde 32.0 a 0.015 mg.l-1. Se logr determinar la MCI de ambas sustancias antimicrobianas frente a los aislados de M. fijiensis mediante el mtodo utilizado. Se comprob adems, que la MCI de la Higromicina B para el 100% de los aislados se hall en valores inferiores a 8 μg.ml-1 y el 90% de los aislados mostraron, para el carbendazim, MCI menores e iguales a 0.125 μg.ml-1. El aislado CCIBP-Pf-57 no logr ser inhibido a las concentraciones ensayadas del Carbendazim. Los resultados evidencian la importancia de conocer las MCI de los agentes selectivos que se utilizan en la transformacin para as evitar escapes en la seleccin.
Palabras clave: Mnima Concentracin Inhibitoria, Pseudosercospora fijiensis, sustancias antimicrobianas, suspensiones miceliales, transformacin gentica
ABSTRACT
The study of Musa - Mycosphaerella fijiensis interactions supported by molecular tools such as the genetic transformation could contribute to elucidate new mechanisms related with the pathogenesis and through it to allow the development of new selective fungicides as well as the elaboration of more durable resistance strategies. This work had as objective, to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of different antimicrobial substances commonly used as selection agents in the genetic transformation study of different species of Mycosphaerella (Hygromycin B and carbendazim). The agar dilution method was used and mycelial suspensions of nine of M. fijiensis isolated by several regions of Villa Clara and Ciego de vila was used as inoculums. Concentrations of these substances from 32.0 to 0.015 mg.l l-1 were rehearsed. It was possible to determine the MIC of both antimicrobials substances against the M.fijiensis isolated using this method. The MCI of the Hygromycin B for 100% of the isolated was less to 8 μg.ml l-1and the rehearsed 90% of the isolated ones showed, for the carbendazim, MIC less or similar to 0.125 μg.ml l-1. CCIBP-Pf-57 isolated did not achieve to be inhibited to the rehearsed concentrations of the Carbendazim. The results obtained in this work evidence the importance of knowing the MIC of the selective agents that are used in the transformation avoiding escapes in the selection.
Key words: antimicrobial substance, genetic transformation, Minimal inhibitory concentration, mycelia suspension, Pseudosercospora fijiensis
INTRODUCCIN
La Sigatoka negra presenta una amplia distribucin en todo el mundo (Jcome, 2003) y est considerada como la enfermedad ms perjudicial para el cultivo de bananos y pltanos a nivel mundial (Pasberg-Gaul et al., 2000). Es causada por el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet (anamorfo Pseudocercospora fijiensis).
El control se realiza fundamentalmente a travs de aspersiones con productos qumicos siendo el benomil, dentro del grupo de los benzimidazoles, el primer fungicida sistmico utilizado. No obstante, este grupo ha sido considerado de alto riesgo debido al creciente desarrollo de aislados resistentes. Teniendo en cuenta la resistencia que han adquirido las poblaciones del patgeno a muchos fungicidas, as como, las implicaciones ecolgicas y toxicolgicas al medio ambiente y al propio hombre de tales productos, se desarrollan diferentes programas de mejoramiento gentico con el propsito de obtener cultivares resistentes a esta enfermedad (Marin et al., 2003).
Aunque la resistencia a la Sigatoka negra ha sido el objetivo de los programas de mejoramiento gentico durante varios aos, poco se conoce sobre lo inherente a la biologa y diversidad dentro de las poblaciones de Mycosphaerella fijiensis as como el conocimiento de su interaccin con Musa. Criterios clave para la asistencia a los programas de mejoramiento de pltanos y de manejos de la enfermedad (Carlier et al., 2003).
El conocimiento de las funciones implicadas en el proceso de infeccin de los hongos fitopatgenos es un reto importante para la proteccin de plantas (Lebrun, 2002). Una de las alternativas para su estudio es la utilizacin de herramientas de la gentica molecular que lleven a la caracterizacin de cantidades de genes requeridos para la expresin de la patogenicidad. Entre estas, se vislumbra con grandes posibilidades de xito la transformacin gentica de patgenos fngicos. Esto, en el patosistema Musa-Mycosphaerella fijiensis, contribuir al desarrollo de fungicidas altamente selectivos as como podr ser til para desarrollar estrategias de resistencia duraderas en las plantas. Varios investigadores han realizado estudios de transformacin gentica en diferentes especies de Mycosphaerella entre las que se encuentran M. graminicola (Payne et al., 1998), M.fijiensis, M. musicola y M. eumusae (Balint-Kurti et al., 2001) utilizando como agente de seleccin en sus protocolos la Higromicina B y el algunos casos carbendazim (Payne et al., 1998).
Teniendo en cuenta las razones expuestas anteriormente y la necesidad de conocer la Mnima Concentracin Inhibitoria (MCI) de estas sustancias frente a aislados de Mycosphaerella fijiensis para ser utilizados para tales fines, este trabajo tuvo como objetivo determinar la susceptibilidad de diferentes aislados a Higromicina B y carbendazim.
MATERIALES Y MTODOS
Aislados de M. fijiensis
Se utilizaron nueve aislados pertenecientes a la coleccin de cultivos microbianos del Laboratorio de Fitopatologa del Instituto de Biotecnologa de las Plantas. Los mismos fueron aislados a partir de hojas enfermas con sntomas en estado 6 (Four, 1985) del cultivar Grande naine colectadas en diferentes localidades de la provincia de Villa Clara (Remedios, Vueltas, Santo Domingo y Santa Clara) y de Ciego de vila.
Sustancias antimicrobianas
Higromicina B (SIGMA, 70 %)
Carbendazim en forma de un complejo con β-ciclodextrina (Complejo I), (Facultad de Qumica-Farmacia de la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas)
Determinacin de la Mnima Concentracin Inhibitoria (MCI)
La susceptibilidad de los aislados frente a Higromicina B y Carbendazim se evalu a partir de la determinacin de su MCI por el mtodo de dilucin en agar en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) (Biocen).
Se ensayaron concentraciones decrecientes de estos productos en diluciones seriadas dobles desde 32.0 a 0.015 mg.l-1. Se prepararon dos repeticiones de cada concentracin. Adems, se incluyeron placas de Petri con medio de cultivo PDA libres de sustancias antimicrobianas para ser usadas como controles de crecimiento.
El inculo utilizado fue una suspensin de micelio de cada aislado (3.5 μl, 5.105 fragmentos de micelio.ml-1) adicionado sobre la superficie del agar con micropipeta multicanal (Placas de Petri de 90mm ).
Las placas de Petri fueron marcadas por el reverso para determinar la orientacin de los puntos a inocular, en cada una se colocaron los aislados. Se inocul primero el control de crecimiento con PDA, despus, comenzando por la menor, se inocularon las placas de Petri que contenan las diferentes concentraciones del agente antimicrobiano. Posteriormente se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que la humedad de los inculos fue absorbida dentro del agar, se invirtieron y se incubaron a 28C en la oscuridad. Las evaluaciones se realizaron a las 120h. En ellas se comprob el crecimiento fngico en los controles y se tomo como MCI la menor concentracin del antimicrobiano que lo inhibi completamente.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Se logr determinar la MCI de la Higromicina B y del Carbendazim frente a los aislados de Mycosphaerella fijiensis mediante el mtodo de dilucin en agar y como inculo suspensiones miceliales.
La MCI de Higromicina B para el 66.6% de los aislados fue de 4 μg.ml-1 y para el 100% de los aislados se hall en valores menores e iguales a 8 μg.ml-1 (Tabla 1).
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Las MCI del carbendazim para el 90% de los aislados se encontraron en valores menores e iguales a 0.125 g.ml-1. Sin embargo, el aislado de Ciego de vila (CCIBP-Pf- 57) no pudo ser inhibido a las concentraciones ensayadas. El mismo se obtuvo en La Cuba, una plantacin comercial de Musa spp. donde los programas de aplicacin de fungicidas son comnmente utilizados. Segn Prez (1996) los fallos de control en campo para el carbendazim se puede observar a partir de niveles de sensibilidad entre 1-5 g.ml-1, y Payne et al. (1998) consideran resistentes al carbendazim aislados de M. graminicola con MCI mayores de 10 g.ml-1. Teniendo en cuenta estos criterios el aislado CCIBP-Pf- 57 puede considerarse resistente. Este resultado tiene gran importancia ya que puede ser empleado para obtener el alelo de la -tubulina, que le confiere resistencia a este compuesto, y emplearlo como marcador de seleccin en posteriores ensayos de transformacin gentica de este patgeno.
Varias son las investigaciones que para estudios de interaccin hospedero-patgeno, utilizan la transformacin gentica. Dentro del gnero Mycosphaerella se han realizado en varias especies empleando como agente de seleccin la Higromicina B (Payne et al., 1998; Balint-Kurti et al., 2001) y el carbendazim (Payne et al., 1998). La determinacin o el conocimiento de las MCI de estos compuestos frente a diferentes aislados es crucial para tales fines.
Por ejemplo, el conocer que la Mnima Concentracin Inhibitoria de Higromicina B para aislados de M. fijiensis, procedentes diferentes localidades est por debajo de 8 g.ml-1, posibilita adicionar el agente de seleccin a concentraciones superiores al valor de la MCI y no arbitrariamente como frecuentemente se encuentra referido en la literatura. Adems, permite en cuanto a las concentraciones del agente de seleccin, establecer protocolos generales de trabajo para la transformacin de este patgeno y evitar escapes.
El carbendazim (bencimidazol 2-il carbamato de metilo) es el componente activo de varios fungicidas sistmicos entre los que se encuenta el benomil y estn agrupados dentro de los benzimidazoles. En Cuba no se recomiendan ms de dos tratamientos por ao de estos productos. Prez (1996) consider los aislados resistentes como extremadamente competitivos y que eran frecuentes despus de no utilizar los benzimidazoles por varios aos. En el ao 1995 en Costa Rica, se encontraron altos niveles de resistencia al benomil despus de tres aos que se haba retirado este producto de los programas de control (Romero y Sutton, 1998).
Un aspecto a destacar en los resultados es que los aislados CCIBP-Pf- 57 y CCIBP-Pf-110 an teniendo un mismo origen geogrfico (La Cuba, en Ciego de vila) mostraron respuestas diferenciales en cuanto a susceptibilidad al carbendazim. Esto concuerda con los planteado por Marn et al. (2003) quienes informan la persistencia de aislados individuales resistentes a benzimidazoles dentro de las poblaciones de M. fijiensis.
La determinacin de la MCI utilizando suspensiones miceliales como inculo y no discos de micelio (como tradicionalmente se recomienda para otros hongos filamentosos; Hanson et al., 1996), permiti minimizar la dificultad que representa el crecimiento extremadamente lento de este patgeno en medios de cultivo slido (Meredith y Lawrence, 1969; Manzo et al., 2001). Adems, constituye una alternativa al uso de conidios como inculo. Segn Romero y Sutton (1997) la produccin de stos en M. fijiensis es un factor limitante para los ensayos de susceptibilidad ya sea por el bajo nmero de conidios que se obtienen o por la incapacidad de producirlos por algunos aislados.
REFERENCIAS
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