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Comunicación corta Biotecnología Vegetal Vol. 4, No. 4: 233 - 236, octubre-diciembre, 2004
Formación de callos en Phaseolus vulgaris L cv. Turrialba- 4 con Thidiazuron y ácido 2,4-diclorofenoxiacético
Jorge Pérez Pérez*1, Lourdes García Rodríguez2, Rafael Gómez Kosky2, Idalmis Bermúdez Caraballoso2, Yenis Padrón Montesino2, Damaris Torres Rodríguez2 y Carlos Romero Quintana2. *Autor para correspondencia.
1 Universidad de Granma, Carretera a Manzanillo, km 17, Peralejo, Bayamo. CP 85100, Granma. e-mail: jorge.perez@udg.co.cu
2 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas.
RESUMEN
Este trabajo tuvo como objetivo lograr la formación de callos con estructuras embriogénicas en Phaseolus vulgaris L. cv. Turrialba-4 con empleo de los reguladores del crecimiento Thidiazurón (TDZ) y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Se utilizaron como explantes cotiledones de semillas maduras germinadas in vitro en medio de cultivo con las sales MS. En los medios de cultivo que contenían 2,4-D se obtuvieron callos voluminosos y no compactos, mientras que los formados en los medios de cultivo que contenían TDZ (0.20 mg.l-1) eran menos voluminosos, compactos y con formación de estructuras embriogénicas.
Palabras clave: estructuras embriogénicas, medio de cultivo, reguladores del crecimiento
ABSTRACT
This work had like objective to obtain callus formation with embryogenic structure in Phaseolus vulgaris L. cv. Turrialba-4 with growth regulators Thidiazuron (TDZ) and 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (2,4-D). Mature cotyledon explants germinated in vitro seeds in culture medium with salts MS. In the culture medium with 2,4-D obtained voluminous and non compact callus, whereas the formed in the culture medium that contained TDZ were less voluminous, compact and with formation of embryogenic structures to 0.20 mg.l-1.
Key words: culture medium, embryogenic structures, growth regulator
INTRODUCCIÓN
El género Phaseolus, comprende alrededor de 30 especies de las cuales solamente cinco han sido cultivadas: P. coccineus, P. lunatus, P. polyanthus, P. acutifolius y P. vulgaris (frijol común). Este último, considerado desde el punto de vista económico el más importante, ocupa alrededor del 90% del área cultivada de especies Phaseolus en todo el mundo (Debouck, 2000; De Clercq et al., 2002).
El cultivo de tejidos y la regeneración de plantas en especies Phaseolus ha tenido serias dificultades desde los primeros intentos realizados por Hildebrandt desde 1963 hasta 1975 (Nagl et al., 1997). Desde entonces, las referencias sobre la regeneración de plantas a partir de callos en especies de Phaseolus son limitadas. La formación de callos con estructuras embriogénicas ha sido observada en P. acutifolius y P. vulgaris (Dillen et al., 1996; Zambre et al., 1998) y P. polyanthus (Zambre et al., 2001).
La composición y concentración de los reguladores del crecimiento en el medio de cultivo, son factores determinantes para el normal crecimiento y desarrollo de las plantas en los sistemas de cultivo in vitro. Las auxinas y citoquininas, han sido los reguladores del crecimiento más utilizadas en el cultivo de tejidos (Frank y Schmülling, 1999).
Mohamed et al. (1993) y Zambre et al. (1998), lograron regenerar plantas de P. vulgaris cv. Xan 159 y GN Tara, a partir de callos formados con diferentes concentraciones de Thidiazurón (TDZ) y Ácido indolacético (AIA).
En Cuba, hasta el momento de iniciarse estos estudios no existían referencias en relación con el cultivo in vitro del frijol común. En el contexto internacional los resultados han sido poco eficientes y restrictos a determinados genotipos como el P. acutifolius.
El objetivo del presente trabajo fue lograr la formación de callos con estructuras embriogénicas en Phaseolus vulgaris cv. Turrialba-4 con los reguladores del crecimiento Thidiazurón y ácido 2,4-diclorofenoxiacético.
MATERIALES Y MÉTODOS
Como material vegetal se emplearon semillas maduras de P. vulgaris L. cv. Turrialba-4 obtenidas en condiciones semicontroladas de casa de cultivo.
La desinfección y germinación de las semillas, se realizó según el protocolo propuesto por Dillen et al. (1997).
Una vez germinada la semilla, se tomaron como explantes los cotiledones desprovistos de la testa. Para la formación y multiplicación de los callos, se estudió independientemente el efecto de diferentes concentraciones de los reguladores del crecimiento 2,4-D (0.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 mg.l1-) y TDZ (0.0, 0.05, 0.20, 0.05 mg.l-1), en un medio de cultivo basal con las sales MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con AIA (0.05 mg.l-1) y sacarosa al 20%. El mismo fue solidificado con Gelrite (3.5 g.l-1) y el pH fue ajustado a 5.7 previo al autoclaveado.
Los explantes fueron cortados en los bordes y dividos en fragmentos de aproximadamente 0.5 cm2. Posteriormente se colocó un explante por tubo de ensayo (20 cm de alto x 1.5 cm de diámetro) con 10 ml de medio de cultivo y con la región axial en contacto con el medio de cultivo.
El experimento se desarrolló en condiciones de oscuridad a temperatura de 27± 2°C.
Se empleó un diseño completamente aleatorio. El tamaño de la muestra fue de 20 tubos de ensayo por tratamiento y cinco tubos de ensayo se consideraron una réplica experimental.
Las variables evaluadas fueron: a) número de explantes que formaron callos, b) número de callos con estructuras embriogénicas, c) color y consistencia de los callos (a través de observación visual), d) el crecimiento medio de los callos que se determinó según la escala (Tabla1), elaborada para este experimento.
Las variables número de explantes que formaron callos y número de callos con estructuras embriogénicas se expresaron en porcentaje. Para el análisis estadístico de los porcentajes se empleó la formula: %FC = NEC * 100/ TE, donde: (%FC) porcentaje de explantes con formación de callos, (NEC) número de explante con callos y (TE) total de explantes. Mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (p<0.05) se determinó la variabilidad entre los tratamientos.
RESULTADOS Y DISCUSION
Con el empleo del 2,4-D en el medio de cultivo no se encontraron diferencias significativas en el número de callos para las concentraciones utilizadas. Se obtuvo 100% de explantes con formación de callos en todos los tratamientos. Estos no eran compactos, de consistencia acuosa y coloración amarillo-blanquecina (Figura 1), características que son evidencia de callos no regenerables según (Schumann et al., 1995).
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Las características morfológicas de este genotipo indicaron que pudiera contener altos niveles de auxina endógena que al interactuar con las concentraciones exógenas presentes en el medio de cultivo incrementaron el volumen del callo. Según Yamada et al. (2000), el elevado nivel endógeno de auxinas en los frijoles es lo que podría explicar la formación exagerada de callos hiperhidratados. También Jiménez (2001), postuló que el 2,4-D en el medio de cultivo es una de las causas de incrementos en los niveles endógenos de AIA y que el abundante crecimiento de los callos puede deberse a que en condiciones de oscuridad no ocurre el efecto degradativo que provoca la luz sobre las auxinas.
En los medios de cultivo que contenían TDZ, los explantes mostraron una coloración verdosa durante las dos primeras semanas de cultivo, posteriormente se formaron callos de color blanco y pardo oscuro, en los bordes de los cotiledones así como en la parte inferior en contacto con el medio de cultivo (Figura 2a). En cuanto al crecimiento de los callos en los diferentes tratamientos con TDZ, se alcanzó un crecimiento medio de grado tres según la escala propuesta (Tabla 1), no se apreciaron diferencias significativas entre los tratamientos. Con este regulador del crecimiento se lograron callos compactos y de apariencia seca. Mediante una observación en el microscopio estereoscópico se evidenció la formación de callos con estructuras pro-embriogénicas en el tratamiento con 0.20 mg.l-1 de TDZ (Figura 2b).
La Tabla 2, muestra entre un 90 -100% de explantes con formación de callos en todas las concentraciones de TDZ, difiriendo significativamente del tratamiento control. También se observa que a concentración de 0.20 mg.l-1 se alcanzó un 20% de callos con estructuras embriogénicas.
Van Harten et al. (2004) refieren que los cortes realizados a los cotiledones facilitan la liberación de reguladores del crecimiento endógenos del explante al medio de cultivo estimulando la formación de callos. Según Klerk (2002) el TDZ se conjuga a muy bajas concentraciones después de 12-33 días en el medio de cultivo de formación de callos en Phaseolus. Esto fue demostrado en medio de cultivo con TDZ radiomarcado, observándose que el 60% del TDZ se encontraba libre en el medio de cultivo, lo cual puede ser la causa de su escaso crecimiento.
Muchos trabajos refieren que generalmente esta citoquinina induce la formación de callos a bajas concentraciones. Zambre et al. (2001) y Dillen et al. (2000) trabajando con TDZ y AIA en P. vulgaris observaron callos compactos de apariencia seca y coloración parda oscura.
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CONCLUSIONES
Se logró la obtención de callos con estructuras embriogénicas en Phaseolus vulgaris L cv. Turrialba- 4.
El TDZ fue el regulador del crecimiento que propició la formación de callos nodulares, encontrándose formación de estructuras embriogénicas con la concentración de 0.20 mg.l-1.
REFERENCIAS
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De Clercq, J, Zambre MA, Van Montagu M, Dillen W, Angenon G (2002) An optimized Agrobacterium-mediated transformation procedure for Phaseolus acutifolius A. Gray. Plant Cell Rep. 21:333-340
Dillen, W, De Clercq J, Goznes A, Van Montagu M, Angenon G (1997) Agrobacterium-mediated transformation of Phaseolus acutifolius A Gray. Theor. Appl. Genet. 94: (2)151-158
Dillen, W, De Clercq J, Van Montagu M, Angenon G (1996) Plant regeneration from callus in a range of Phaseolus acutifolius A. Gray genotypes. Plant Science 118: 81-88
Frank, M, Schmülling T (1999) Cytokinin cicles cells. Trends in Plant Sciences 4: 243-244
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Klerk, GJ (2002) Plant Hormones in Tissue Culture. En: Biochemical Plant Cell and Tissue Culture. Duchefa Biochemiev BV, pp. 19 23. Catalogue 2000-2001
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Yamada, T, Teraishi M, Hattori T, Nakamura K (2001) Transformation of azuki bean by Agrobacterium tumefasciens. Plant Cell Tissue Organ Cult. 64:4754
Zambre, MA, De Clerq J, Vranova E, Van Montagu M, Angenon G, Dillen W (1998) Plant regeneration from embryo-derived callus in Phaseolus vulgaris L. (common bean) and P. acutifolius A. Gray (tepary bean). Plant Cell Rep. 17: 626-630
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