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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 4, No. 3: 177-181, julio-septiembre, 2004
Comportamiento del Virus del Estriado del Banano en plantas propagadas in vitro de los cultivares de Musa híbridos FHIA 20 y FHIA 21
Orelvis Portal1*, José E. González2, Ricardo Hernández3, Mileidy Cruz1, Neyda Bacallao1, Tatiana Pichardo1, Ana L. Darías1, Leyanis García1 y Elio Jiménez1. * Autor para correspondencia.
1 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas.
Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e-mail: oportal@ibp.co.cu; villaport@yahoo.com
2 Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT). Santo Domingo. Apartado 6. Villa Clara. Cuba. e-mail josee@inivit.co.cu
3 Centro de Estudios para la Transformación Agraria Sostenible (CETAS). Carretera a Rodas, Km 12, Cienfuegos. ricardoh@fca.ucf.edu.cu
RESUMEN
Las pérdidas producidas por la Sigatoka negra y la Sigatoka amarilla han impulsado la introducción en Cuba de los híbridos de bananos y plátanos obtenidos por la Fundación Hondureña de Investigaciones Agrícolas que muestran resistencia parcial frente a esta enfermedad. Sin embargo, es bien conocida la alta incidencia del Virus del Estriado del Banano en dichos cultivares. Para evaluar el efecto del proceso de micropropagación, sobre las fluctuaciones de la concentración viral en el tejido, se introdujeron al cultivo in vitro plantas serológicamente positivas y negativas de los cultivares FHIA 20 y FHIA 21, previamente indexadas en campo (ELISA-DAS), posteriormente pasaron a fase de aclimatización para evaluar los resultados derivados de las pruebas de diagnóstico realizadas después de 3-6 meses de aclimatizadas. Como resultado del ELISA-DAS realizado a las plantas en fase de aclimatización (37) el 22.2 % de las plantas negativas, indexadas en campo, resultaron positivas, mientras que el 68.4 % de las plantas positivas, indexadas en campo, resultaron negativas, en ambos casos todas las plantas resultaron positivas al diagnóstico por la reacción en cadena de la polimerasa. En varias líneas con diagnóstico positivo se empleó la inmuno-microscopía electrónica como técnica de corroboración de los diagnósticos realizados.
Palabras clave: badnavirus, cultivo in vitro, diagnóstico, Musa
ABSTRACT
The losses taken place by the black and yellow Sigatoka have impelled the introduction to the country of the tetraploid hybrids from FHIA, however, at the present time, the high incidence of Banana Streak Virus in these hybrids is well known. To evaluate the effect of the micropropagatión process, on the fluctuations of the viral concentration in the tissue, they were introduced to the in vitro propagation positive and negative plants serologically tested of the cultivars FHIA 20 and 21, previously indexed in field (DAS-ELISA), later on they passed to phase of adaptation to evaluate the derived results of the diagnosis tests carried out after 3-6 months of transplanted. As a result of the DAS-ELISA carried out to the plants in phase of adaptation (37) 22.2 % of the negative plants, indexed in field, was positive, while 68.4 % of the positive plants, indexed in field, was negative, in both cases all the plants were positive to the diagnosis for PCR. In some cases, given the implication of the obtained results, was used the ISEM as technique of diagnostic, for the corroboration of the same ones.
Key Words: badnavirus, diagnostic, in vitro culture, Musa
INTRODUCCIÓN
Una de las principales limitantes de los programas de intercambio de germoplasma de bananos y plátanos lo constituye la certificación fitosanitaria del material vegetal (Frison y Sharrock, 1998).
Las pérdidas producidas por la Sigatoka negra y amarilla ha impulsado la extensión de los híbridos de la Fundación Hondureña de Investigaciones Agrícolas (FHIA), a la mayoría de las áreas bananeras de Cuba. Sin embargo es bien conocida la alta incidencia del Virus del Estriado del Banano (BSV, por sus siglas en inglés) en estos cultivares (Lockhart et al., 1998).
La severidad de la enfermedad causada por este virus es muy variable y probablemente depende de las condiciones ambientales, así como del hospedante y el genotipo viral (Lockhart, 1986). El BSV tiene como característica peculiar la presencia de una forma episomal encapsidada, una no encapsidada y otra integrada al genoma de la planta (Hull y Harper, 1998).
Esta problemática dificulta la fiabilidad de su diagnóstico y por está razón se ha hecho necesario la aplicación de técnicas moleculares más sensibles que permitan la detección del virus en todas sus formas posibles. Con el objetivo de monitorear el efecto del cultivo in vitro sobre el estado del virus al final del proceso de micropropagación, mediante diferentes técnicas de diagnóstico en plantas de los cultivares FHIA 20 y FHIA 21 (AAAB), se realizó este trabajo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal de partida
Como material vegetal donante se usaron plantas de los híbridos FHIA 20 y FHIA 21, plantadas en un suelo ferralítico rojo en la Estación Experimental Pedro Lantigua ubicada en Remedios, Villa Clara, Cuba.
Análisis serológico a plantas donantes
Las plantas fueron sometidas a un análisis serológico para el diagnóstico del BSV. Para ellos se usó el sistema comercial Agdia (ELISA-DAS) según las instrucciones del fabricante. La toma de muestras de hojas fue realizada en la segunda hoja de cada planta. La interpretación de los resultados se realizó tomando en cuentas las consideraciones realizadas por Peralta y Villoch (1999) que establecieron como plantas positivas aquellas cuyo valor de absorbancia fuera el doble del valor del control negativo.
Micropropagación
Dos grupos de plantas, de acuerdo con los resultados de su serología, fueron introducidos al cultivo in vitro según la metodología descrita por Orellana (1994). Después de cinco subcultivos en la fase de multiplicación y de la fase de enraizamiento, las plantas in vitro se transfirieron a la fase de aclimatización donde permanecieron durante 3-6 meses (45 días en cajas de polieturano de 70 alveolos con sustrato compuesto por compost y zeolita 3:1. Posteriormente se transplantaron a recipientes plásticos de 500 ml de capacidad con similar sustrato. Riego por aspersión dos veces al día).
Diagnóstico serológico y molecular a plantas in vitro en fase de aclimatización
Durante el sexto mes al menos a dos plantas por línea (para un total de 18 plantas in vitro de donantes negativos y 19 de donantes positivos) fueron hechos nuevos análisis por serología (ELISA-DAS) siguiendo un protocolo similar al descrito anteriormente así como reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Además se seleccionaron muestras positivas a las cuales se les realizó inmuno-microscopía electrónica (ISEM, por sus siglas en inglés).
Análisis por PCR
El ADN total se extrajo a partir de hojas de plantas in vitro (Braithwaite et al., 1995). Se usaron los cebadores BSV1 y BSV3 según Muylle (1998) para verificar si estaba integrado al genoma de la planta, con el siguiente programa de amplificación: 2 min a 96 °C, 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 50 oC y 90 s a 72 °C y para terminar 7 min a 72 °C. Los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 1 % y tinción con bromuro de etidio.
ISEM
Para la confirmación de los diagnósticos por ELISA-DAS se empleó la ISEM que es una técnica más sensible (Thottappilly et al., 1998). Se siguió la metodología de decoración con el anticuerpo policlonal (Agdia), y para aumentar su efectividad se combinó con semi-purificaciones (minipreps) del virus (Diekman y Putter, 1996) y tinción con acetato de uranilo (1%).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis serológico a plantas donantes
La técnica ELISA-DAS resultó efectiva para el diagnóstico de la forma episomal del BSV en plantas adultas en correspondencia con lo referido por Ndowora et al. (1999).
Los resultados del análisis serolólogico (ELISA-DAS) realizado a las plantas provenientes de campo permitió la creación de dos grupos (Tabla 1).
El grupo de plantas analizadas con resultados negativos mostró valores de absorbancia medios entre 0.43 y 0.48 mientras que el otro grupo consideradas como positivas fueron aquellas que tuvieron valores de absorbancia medios por encima del límite de corte, entre 1.47 y 2.01.
Diagnóstico serológico y molecular a plantas in vitro en fase de aclimatización
En las tablas 2 y 3 se muestran los resultados del análisis serológico y por PCR de las líneas de plantas in vitro aclimatizadas cuyos donantes eran positivos o negativos a la presencia del virus por serología.
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Según la tabla 2, como resultado del análisis serológico realizado se obtuvieron cuatro plantas in vitro positivas de dos líneas, lo que representa un 22 % de muestras que no habían sido detectadas anteriormente, esto puede estar dado por una activación de las secuencias integradas del BSV como consecuencia del estrés producido por el cultivo in vitro dando lugar a la aparición de una forma episomal del virus (Dallot et al., 2001; Harper et al., 2002), fenómeno que ha limitado su uso a través del cultivo de tejidos en los programas de mejoramiento de híbridos de bananos y plátanos (Frison y Sharrock, 1998).
El diagnóstico realizado mediante la utilización del PCR resultó positivo en todos los casos analizados, observándose la amplificación de un producto de alrededor de 600 pb, lo cual refuerza la teoría de que el BSV se encuentra integrado en todos los híbridos de Musa AxB (Harper et al., 1999; Ndowora et al., 1999; Geering et al., 2001).
Según la tabla 3, como resultado del análisis serológico realizado se obtuvieron seis plantas in vitro positivas y 13 negativas, lo que representa un 68.4 % de muestras que no fueron detectadas hasta ese momento debido a la ocurrencia de un saneamiento ocasionado por el cultivo de ápices meristemáticos (Hernández et al., 2002), o a una simple disminución de la concentración viral en el tejido.
En el experimento no se logró apreciar una correspondencia en cuanto al comportamiento del virus después de pasar por el cultivo in vitro dado por la no homogeneidad de los resultados serológicos dentro de las plantas de una misma línea.
Una réplica de cada una de las plantas que resultaron positivas por diagnóstico serológico en fase de aclimatización fueron seleccionadas para corroborar la presencia del BSV a través de ISEM. Todas las observaciones realizadas al microscopio electrónico permitieron la identificación de partículas típicas del BSV (Figura 1), lo que permitió confirmar los resultados obtenidos en los análisis serológicos de las plantas aclimatizadas.
De forma general se pudo observar que hubo una correlación entre la presencia de síntomas en las plantas y su diagnóstico positivo por ELISA, que concuerda con lo referido por Lockhart (1986) y Daniells et al. (2001).
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REFERENCIAS
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