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Efecto de la temperatura, pH y detergentes sobre la actividad
antifúngica de filtrados de cultivo bacterianos frente a Mycosphaerella
fijiensis
Effect of temperature, pH and detergents on the antifungal activity of bacterial culture filtrates against Mycosphaerella fijiensis
Eilyn Mena*, Mileidy Cruz-Martín, Mayra Acosta-Suárez, Berkis Roque, Michel Leiva-Mora, Yelenys Alvarado-Capó. *Autora para correspondencia
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: eilyn@ibp.co.cu
RESUMEN
Las bacterias asociadas a cultivos han sido estudiadas como potenciales agentes de biocontrol. Sin embargo, se han desarrollado pocas investigaciones sobre la interacción Musa spp.- Mycosphaerella fijiensis-bacterias asociadas a Musa. En consecuencia, se desconocen los metabolitos bacterianos involucrados y el efecto sobre ellos de factores físicos y químicos. Por ello, este trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de la temperatura, el pH y la acción de detergentes sobre filtrados de cultivo con actividad antifúngica in vitro frente a Mycosphaerella fijiensis. La inhibición del crecimiento del patógeno se evaluó mediante lectura de absorbancia a DO 565 nm. Se comprobó que la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos frente a M. fijiensis, varió en presencia de diferentes valores de temperatura, pH y tipos de detergentes y esto se relacionó con la cepa bacteriana. Los resultados sugirieron la posible naturaleza proteica de los metabolitos con actividad antifúngica.
Palabras clave: bacteria, control biológico, metabolitos antifúngicos
ABSTRACT
The bacteria associated to crops have been studied as potential biocontrol agents. However, few investigations on the interaction Musa spp. - Mycosphaerella fijiensis-Musa associated bacteria have been developed. Consequently, bacterial metabolites involved and the effect on them of physical and chemical factors remain unknown. Therefore, this study aimed to determine the effect of temperature, pH and detergents on bacterial culture filtrates with antifungal activity in vitro against Mycosphaerella fijiensis. The pathogen growth inhibition was assessed by absorbance reading at OD 565nm. It was found that the antifungal activity of the bacterial culture filtrates against M. fijiensis, varied in the presence of different values of temperature, pH, and types of detergents and this was related to the bacterial strain. The results suggested the possible protein nature of the metabolites with antifungal activity.
Keywords: bacteria, biological control, antifungal metabolites
Los plátanos y bananos se encuentran entre los cultivos más importantes a nivel mundial. Constituyen una fuente natural de fibra y minerales como el potasio. Las plantaciones de este cultivo son afectadas por Mycosphaerella fijiensis Morelet, agente causal de la Sigatoka negra. Esta enfermedad es considerada la más perjudicial, ya que provoca una necrosis severa en la hoja y es difícil de combatir (Churchill, 2010). Su control está dado principalmente por el manejo cultural y la aplicación de fungicidas. El empleo de fungicidas químicos no es sustentable, debido a su alto costo para pequeños productores, la contaminación ambiental y la resistencia que ha generado en el patógeno (Fu et al., 2010). En este contexto, el control biológico surge como una alternativa que podría permitir a los productores combatir la enfermedad y continuar dentro de la actividad agrícola sin afectar la sostenibilidad del medio ambiente en los sistemas de producción de plátanos y bananos. En esta área se incluye el uso de microorganismos antagonistas, la adición de sustratos foliares que permitan incrementar las poblaciones bacterianas y la inducción de resistencia a patógenos (Patiño et al., 2007). En correspondencia con ello se han realizadoinvestigaciones en géneros bacterianos tales como: Bacillus, Pseudomonas y Serratia (Rao-Podile y Neeraja, 2010). No obstante, pocas son las investigaciones en la interacción Musa spp.- Mycosphaerella fijiensis-bacterias asociadas a Musa. Ceballos et al. (2012) realizaron investigaciones a partir de bacterias de la filosfera de Musa sp. contra Mycosphaerella fijiensis pero es limitado el conocimiento de las características de los metabolitos producidos por estas y su efecto sobre el patógeno.
Este trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de la temperatura, el pH y la presencia de detergentes sobre filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in vitro frente a Mycosphaerella fijiensis.
Se emplearon cinco cepas bacterianas cuyos cultivos filtrados inhibían el crecimiento in vitro de M. fijiensis (Poveda et al., 2010), pertenecientes a la Colección de Cultivos Microbianos del Instituto de Biotecnología de las Plantas: CCIBP-M27, CCIBP-B3, CCIBP-A4, CCIBP-C5 y CCIBP-B.1. Las bacterias se cultivaron en medio de cultivo Caldo Nutriente (CN), durante 48 horas en agitación y 28ºC. Posteriormente, se centrifugaron por 15 minutos a 4ºC y 10 000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5810 R). Para eliminar las células bacterianas, el sobrenadante fue filtrado (0.22 µm) y se conservó a 4ºC.
Para determinar el efecto de la temperatura, el pH y detergentes sobre los filtrados de cultivo bacterianos, estos se sometieron a los diferentes tratamientos que se explican más adelante. Posteriormente, en todos los casos, se evaluó la inhibición del crecimiento de M. fijiensis mediante el método de microdilución en placas de 96 pocillos (Cruz-Martín et al., 2013). Para ello, se utilizó una dilución (1:10); 25 µl de filtrado de cultivo sometido a diferentes tratamientos y 225 µl de una suspensión micelial de M. fijiensis (aprox. 5.0x105 fragmentos de micelio/ml) en medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (PDB). Las placas se incubaron durante 48 horas y 28ºC. Transcurrido el tiempo de incubación se midió la absorbancia a DO 595 nm en espectrofotómetro (Thermo Labsystems Opsys MR). Se utilizaron ocho réplicas por tratamiento. Como control de crecimiento se colocaron en cada placa ocho repeticiones con 250 µl de una suspensión micelial de M. fijiensis en PDB.
Para comprobar el efecto de la temperatura se conformaron cinco tratamientos que incluyeron las siguientes: -80, 4, 28, 60 y 121ºC. En cada una se incubaron 300 µl del filtrado de cultivo de las cepas bacterianas durante 20 minutos. Pasado ese tiempo, se evaluó la inhibición del crecimiento de M. fijiensis como se describió anteriormente.
Con el objetivo de determinar el efecto del pH se siguió el protocolo propuesto por Munimbazi y Bullerman (1998). Para cada tratamiento (pH 2, 4, 6, 7 y 8) se tomaron 300 µl de los filtrados de cultivo que se diluyeron en agua destilada estéril (1:1) y se ajustó el pH. Se mantuvieron en estas condiciones durante 20 minutos. Pasado ese tiempo, se evaluó la inhibición del crecimiento de M. fijiensis como se mencionó más arriba.
El efecto de los detergentes se constató a través de cuatro tratamientos. Los detergentes utilizados fueron: el aniónico SDS (del inglés: Sodium Dodecyl Sulphate), el catiónico CTAB (del inglés: Hexadecyltrimethyl Ammonium Bromide), además de los no iónicos Triton x 100 y Tween-80. Cada detergente se añadió a 100 µl de filtrado de cultivo de cada cepa para una concentración final de 1%, se incubaron a 28ºC y oscuridad, durante cuatro horas. Pasado ese tiempo se evaluó la inhibición del crecimiento de M. fijiensis.
Se comprobó que los filtrados de cultivo bacterianos obtenidos eran termoestables, excepto el de CCIBP-M27; que solo inhibió el crecimiento de M. fijiensis a 28ºC. Por otra parte, CCIBP-A4 mostró una disminución de la actividad antifúngica a 121ºC (Tabla 1).
Además, se determinó que la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos, varió a diferentes valores de pH en dependencia de la cepa. En los filtrados de cultivos de CCIBP-A4 y CCIBP-C5 se evidenció inhibición del crecimiento de M. fijiensis en todos los valores de pH evaluados. Sin embargo, los filtrados de cultivo de las cepas bacterianas CCIBP-M27, CCIBP-B3 solo mostraron actividad antifúngica a pH=2, pH=6 respectivamente; y pH=2 y 4 en el caso de CCIBP-B.1 (Tabla 1).
El filtrado de cultivo de CCIBP-B3 mantuvo su actividad inhibitoria del crecimiento fúngico al ser expuesto a la acción de todos los detergentes empleados en el estudio. Sin embargo, en el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-B.1 se limitó ante la presencia de los detergentes iónicos evaluados. Por otra parte, los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5 en presencia del detergente catiónico CTAB afectaron el crecimiento del patógeno.
Analizar el efecto de factores físicos y químicos sobre la actividad antifúngica de bioproductos que puedan ser empleados para el combate de enfermedades en plantas tiene gran importancia. Ello contribuye a su caracterización y a garantizar la estabilidad sin perder la actividad biológica.
En este sentido, Munimbazi y Bullerman (1998) determinaron la estabilidad de metabolitos bacterianos a diferentes valores de pH y comprobaron que los producidos por Bacillus pumilus eran estables en el rango de 2 a 10.
La mayor inhibición (99%) del crecimiento del patógeno Aspergillus parasiticus se produjo a pH=2 y para pH con valores entre 4 y 6 fue de 92%. De igual forma, la mayor actividad inhibitoria para las cepas CCIBP-M27, CCIBP-B3 y CCIBP-B.1 se produjo entre estos valores de pH.
Por otra parte, el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-B3 mantuvo su actividad antifúngica en presencia de todos los detergentes ensayados. Ello sugiere que si en su composición hay presencia de péptidos el grupo funcional no está expuesto a la desnaturalización por los agentes químicos empleados. Al contrario, según los resultados para el filtrado de cultivo de CCIBP-B.1, su grupo funcional tiene una posible composición no iónica y está expuesto a la acción de compuestos desnaturalizantes. Munimbazi y Bullerman (1998) emplearon también detergentes (TritonX-100, Tween-20, Tween-80, Nonidet P-40, SDS, CTAB y Deoxycholic acid). De ellos, solo Tween-80 redujo la actividad antifúngica de los metabolitos producidos por B. pumilus y Nonidet P-40 la inhibió completamente y concluyeron que la actividad inhibitoria estaba dada por un péptido de estructura cíclica.
Similares resultados han sido encontrados por Lee et al. (2008). Estos autores plantearon que la actividad de los metabolitos antifúngicos, purificados de Paenibacillus lentimorbus WJ5 no fue afectada por la exposición de estos a diferentes temperaturas (-80, 60 y 121), solo a 121ºC por cinco horas se redujo la actividad antifúngica. En base a estos resultados concluyeron que presentaban alta termoestabilidad y la actividad antifúngica estaba dada por la presencia de pequeños péptidos. Además, en su estudio los metabolitos antifúngicos producidos por P. lentimorbus WJ5, eran activos en un amplio rango de pH (2 y 13). Estos autores determinaron que la exposición de los compuestos antifúngicos a los detergentes (SDS y Tween-80 al 1%) no afectó su actividad antifúngica. Sin embargo, la inhibió en presencia del detergente catiónico CTAB (1%), al igual que lo obtenido en el presente estudio para el filtrado de cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5. A partir de estos resultados infirieron que era indicativo de la naturaleza aniónica del grupo funcional involucrado en el mecanismo antifúngico.
De igual forma, Hu et al. (2008) plantearon que los compuestos con actividad antifúngica presentes en el sobrenadante del medio de cultivo de la cepa Bacillus subtilis QM3, eran termoestables; ya que al ser sometidos a diferentes tratamientos térmicos, a 100ºC se redujo la actividad inhibitoria pero se vio disminuida a temperaturas superiores (121ºC, durante 20 minutos). Ellos sugirieron que quizás la actividad antifúngica estaba dada por un antibiótico perteneciente a la familia de las iturinas.
Los filtrados de
cultivo bacterianos empleados en este trabajo mostraron actividad antifúngica
frente a M. fijiensis ante la variación de diferentes factores
físicos y químicos. La composición de los filtrados de
cultivo parece estar relacionada con compuestos de naturaleza proteica. En este
sentido, los metabolitos presentes en el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-M27
pudieran ser pequeñas proteínas no estables, sin embargo en el
caso de los presentes en CCIBP-B.1 pudieran ser
péptidos pequeños estables, no iónicos. En el caso de los
metabolitos presentes en el filtrado de cultivo de CCIBP-B3 pudieran ser péptidos
con estructura cíclica y los péptidos presentes en CCIBP-A4 CCIBP-C5
podrían tener grupos funcionales aniónicos expuestos.
Atendiendo a estos resultados se requieren nuevos estudios que permitan corroborar la naturaleza de los metabolitos responsables de la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo de las cepas en estudio.
CONCLUSIONES
La actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos frente a M. fijiensis, varió en presencia de diferentes valores de temperatura, pH y tipos de detergentes y esto se relacionó con la cepa bacteriana.
REFERENCIAS
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