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Reseña Bibliográfica Biotecnología Vegetal Vol. 5, No. 2: 67 - 79, abril - junio, 2005
Aplicaciones de la biotecnología a la propagación de la papaya
Laisyn Posada Pérez
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba CP 54 830. e-mail: laisyn@ibp.co.cu, laisynpp@yahoo.es
RESUMEN
La papaya (Carica papaya L.) es una de las principales frutas que se consumen a nivel mundial. El uso de la biotecnología como una herramienta en la propagación de plantas élite de este cultivo puede ser una vía alternativa para su rápida multiplicación, así como la introducción a escala comercial de nuevas variedades o híbridos. Este trabajo persiguió como objetivo abordar de manera general las principales consideraciones científicas sobre el uso de la biotecnología vegetal como herramienta para la propagación y conservación in vitro de la papaya. Se reflejan, además, algunas experiencias del colectivo de investigadores del Instituto de Biotecnología de las Plantas lo que brinda un complemento práctico a la reseña.
Palabras clave: Carica papaya, conservación in vitro, embriogénesis somática, híbrido IBP 42-99, micropropagación
ABSTRACT
The papaya (Carica papaya L.) is one of the most world wide consumed fruit. The use of the biotechnology as a tool in the micropropagation of elite plant in this specie can be an alternative to acelarate its multiplication, as well as the comercial scale introduction of new varieties and hybrids. This work has as objetive to approach a general overview of the principal scientific considerations about the plant biotechnology use as a tool for the papaya in vitro propagation and conservation. Also, in this work, are showed some experience of the researchersfrom the Institute of Plants Biotechnology , that have a practical complement to this review.
Key words: Carica papaya, hybrid IBP 42-99, in vitro preservation, micropropagation, somatic embryogenesis
INTRODUCCIÓN
La papaya (Carica papaya L.) es originaria de América Central y su cultivo se caracteriza por ser productivo en corto tiempo y de forma continua durante todo un año. En el mundo en el 2005 la producción ascendió a 6 708 551 toneladas (FAO, 2005). Cada día está cobrando una mayor importancia económica a nivel mundial, debido a que se puede consumir como fruta fresca o procesarse para obtener otros productos como dulces, jaleas, licuados y encurtidos, además por su contenido de nutrientes. También posee un gran potencial de industrialización en el área farmacéutica, culinaria, médica, industria cervecera y bebidas no alcohólicas (Acuña, 2005).
Los productos obtenidos a partir de su industrialización son los siguientes: papaína, pectina, esencias, aceites, diversos medicamentos, néctares, conservas, miel, jalea, mermeladas, jugos, confitado, etc. También es utilizada para tratamientos médicos de insuficiencias gástricas y duodenales, jarabes expectorantes, elaboración de medios de cultivo y suavizadores de chicles entre otros (Khan y Iqbal, 2000).
Algunos países de Asia, África y Oceanía destinan los frutos para la obtención de látex, de este líquido lechoso que es abundante en los frutos verdes, se extrae la papaína, la cual se usa ampliamente como ablandadora de carnes y también en la clarificación de cervezas y otras bebidas. Además, es de utilidad para suavizar las lanas, así como en el curtido de las pieles. Tiene gran aplicación en la fabricación de caucho y en la preparación de remedios caseros, etc. (Caro y Villeneuve, 2000).
En Cuba se han utilizado diferentes variedades que se han distinguido unas de las otras por su porte, su susceptibilidad a plagas y enfermedades, por la composición de las inflorescencias (masculinas, femeninas y hermafroditas), forma, tamaño, color, sabor y consistencia de los frutos.
Según el Ministerio de la Agricultura (MINAGRI, 2005) las variedades comerciales que se utilizan en Cuba son: Maradol Roja, NICA III y Criolla y se estudian otras variedades introducidas tales como Tainung No.1, Tainung No.2, Tainung No.3, Know You y el híbrido Red Lady.
La papaya se propaga tradicionalmente por semillas y esquejes. Sin embargo, los híbridos resultantes de los trabajos de mejoramiento genético para aumentar la calidad de las producciones pueden tener problemas en su propagación y conservación a través de semillas certificadas, por lo tanto estos tienen que ser multiplicados vegetativamente.
Las técnicas de cultivo de tejidos como la micropropagación (Fitch et al., 2005) y la embriogénesis somática (Banerjee, 2002) se han puesto a punto para la propagación in vitro de esta especie. No obstante, Drew y Manshardt (1997) refieren que la multiplicación in vitro de la papaya solo se justifica económicamente si la misma se realiza para un genotipo híbrido.
En el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad Central Martha Abreu de Las Villas se ha obtenido un híbrido (IBP 42-99) que presenta frutos más pequeños que la variedad Maradol Roja y un alto brix (Posada et al., 1999). El mismo se ha micropropagado y se encuentra en fase de evaluación frente a otros genotipos de papaya.
El desarrollo de nuevas técnicas de conservación, sobre todo en aquellas especies en las que los procedimientos tradicionales no son adecuados, permiten preservar de un modo más satisfactorio los recursos genéticos de plantas cultivadas, entre otros cultivos importantes para países en vías de desarrollo (Ortiz, 2000).
A nivel internacional se han empleado diversos métodos y técnicas para la conservación in vitro de papaya a mediano y largo plazo. Por ejemplo, es el caso de Suksa et al. (1997) en la disminución del crecimiento de ápices. En la crioconservación de ápices por vitrificación (Ashmore et al., 2000; Wang et al., 2005). Buerhing (2003) elaboró una técnica para criopreservación de cultivos embriogénicos.
Este trabajo persiguió como objetivo abordar de manera general las principales consideraciones científicas sobre el uso de la biotecnología vegetal como herramienta para la propagación y conservación in vitro de la papaya. Se reflejan, además, algunas experiencias del colectivo de investigadores del Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, lo que brinda un complemento práctico a la reseña.
ORIGEN, CLASIFICACIÓN Y CULTIVO DE LA PAPAYA
Origen
La Papaya es una planta propia de América tropical (Reyes, 1983). La descripción más antigua es la del cronista Oviedo en 1535, que señala su origen en la región de Panamá (Muñoz, 1983). Según Van Leare (1959) su origen estaba en el centro y sur de México, sin embargo Litz (1983) señaló que todas las especies de Carica son del norte y sur de América. En Cuba se le conoce desde épocas muy remotas, se tiene la seguridad de que existía desde el siglo XIX y adquirió importancia en las décadas del treinta y cuarenta del siglo XX Martínez 1983 (citado por Pedroso, 1990). Este frutal se ha difundido ampliamente en las regiones tropicales y subtropicales, debido a la gran variedad de sus semillas.
Clasificación
División: Magnoliophyta Clase: Magnoliosida Subclase: Dilleniidae Orden: Violales Familia: Caricaceae Género: Carica Especie: Carica papaya L.
Las Caricaceae son una pequeña familia de plantas dicotiledóneas con cuatro géneros: tres con un origen en América tropical (Carica, Jarilla, Jacaratia) y uno Cylicomorfa de África ecuatorial. Las Caricaceae han sido clasificadas en varias ocasiones en familias tales como: Cucurbitaceae, Passifloraceae, Bixaceae, y Papayaceae. Han sido descritas aproximadamente 71 especies, sin embargo Badillo (1993) redujo el número a 30 especies con la siguiente distribución: Carica 21 especies, Cylicomorfa dos especies, Jacaratia seis especies, y Jarilla una especie.
La Papaya (Carica papaya) es la más importante desde el punto de vista económico de las 21 especies de Carica. Entre sus nombres comunes encontramos Papaya, Papaw o Pawpaw, Papayer (francés), Melonenbaum (alemán), Lechosa (español), Mamao, Mamoeiro (portugués) y Mugua (chino). El género Carica comprende plantas dioicas, exceptuando una que es monoica Carica monoica (Desf.) y algunas Carica pubescens y polígama C. papaya.
Características generales
Es una planta herbácea arborescente, inerme, laticífera, erguida. El sistema radical lo componen unas pocas raíces grandes, poco profundas, provistas de numerosas raicillas absorbentes. El tallo es carnoso, firme más o menos permanente, es único, recto cilíndrico y hueco; presenta cicatrices evidentes de las hojas caídas, entrenudos cortos, y las hojas se agrupan densamente hacia su ápice. Las hojas son grandes, palmadas, simples, alternas, lisas, con peciolos largos y ascendentes, más anchos en su inserción. A medida que la planta crece, las hojas viejas se caen, cediendo lugar a las inflorescencias y frutos (Mederos, 1988).
Es un árbol de rápido crecimiento con períodos juveniles de cinco a seis meses y vida de hasta veinticinco años (Litz 1983), no obstante, su eficiencia productiva como fruta fresca no va más allá de los cinco años. Se alcanzan rendimientos de 50 000 kg de fruta fresca por hectárea en el primer año de producción. Su atractivo además de fruta cosechable está en su alto contenido de enzimas proteolíticas, obtenidas del látex de frutos tiernos (Knight, 1980; Litz, 1983; Muñoz y Oliva, 1985). Por su parte Lima (1991) señaló que el cultivo requiere de una correcta aplicación de medidas fitotécnicas lo que permite una mayor y mejor explotación, aún cuando se continúe sembrando en áreas afectadas por virus.
Cultivo de la Papaya
Zonas adecuadas
Las temperaturas óptimas para el cultivo se encuentran alrededor de 25°C. Se consideran como límites térmicos extremos 20°C y 33°C debido a que las temperaturas inferiores a 21°C y superiores a 33°C favorecen los fenómenos de carpeloidía y esterilidad femenina, respectivamente. Estas condiciones de temperatura limitan por lo tanto las zonas de cultivo de la Papaya. Hay que destacar que las bajas temperaturas y el viento son también factores limitantes para el cultivo, por lo que fuera de las zonas más cálidas, su cultivo es solo aconsejable en invernadero (Rodríguez et al., 1995a).
Suelos apropiados
La papaya se adapta a una muy variada gama de suelos, aunque siempre es preferible que este sea arenoso-limoso, con buena estructura, rico en materia orgánica y principalmente con buen drenaje y aireación. El pH óptimo está comprendido entre 5.5 y 6.5, pero puede cultivarse sin graves problemas hasta pH 8 (Rodríguez et al., 1995a).
Propagación de la papaya
La propagación de plantas consiste en efectuar su multiplicación por métodos tanto sexuales como asexuales. La forma más económica y fácil de propagar la papaya es por semillas. Se obtendrán diferentes resultados, según se empleen semillas procedentes de árboles femeninos fecundados con papayas masculinos o semillas procedentes de árboles femeninos y hermafroditas (Tabla 1) (Ronse y Smets, 1999).
Otra vía de propagación es mediante esquejes obtenidos de las ramificaciones del árbol de forma artificial ya que la papaya no se ramifica hasta cuando tienen tres o cuatros años. Los árboles viejos sufrirán la operación de desmoche o eliminación de la cabeza o cogollo del árbol, lo cual provocará así la producción de ramas o cogollos laterales (Agronegocios, 2005).
Propagación por semillas y esquejes
La forma típica para su propagación, por su eficiencia, ha sido la reproducción sexual (por semillas). La propagación vegetativa por medio de estacas o injertos no brinda los efectos deseados, las primeras son de lento desarrollo y las segundas degeneran y no mantienen las características.
Para obtener semillas de calidad los frutos deben provenir del cruzamiento entre plantas hermafroditas, de esta manera se puede lograr un 66% de plantas hermafroditas y 33% de plantas femeninas, con esta selección existe la certeza de no aparición de plantas masculinas no productivas (Otero, 2003).
El poder germinativo de las semillas de papaya suele ser corto, por lo que la siembra debe efectuarse lo más cerca posible a la época de recolección. Esta puede ser directa sobre el terreno o previa en semillero. Para la siembra en semillero pueden emplearse macetas de turba y plástico negro de 10 cm de diámetro y 15 cm de profundidad. Un aspecto importante es que la tierra del semillero deberá mantenerse húmeda y cuando las plantitas tengan unos 10-15 cm de altura (unos dos meses después de la siembra) pueden ser transplantadas al terreno de cultivo (Agronegocios, 2005).
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Para el uso de esquejes como material vegetal de propagación deben tomarse brotes de 25-30cm que se cortan y luego se cauterizan con agua caliente a unos 50ºC. Estos esquejes se plantan en macetas que se colocan en lugares protegidos de los rayos solares y con humedad hasta la emisión de raíces. Este método de propagación es muy laborioso y costoso ya que implica el mantenimiento de plantaciones de más de tres años para la obtención de plantas madre (Sierra, 2003).
Cultivo de tejidos y micropropagación
Se han desarrollado diferentes métodos de propagación a partir del cultivo de tejidos tanto por organogénesis (Hossain et al., 1993) como por embriogénesis somática (Posada, 1995; Del Sol et al., 2001), sin embargo por ser los métodos biotecnológicos hasta el presente más costosos respecto a la vía por semilla botánica su empleo está limitado solamente para genotipos híbridos que lo justifiquen (Elder y Macleod, 2000).
Con el estudio de los procesos que ocurren en el cultivo de tejidos de la papaya se han desarrollado novedosas técnicas de propagación de plantas que han permitido la multiplicación asexual de materiales vegetales élite; la conservación in vitro de germoplasma; el rescate de embriones híbridos en cruces interespecíficos; la producción de plantas homocigóticas; el saneamiento a enfermedades virales y fungosas; la producción de variantes somaclonales así como la transformación genética (Stiles et al., 1993).
Micropropagación vía organogénesis. Aplicación en la propagación del híbrido IBP 42-99
En la micropropagación de la papaya al igual que en otras especies de plantas existen las cinco fases de la micropropagación tradicional, no obstante la misma tiene sus particularidades, pues se incluye la fase de elongación por las características in vitro de este cultivo, que hacen que sea clave para obtener altos porcentajes de supervivencia en condiciones ex vitro.
Fases 0 y I. Preparativa y Establecimiento
En el caso de la propagación in vitro la obtención de explantes a partir de plantas de campo ha sido y es uno de las etapas críticas de cualquier metodología en papaya. En esta especie uno de los grandes problemas que tiene la fase de establecimiento, cuando se emplean como explantes iniciales ápices o meristemos de plantas adultas cultivadas en campo es el alto porcentaje de contaminación microbiana (bacterias y hongos) (Brar y Khush, 1994; Wilson, 1996). Se han establecido varios protocolos para la propagación in vitro de este cultivo, sin embargo todos emplean como explante inicial yemas tomadas de plantas cultivadas en casas de cultivo (Rajeevan y Pandey, 1986; Drew, 1988; Arrieta et al., 1996).
Las principales dificultades que se presentan para el establecimiento in vitro a partir de plantas de campo en el cultivo de la papaya son:
Obtención de yemas laterales de un adecuado tamaño debido a una fuerte dominancia apical (Reuveni y Shlesinger, 1990).
Descontaminación de yemas laterales de plantas de campo (Arrieta et al., 1996).
Lento coeficiente de multiplicación inicial de las yemas laterales (Fitch et al., 1997).
Para lograr la multiplicación in vitro del híbrido de papaya IBP 42-99, durante la fase de establecimiento de los ápices in vitro se emplearon ápices de plantas adultas, con 11 meses de plantadas en campo. A las mismas se les aplicaron foliarmente dos reguladores del crecimiento (500mg.l-1 de 6 bencilaminopurina (6-BAP) y 1 000mg.l-1 de ácido giberélico (AG3) para estimular el crecimiento y desarrollo de las yemas de la zona apical de los árboles. Para la desinfección de estos explantes se utilizaron diferentes sustancias, solas o en combinación: hipoclorito de sodio en concentraciones (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0%), alcohol al 70% y una mezcla de antibióticos aplicada después del hipoclorito de sodio (Sulfato de Gentamicina 50mg.l-1, Estreptomicina 25mg.l-1 y Cefotaxima 50mg.l-1), además se seleccionaron brotes apicales con dos meses de edad. Se comprobó que el decapitado de la zona apical no era determinante en la inducción de nuevos brotes de papaya cuando se le realizaban aplicaciones de reguladores del crecimiento. Se obtuvieron entre 63 y 68 brotes por planta a las cuatro semanas después de la última aplicación de 6-BAP y AG3. La desinfección se logró al utilizar hipoclorito de sodio al 1% durante 10 minutos y luego sumergiendo los explantes en la solución de antibióticos por 30 minutos. Se alcanzó un porcentaje de establecimiento de los ápices in vitro del 68% en el medio de cultivo líquido con soporte de papel (Posada et al., 2004).
Fase II. Multiplicación
En la fase de multiplicación se han estudiado varios reguladores del crecimiento dentro de ellos, la kinetina, el isopenteniladenina (2iP) y el 6-BAP (Islam et al., 1993) sin embargo, la citoquinina más efectiva en todos los casos ha sido el 6-BAP en combinación con el ácido naftalenacético (ANA) en concentraciones entre 0.5 y 0.1 mg.l-1 para ambos reguladores del crecimiento. Con ello se han alcanzando coeficientes de multiplicación entre 7.50 y 9.87 (Gallardo, 2002). También el tidiazuron (TDZ) ha sido empleado en diferentes concentraciones en los medios de cultivo ( 0.25 - 1 mg.l-1 ).
El uso de frascos de cultivo de vidrio (250ml) para esta fase de la micropropagación ha permitido obtener resultados superiores a los logrados con tubos de ensayo. De igual forma, los medios de cultivo líquidos han sido utilizados en esta fase y se han obtenido brotes sanos, de color verde intenso y más elongados que los que estaban en medio de cultivo semisólido (Banerjee, 2002).
En esta fase juega un papel fundamental la concentración de etileno dentro del frasco según informan Lai et al. (2000). Estos autores alcanzaron un máximo de 19 nuevos brotes por frasco de cultivo y señalaron que existió correlación entre la concentración de etileno y la proliferación de los brotes durante 3 semanas de cultivo. Ellos lograron cambios positivos en la multiplicación de los brotes de papaya al aplicar inhibidores de la biosíntesis del etileno tales como amino-etoxivinilglicina (AVG) y CoCl2. La adición al medio de cultivo de CoCl2 tiene un efecto persistente sobre las yemas múltiples de papaya que otros tratamientos con ácido 1-aminociclopropano-1-carboxil (ACC). El efecto promovido en la biosíntesis del etileno por las bajas concentraciones de CoCl2 puede ser debido al rol de este micronutriente (Co2+) en el medio de cultivo.
La multiplicación in vitro de los ápices ya establecidos del híbrido IBP 42-99, se realizó en el medio de cultivo compuesto por sales MS (Murashige y Skoog, 1962) y reguladores de crecimiento, al colocar cinco explantes en cada frasco de cultivo con capacidad de 250 ml que contenían 30ml de medio de cultivo cada uno. Los frascos de cultivo fueron colocados en cámaras de crecimiento con luz solar con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) 50-62.5 μmol m-2 s-1 y temperatura de 25 ± 2ºC. El subcultivo se realizó a los 24 días de cultivo. Transcurrido este tiempo se individualizó cada brote obtenido para ser subcultivado nuevamente en un medio de cultivo fresco, además se eliminaron los restos del gelificante y el callo que pudo formarse en determinados casos. El suplemento de la riboflavina en los medios de cultivo en concentraciones entre 1.1 y 1.3 mg. l-1 evita la formación de callos en la base de las plantas in vitro (Gallardo et al., 2004a).
A las 3 semanas de cultivo se obtienen plántulas con una altura entre 2-4 cm y más de 4 hojas trilobadas.
Varios autores informan sobre problemas con la presencia de bacterias endógenas en el cultivo in m vitro de la papaya. Pinzón (2003) hace referencia al empleo de medios de cultivo sin sacarosa en diferentes variedades de papaya, para ayudar a reducir las pérdidas por bacterias y refieren buenos resultados. También Fitch et al. (2005) señalaron el desarrollo de medios de cultivo fotoautotróficos con este fin, con la eliminación de la sacarosa del medio de cultivo, previo a una descontaminación de los explantes con carbenicilina 500 mg.l-1 y cefotaxima 200 mg.l-1 en el medio de cultivo de multiplicación durante un mes.
Fase III. Elongación
El desarrollo de una fase de elongación ha sido importante en el micropropagación de la papaya previa a la fase de enraizamiento.
Luego de realizados varios subcultivos en el medio de cultivo de multiplicación será necesario transferir los brotes a un medio de cultivo de elongación ya que la altura óptima de los mismos para ser enraizados debe ser superior a 3.0cm.
Esta elongación en las plantas in vitro ha sido alcanzada con el suplemento al medio de cultivo de ácido giberélico (AG3) en concentraciones entre 1- 5.0 mg.l-1 durante 15 días de cultivo (Banerjee, 2002). Las plantas han llegado a alcanzar una altura entre los 3.0 a 3.8 cm, con un 92 % de brotes elongados. Los frascos de cultivo se colocan igualmente en cámaras de crecimiento con luz solar con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) 50-62.5 μmol m-2 s-1. y temperatura de 25± 2ºC durante 24 días.
Fase IV. Enraizamiento
El enraizamiento en la micropropagación de la papaya puede ser logrado en condiciones in vitro y ex vitro. Para el enraizamiento in vitro las plantas bien formadas con 3 a 4 hojas y una altura superior a los 3-4 cm provenientes del medio de cultivo de elongación se subcultivan a un medio de cultivo de enraizamiento, compuesto por el 50% de las sales MS (Murashige y Skoog, 1962) y concentraciones entre 3 y 5 mg.l-1 de ácido indol butírico (AIB). En este medio de cultivo deben permanecer durante 10 días para inducir la formación de raíces, luego se transfieren a un medio de cultivo compuesto por sales MS sin reguladores de crecimiento por espacio de 20 días más. Al final de este período el 80% de las plántulas formarán raíces con pelos absorbentes y estarán listas para ser trasladadas a condiciones ambientales de aclimatización.
Gallardo et al. (2004b) obtuvieron resultados satisfactorios en el enraizamiento del híbrido IBP 42-99 al emplear frascos de cultivo con 30ml de medio de cultivo y colocar cinco plantas por frasco así como condiciones de cultivo de luz solar (48-62.5 mol.m-2 s-1) y una temperatura de 27±2 ºC en las cámaras de crecimiento.
Otra variante que también puede ser empleada es el enraizamiento ex vitro. Para esto una vez obtenidas las plántulas con tres o más hojas y 4 cm de altura (provenientes del medio de cultivo de elongación), deben lavarse en su base con abundante agua corriente para eliminar restos de medio de cultivo y posteriormente colocarse durante 24 horas en bandejas con una solución enraizadora, la cual puede estar compuesta por ácido indol-acético (AIA) 10 mg.l-1 y AIB 8.0 mg.l-1 previo a la aclimatización.
Fase V. Aclimatización
La fase de aclimatización de las plantas in vitro es una de las etapas críticas de cualquier protocolo de propagación en este cultivo. Una humedad relativa entre el 95 al 100 % es necesaria durante los primeros 15 días. La supervivencia puede alcanzar valores entre 65-85 % en estas condiciones durante los primeros 7 días de cultivo.
Lo fundamental en esta fase es que las plantas formen un buen sistema radical, debido a que su nutrición dependerá durante mucho tiempo y en gran parte de la efectividad de sus raíces. En la papaya resulta fundamental y merece una mayor atención mantener una alta humedad relativa (cámara húmeda) para lograr mayor éxito en la adaptación a las condiciones ambientales.
Gallardo et al. (2002) para conseguir este propósito cubrieron individualmente las plantas con frascos de vidrio (250ml) durante cuatro semanas. Con ello garantizaron que durante los períodos de riego solo se humedeciera el sustrato y se mantuviera la humedad con lo cual aumentaron los porcentajes de plantas aclimatizadas hasta un 71%. Las plántulas colocadas en los contenedores de polieturano de 70 alveolos de 120 cm3 de capacidad llegan a alcanzar a los 60 días una altura de 10-15 cm y emiten de 7-12 hojas y las raíces con una longitud entre 6-10 cm con lo cual están listas para el transplante a condiciones de campo. El riego una vez al día con nebulizadores es suficiente.
Durante la fase de aclimatización deben emplearse como sustrato productos que presenten como características fundamentales:
Una adecuada condición física que permita el intercambio de aire.
Contenido de materia orgánica inerte (70 %).
Contenido de zeolita (30%).
Buena capacidad para retención de agua.
Estar libre de agentes dañinos como pueden ser nemátodos, bacterias y hongos patógenos.
Libre de semillas de plantas de otras especies.
Las plantas responden muy bien a la aplicación semanal de urea (10g.l-1) de forma foliar, toman una consistencia vigorosa y desarrollan hojas de color verde intenso.
La propagación in vitro del híbrido (IBP 42-99) resultante de los trabajos de cruzamientos en el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad Central Martha Abreu de Las Villas, demuestra el potencial del cultivo de tejidos para la propagación masiva de genotipos élite donde otras formas de reproducción y multiplicación serían desventajosas para mantener las potencialidades genéticas del cultivo.
Cultivo en campo de plantas de papaya obtenidas por organogénesis
Fitch (2005) refiere que las plantas de papaya obtenidas por micropropagación tuvieron frutos de tamaño comercializable de 1 a 3 meses más temprano que las plantas obtenidas por semillas. Además, presentaron una menor altura que las obtenidas por semillas lo cual facilita su cosecha y las hace menos vulnerables a los fuertes vientos.
La preparación del suelo, la plantación y las técnicas culturales deben ser realizadas de acuerdo con las prácticas tradicionales para el cultivo. Después de 9 meses las plantas de papaya comienzan a florecer y formar frutos normales (Van Minh y Tuong, 2001). Al respecto Chan y Teo (2002) señalan que las evaluaciones en campo de plantas de seis variedades de papaya mostraron un rendimiento uniforme y una alta calidad de los frutos similares a sus plantas madre. Solo encontraron pequeñas variaciones en la altura de las plantas, el número, peso y forma de los frutos, así como el contenido de azúcar.
Embriogénesis somática
La embriogénesis somática ofrece mayores posibilidades de obtener volúmenes de producción superiores en un menor período de tiempo, lo cual la convierte en un método más eficiente que la regeneración vía organogénesis (Villalobos y Torpe, 1991). Como sistema de propagación de plantas presenta una serie de ventajas entre las que se encuentran una enorme capacidad de multiplicación aplicable industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras completas con ápice y raíz, que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente. Todos estos conocimientos tienen su aplicación en la propagación y mejora genética de plantas, en el saneamiento de patógenos, en el intercambio y conservación de germoplasma y en ingeniería genética.
En el cultivo de la papaya la embriogénesis somática de forma directa es la más utilizada tanto para la micropropagación, como para el mejoramiento genético con el uso de técnicas de transformación genética (Cabrera-Ponce et al., 1995; Posada, 1995; Mahon et al., 1996; Castillo et al., 1998; Cai et al., 1999; Del Sol et al., 2001; Banerjee, 2002).
El explante más utilizado en este cultivo, independiente de la variedad, para lograr la embriogénesis somática, es el embrión cigótico (Cabrera-Ponce et al., 1995; Posada, 1995; Mahon et al., 1996; Cai et al., 1999; Del Sol et al., 2001). No obstante, también se han utilizado otros tipos de explantes como: discos de hojas (Cabrera Ponce et al., 1996; Arrieta-Espinoza, 1996), segmentos de hipocotilo (Castillo et al., 1998; Zhu et al., 2004), raíces (Yu et al., 2001), así como ápices y segmentos de plantas in vitro (Gallardo et al., 2004a).
En el género Carica muchos de los autores realizan todo el proceso de embriogénesis somática en ausencia de iluminación (Posada, 1995; Mahon et al., 1996; Cai et al., 1999; Del Sol et al., 2001; Banerjee, 2002) sin embargo, otros desarrollan la fase de formación de callos en presencia de luz (Hossain, et al., 1993; Jordan y Velozo, 1996).
Varias metodologías de regeneración de plantas por esta vía en el cultivo de la papaya han sido establecidas, su fin fundamental ha estado dirigido al mejoramiento genético (Posada, 1995). Sin embargo, este proceso de morfogénesis in vitro también puede ser utilizado para la producción de semillas de plantas élites o hermafroditas en este cultivo.
En el Instituto de Biotecnología de las Plantas se han desarrollado dos metodologías las cuales representan un gran potencial para la micropropagación y el mejoramiento genético. Una se basa en el uso como explante inicial de embriones cigóticos inmaduros y la otra con el empleo de plantas in vitro de papaya, específicamente del híbrido IBP 42-99. A continuación se describen brevemente las principales características de cada una.
Embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos inmaduros (Posada, 1995)
Como material vegetal inicial deben emplearse frutos inmaduros (obtenidos de flores hermafroditas elongatas) entre 90-120 días después de la antesis de plantas de campo.
En el laboratorio primeramente son lavados con una solución de detergente comercial y luego se colocan 30 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 1% con dos o tres gotas de Tween 80 por litro de solución. Posteriormente se lavan dos veces con agua destilada estéril, se secan en la cabina de flujo laminar y se procede a abrirlos con
ayuda de una cuchilla, se extraen las semillas y se cortan con el auxilio de bisturí No. 11 y pinzas curvas para obtener los embriones cigóticos inmaduros.
Obtención y multiplicación de los embriones somáticos
Para la obtención de los embriones somáticos inmaduros se colocan cinco embriones cigóticos por frasco de cultivo de 250 ml de capacidad, a los cuales previamente se les adicionan 30 ml de medio de cultivo semisólido. Alrededor de los 12-15 días los embriones cigóticos comienzan a abrir las hojas cotiledonales y de la zona apical se forman los embriones somáticos, los cuales se encuentran en etapa globular, presentan una coloración amarillo claro y alcanzan un número de 50-100 por explante a las 6 semanas de cultivo. Esta es una embriogénesis somática directa de alta frecuencia. Las condiciones de cultivo son oscuridad y temperatura de 27±2 oC.
El medio de cultivo debe estar compuesto por las sales MS al 50% y 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en concentraciones entre 5 10 mg.l-1.
Si se pretende continuar con la multiplicación secundaria de los embriones somáticos, estos son separados en pequeños grupos de entre 5 y12 (masa fresca de aproximadamente 50 mg (MF)) que se colocan en el medio de cultivo a razón de cinco grupos por frasco (250ml) y posteriormente en oscuridad y temperatura de 27±2 oC. Este proceso de multiplicación puede ser realizado durante 5 - 6 subcultivos (5 semanas cada uno). Se obtiene una embriogénesis secundaria de los embriones somáticos y se llegan a formar grupos de 200-250 embriones somáticos en etapa globular (100%) con un coeficiente de multiplicación de 12.5 a las 5 semanas de cultivo.
El medio de cultivo utilizado debe contener la mitad de las sales MS y 2 mg.l-1 de 2,4-D.
Según Parrot (2002) cuando las concentraciones de auxina exógena se elevan a un determinado nivel, los embriones somáticos no pasan de la etapa globular, se detiene su desarrollo y forman embriones nuevos a partir de estos. Los resultados descritos permiten afirmar que dicho fenómeno puede ser utilizado en el cultivo in vitro de la papaya para la multiplicación secundaria de los embriones.
Germinación de los embriones somáticos
Diferentes autores utilizan para la germinación de embriones somáticos de papaya dos y hasta tres subcultivos en un medio de cultivo de germinación (Cruz et al., 1990; Posada, 1995) para completar y lograr el desarrollo de las plantas.
Los embriones somáticos provenientes del medio de cultivo de multiplicación son separados, también en pequeños grupos antes de colocarlos en el medio de cultivo. Las condiciones de cultivo son cámaras de luz solar con un flujo de fotones de 48-62.5 mol.m-2 s-1 y una temperatura de 27±2 oC. A los embriones somáticos que ya alcanzaron las etapas de torpedo y cotiledonal se les realizan dos subcultivos en medio de cultivo con 6-BAP en concentraciones entre 0.2- 0.5 mg.l-1.
Las plantas in vitro se desarrollan completamente y forman varias hojas verdaderas. Debido a que en esta especie la germinación de los embriones somáticos ocurre de forma parcial (Posada, 1995), se hace necesario utilizar un medio de cultivo para elongar las plantas in vitro y posteriormente que las mismas enraícen.
Elongación de las plantas obtenidas a partir de embriones
Las plantas in vitro bien formadas obtenidas a partir de la germinación de los embriones somáticos, se colocan en medio de cultivo de elongación, el cual contiene las sales MS suplementadas con 0.25 mg.l-1 de ANA y 0.25 mg.l-1 de 6-BAP. Posterior a las cuatro semanas de cultivo y con una altura promedio superior a los 3 cm, las plantas in vitro se colocan en un medio de cultivo MS suplementado con 5 mg.l-1 de AIB para inducir el enraizamiento, donde permanecen por espacio de 10 días y luego se colocan en medio de cultivo MS libre de reguladores de crecimiento para que emitan las raíces.
Enraizamiento de las plantas obtenidas a partir de embriones
Los explantes provenientes del medio de cultivo de elongación se transferieren a un medio de cultivo de enraizamiento, compuesto por el 50% de las sales MS (Murashige y Skoog, 1962) y suplementadas con 5 mg.l-1 de AIB. En este medio de cultivo permanecerán durante 10 días para inducir la formación de raíces, pues a partir de este tiempo ocurre una caída casi total de las hojas. Luego pasarán a un medio de cultivo compuesto por sales MS sin reguladores de crecimiento por espacio de 20 días. A las 4 semanas, más del 80% de las plantas in vitro formarán raíces con pelos absorbentes, listas para ser trasladadas a condiciones ambientales de aclimatización.
Durante esta fase es necesario eliminar el callo basal formado durante las fases anteriores para lograr el enraizamiento de las plantas in vitro.
Las condiciones de cultivo para esta fase son luz solar con un flujo de fotones de 48-62.5 mol.m-2s-1 en las cámaras de crecimiento y una temperatura de 27±2 oC.
Otra variante que también puede ser empleada es el enraizamiento ex vitro. Para ello debe seguirse un procedimiento similar al descrito para las plantas obtenidas por organogénesis.
Embriogénesis somática a partir de plantas in vitro (Gallardo et al., 2004a y b)
Otro método para el desarrollo de la embriogénesis somática puede ser el uso de plantas in vitro como explantes iniciales para inducir la formación de callos.
Formación de callos
Para lograr la formación de callos a partir secciones de tallo de plantas in vitro del híbrido de papaya, se debe emplear el segmento 1 (ápice de 5.0 mm de longitud al que se le elimina el meristemo) en el medio de cultivo Nitsch y Nitsch (1969) suplementado con 1.5 mg.l-1 de AIA y 1.5 mg.l-1 de 6-BAP. Se logra obtener callos compactos, secos y grumosos. La mayoría de los investigadores tanto en papaya como en otras especies no emplean AIA para formar callos u obtener embriones somáticos, las auxinas más utilizadas son 2,4-D y ANA. Sin embargo, sobre la base de los resultados obtenidos se pudo concluir, que con el empleo del AIA combinado con 6-BAP se obtienen callos con mejores características en cuanto a consistencia y aspectos morfológicos en el híbrido IBP 42-99.
Según Parrot (1993) el tipo, estado fisiológico y los niveles de diferenciación y polarización de los tejidos utilizados como explantes iniciales son algunos de los factores que favorecen o interfieren la formación de callos. Hossain et al. (1993) obtuvieron callos a partir de peciolos de hojas de papaya al combinar 6-BAP con ANA y lograron regenerar plantas de los mismos. Estos autores señalaron la formación de los callos a partir de los extremos del explante donde se le había realizado el corte.
Formación de embriones somáticos
Se logra obtener una embriogénesis somática de alta frecuencia a partir de los callos obtenidos de secciones de tallo, al emplear el medio de cultivo compuesto por la mitad de las sales MS suplementadas con 5.0 mg.l-1 de 2,4-D.
Al igual que al utilizar como explante inicial embriones cigóticos inmaduros al emplear el 2,4-D en concentraciones entre 5 15 mg.l-1 se desarrolla la embriogénesis somática. Primeramente los callos toman una coloración parda más oscura y a las 6 semanas se observa la presencia de los embriones somáticos.
Otros autores emplean 2,4-D para obtener embriones somáticos en papaya variedad INIVIT 2000 a partir de embriones cigóticos y obtienen los mejores resultados con concentraciones de 4.7 mg.l-1 (Del Sol et al., 2001).
Por su parte Banerjee (2002) para obtener embriones somáticos de papaya emplea concentraciones de 2,4-D desde 2 hasta 25 mg.l-1 e informa que a partir de 15 mg.l-1 existe una disminución significativa en cuanto al número de embriones y al porcentaje de explantes con embriones.
Multiplicación secundaria de los embriones somáticos
Se alcanza el mayor número de embriones somáticos en etapa globular durante la embriogénesis secundaria o repetitiva al emplear como medio de cultivo la mitad de las sales MS suplementadas con 5 mg.l-1 de 2,4-D.
La utilización del 2,4-D en el medio de cultivo en diferentes concentraciones, permitió el desarrollo de la embriogénesis secundaria o repetitiva en los embriones somáticos del híbrido de papaya IBP 42-99. Con el uso de 5 y 8 mg.l-1 de 2,4-D se logran los mayores porcentajes de embriones somáticos en etapa globular, 98 y 100 % respectivamente, sin diferencias significativas entre ellos, pero significativamente superiores a cuando se utilizan 2 mg.l-1. Con el empleo de 2 mg.l-1 existe un mayor porcentaje de diferenciación de los embriones somáticos y se observan embriones con tendencia a germinar pues toman una coloración verde en su extremo superior, esto se debe a un rápido agotamiento del regulador de crecimiento en el medio de cultivo durante este período, al estar la auxina en más baja concentración. Según Parrot (2002) los tejidos embriogénicos son capaces de formar embriones globulares aún cuando los niveles de auxina exógena disminuyen hasta cierto umbral, pero en ausencia de esta la histodiferenciación ocurre normalmente.
La embriogénesis somática o repetitiva es de mucha importancia en los programas de mejoramiento genético de especies vegetales y en especial el desarrollo de embriones somáticos en etapa globular, pues es la etapa del proceso de histodiferenciación de los embriones somáticos adecuada para la transformación genética por biobalística en el caso de la papaya (Más et al., 2002).
Germinación de los embriones somáticos
Se logra el 100% de germinación de los embriones somáticos de plantas in vitro al emplear 0.15 mg.l-1 de 6-BAP. Se observa un alargamiento del tallo (eje hipocotilo) y el desarrollo del primer par de hojas verdaderas muy pequeñas, esto está dado por los niveles endógenos de auxina, que al emplear baja concentración de la citoquinina la relación auxina/ citoquinina se favorece para la primera y esto provoca el alargamiento celular. Según Vázquez y Torres (1995) cuando el balance auxina/citoquinina está por encima de uno favorece el alargamiento y la división celular.
Para completar y lograr el desarrollo de plantas bien formadas se les realiza a los explantes un segundo subcultivo en el mismo medio de cultivo. De forma general se observa un aumento en los porcentajes de germinación, además de un mayor desarrollo de las plantas in vitro ya formadas. Durante este período se evidencia un mayor desarrollo de las estructuras formadas y se elongan ligeramente las plantas in vitro las cuales ya han formado pequeñas hojas, pero sin mucho desarrollo del tallo.
Debido a que en esta especie la germinación de los embriones somáticos ocurre de forma parcial (Posada, 1995), es necesario utilizar un medio de cultivo para elongar las plantas in vitro y posteriormente que las mismas enraizaran, al igual que las obtenidas a partir de embriones cigóticos inmaduros.
Elongación y enraizamiento de las plantas obtenidas a partir de embriones
Las plantas in vitro bien formadas obtenidas a partir de la germinación de los embriones somáticos, al ser colocadas en medio de cultivo de elongación presentan una consistencia robusta y como promedio cuatro pares de hojas. Por otra parte existe un desarrollo de las yemas laterales, lo que debe estar dado por la pérdida de la dominancia apical, por ambos subcultivos en medio de cultivo de germinación con citoquininas. Se logra el enraizamiento de las plantas in vitro, al ser colocadas en el medio de cultivo de enraizamiento propuesto por Posada (1995). Las raíces presentan una coloración blanca y alcanzan una longitud de 5cm como promedio, además, presentan una amplia ramificación de raíces secundarias. Debido a las características de esta fase donde se colocan los explantes 10 días en medio de cultivo con auxina (AIB) y luego se subcultivan a medio de cultivo sin regulador de crecimiento por un período de 30 días, le permite a las plantas in vitro que alcancen un mayor tamaño.
Al igual que para las plantas obtenidas por organogénesis o por embriogénesis a partir de embriones cigóticos, el enraizamiento puede realizarse ex vitro. Para ello debe seguirse un procedimiento similar al descrito para las plantas obtenidas por organogénesis.
La embriogénesis somática como sistema de propagación de plantas presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas: una enorme capacidad de multiplicación aplicable industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras completas con ápice y raíz, que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente.
Todos estos conocimientos tienen su aplicación en propagación y mejora de plantas, en saneamiento de patógenos, intercambio y conservación de germoplasma y en ingeniería genética y selección de especímenes transformados.
CONSERVACIÓN IN VITRO
Con el desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro ha sido posible establecer métodos de micropropagación para muchas especies vegetales. Estas colecciones activas constituyen una nueva categoría, pero el material vegetal en crecimiento continuo no puede ser almacenado a largo plazo, ya que presenta los problemas prácticos de la manipulación (subcultivos periódicos a medio de cultivo fresco) y la inestabilidad genética por el cultivo de tejidos prolongado (Withers, 1987).
Para evitar estos riesgos se han implementado dos estrategias de conservación in vitro; la primera contempla, la limitación del crecimiento (crecimiento mínimo) y con ello se garantiza la conservación a corto y mediano plazo. La segunda, consiste en la paralización total del crecimiento y sólo es factible aplicando las técnicas de crioconservación o almacenamiento a ultra baja temperatura (-196 ºC) en nitrógeno líquido. Esto permite conservar germoplasma por tiempo indefinido, en un espacio reducido, con bajos costos de mantenimiento y sin inestabilidad genética (Hirai y Sakai, 2003). Este método ha sido aplicado en muchas especies para la conservación de polen, ápices, embriones cigóticos y somáticos, suspensiones celulares (Huarte y Rigato, 2001).
La conservación in vitro es un auxiliar valioso de la conservación en bancos de semilla y de campo, ya que permite tener duplicados seguros en espacios reducidos y conservar especies de que mantenerse en semillas o en el campo se podrían perder. Ofrece además, la posibilidad de utilizar un amplio número y variedad de muestras, y facilita el acceso a ellas para su evaluación e intercambio. Sus condiciones asépticas garantizan mayor sanidad de las muestras y en consecuencia incrementan el intercambio de materiales vegetales sanos.
El principal objetivo de los bancos in vitro es conservar las plantas con semillas recalcitrantes o cultivos de propagación vegetativa o clonal, otros que son altamente heterocigóticos y requieren ser propagados vegetativamente para conservar su integridad genética. También se incluyen raíces y tubérculos con vida corta en el almacenamiento, como la papa, la batata y la yuca (Frankel, 1995).
Suksa et al. (1997), lograron altos porcentajes de supervivencia en ápices de papaya in vitro, después de 12 meses de conservación, a 16 ºC de temperatura y comprobaron que la adición de ABA 5mM influyó satisfactoriamente en la disminución del crecimiento de los ápices. Además, informaron una severa suculencia de los ápices de papaya conservados en medio de cultivo que contenía manitol. Por otra parte, comprobaron que la adición de altas concentraciones de sacarosa no mejoró la resistencia al frío de los ápices.
Ashmore et al. (2000) desarrollaron técnicas y procedimientos para la conservación in vitro y crioconservación de brotes axilares y yemas apicales de plantas in vitro de papaya; este último a través de un simple protocolo de vitrificación.
En el empleo de técnicas de crioconservación de recursos fitogenéticos en papaya; Buerhing (2003), desarrolló un protocolo de crioconservación para el suministro continuo de cultivos embriogénicos de líneas de papaya para transformación.
Por su parte Wang et al. (2005) emplearon ápices de 4 a 6 semanas de edad de plantas cultivadas in vitro de seis variedades de papaya para ser crioconservados por vitrificación. Los ápices fueron tratados en un criotubo de 2 ml de capacidad con una solución de 2M glicerol y 0.4 M de sacarosa a 25 °C por 20 min, luego deshidratados con 1 ml de solución vitrificación pre-enfriada a 4 °C por 60 min.
La conservación del híbrido de papaya IBP 42-99 es muy importante para los programas de mejora genética y la propagación in vitro del mismo. Al aplicar el método de crecimiento mínimo (sales MS 100% y una concentración de 10 g.l-1 de manitol) se logró que plantas in vitro del híbrido de papaya IBP 42-99 fueran conservadas durante 170 días. Además, fue posible la crioconservación de brotes apicales de plantas in vitro con el empleo de la solución de vitrificación PVS2 con un tiempo de inmersión de 40 minutos a 0°C, el precultivo de las plantas donantes por 14 días en 50 g.l-1 de sacarosa y una longitud de los explantes de 2.0 mm incluyendo la presencia de 2-3 primordios foliares. La recuperación se logró con la incorporación de los ápices a la multiplicación in vitro y el número de brotes por ápice crioconservado se alcanzó a los 90 días de restablecidas las condiciones de cultivo.
El uso de la biotecnología vegetal constituye una herramienta para la propagación y conservación in vitro de la papaya así como para el mejoramiento genético. Cada una de estas ramas se interrelacionan. Para obtener plantas transgénicas en cualquier especie vegetal es necesario contar con metodologías eficientes de transformación y regeneración de plantas por cultivo de tejidos. Los resultados incluidos en este trabajo demuestran que en la especie Carica papaya los protocolos de regeneración de plantas por embriogénesis somática y organogénesis desarrollados pueden ser empleados para este fin.
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