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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 5, No. 2: 95 - 101, abril - junio, 2005
Diferenciación y germinación de embriones somáticos de Coffea arabica L. cv. Catimor 9722 obtenidos en agitador orbital
Manuel de Feria Silva*, Elio Jiménez González, Raúl Barbón Rodríguez, Alina Capote Pérez, Maité Chávez Milián y Elisa Quiala Mendoza. *Autor para la correspondencia
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e-mail: mdeferia@ibp.co.cu, mdeferia@yahoo.es
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivos estudiar el efecto de cuatro densidades de inoculación sobre el proceso de diferenciación de suspensiones celulares embriogénicas de Coffea arabica cv. Catimor 9722 y evaluar el efecto de dos medios de cultivo descritos en la literatura científica para la germinación de embriones somáticos. Los resultados mostraron que sólo se formaron embriones somáticos en los tratamientos inoculados con 0.5 y 1.0 gMF.l-1, mientras que en los tratamientos inoculados con 5.0 y 10.0 gMF.l-1 se multiplicaron sólo los agregados celulares. El mayor número de embriones somáticos (23 154 ES.l-1) se obtuvo al inocular 1.0 gMF.l-1, con diferencias estadísticas respecto al tratamiento inoculado con 0.5 gMF.l-1, en el cual se obtuvieron 12 507 ES.l-1. Respecto a la germinación de los embriones somáticos en etapa de torpedo, los mejores resultados se lograron al emplear 0.225 mg.l-1 de 6-BAP, pues después de ocho semanas de cultivo germinaron como promedio 2.87 embriones somáticos de cada cinco colocados inicialmente en los frascos de cultivo, lo que representó un 57.5% de germinación.
Palabras clave: cafeto, densidad de inoculación, medio de cultivo líquido
ABSTRACT
The present work had as objectives to study the effect of four inoculation densities on the process of differentiation of embryogenic cell suspensions of Coffea arabica cv. Catimor 9722 and to evaluate the effect of two culture media described in the literature for the germination of somatic embryos. The results showed that somatic embryos were only formed in the treatments inoculated with 0.5 and 1.0 g FW l-1, while in the treatments inoculated with 5.0 and 10.0 g FW l-1 only the cell aggregates were multiplied. The largest number of somatic embryos (23 154 SE.l-1) was obtained when inoculating 1.0 g FW l-1, with statistical differences regarding the treatment inoculated with 0.5 g FW l-1, in which 12 507 SE.l-1 were obtained. Regarding the germination of the somatic embryos in torpedo phase, the best results were possible when using 0.225 mg.l-1 de 6-BAP, because after eight weeks of culture they germinated with an average of 2.87 somatic embryos out of five placed initially in the culture flasks, what represented 57.5% of germination.
Key words: coffee, inoculation density, liquid culture medium
INTRODUCCIÓN
El principal inconveniente para la propagación del cultivo del cafeto por métodos tradicionales, es el hecho de ser este un cultivo perenne, lo que implicaría muchos años de trabajo para multiplicar un material genético con interés para la agricultura (Berthouly, 1997).
En este contexto es muy importante disponer de técnicas para la multiplicación in vitro del cafeto, pero en particular, de protocolos para la regeneración de plantas vía embriogénesis somática, pues permitirán obtener volúmenes de producción superiores en un menor período de tiempo y a un costo más bajo, lo cual convierte a este sistema en una vía de regeneración de plantas potencialmente más eficiente que la regeneración vía organogénesis (Villalobos y Thorpe, 1991).
Según Vasil (1994), los estudios relacionados con la embriogénesis somática se iniciaron a principios de 1960. Autores como Merkle et al. (1995), reconocieron que la habilidad manifestada por los cultivos embriogénicos para proliferar o multiplicarse indefinidamente, era uno de los aspectos más importantes que permitiría aplicar la embriogénesis somática en la propagación masiva de plantas y el mejoramiento genético por transferencia de genes.
Los primeros embriones somáticos de cafeto fueron obtenidos a principios de 1970 por Staritsky, al emplear secciones de hojas de ramas ortotrópicas jóvenes de C. canephora (Dublin, 1991). En los últimos años, se ha incrementado la regeneración de plantas por esta vía y en particular el cultivo de células en suspensión (Montes et al., 1995; Zamarripa, 1996; Etienne et al., 1997; González et al., 1999; Cevallos, 2000; de Feria et al., 2001; de Feria et al., 2003).
Entre los factores más importantes para incrementar la producción de embriones somáticos en etapa de torpedo y garantizar elevados porcentajes de germinación, se encuentra la densidad de inoculación, la cual dependerá del cultivo que se trabaje, ya que en algunas especies cuando se utilizan elevadas densidades se limita el proceso de diferenciación, pero en otras se favorece la formación y multiplicación de un gran número de embriones somáticos, aunque sólo en etapa globular (Shigeta et al., 1996; Barbón, 1997).
El presente trabajo tuvo como objetivos, evaluar el efecto de cuatro densidades de inoculación durante la fase de diferenciación de suspensiones celulares embriogénicas de cafeto y evaluar la germinación de embriones somáticos en etapa de torpedo, en dos medios de cultivo para esta finalidad descritos en la literatura científica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diferenciación de suspensiones celulares embriogénicas en agitador orbital
Efecto de la densidad de inoculación
Este experimento tuvo como objetivo determinar la influencia de cuatro densidades de inoculación sobre la formación y diferenciación de embriones somáticos. Se estudiaron 0.5,1.0,5.0 y 10.0 gMF.l-1 y se empleó el medio de cultivo propuesto por Zamarripa et al. (1991) compuesto por el 100% de las sales inorgánicas MS (Murashige y Skoog, 1962), 1.0 mg.l-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.l-1 de piridoxina, 1.0 mg.l-1 de tiamina,0.01 mg.l-1de biotina,1.0 mg.l-1 de pantotenato de calcio, 5.0 mg.l-1 de 6-bencilaminopurina,100 mg.l-1de mio-inositol,40 mg.l-1 de adenina , 400 mg.l-1 de extracto de malta , 30 g.l-1 de sacarosa y pH 5.8.
Se utilizó como inóculo una suspensión celular en fase de multiplicación en su etapa exponencial (nueve días de cultivo) según la metodología descrita por de Feria et al. (2001). Se emplearon cinco Erlenmeyers de 300 ml de capacidad con 100 ml de medio de cultivo por frasco, a los cuales se les renovó el 55.0% del medio de cultivo con una frecuencia de siete días según la metodología descrita por Zamarripa et al. (1991).
Se determinó el tiempo de cultivo (días) en que se formaron los embriones somáticos en el medio de cultivo y se evaluó el número de embriones somáticos producidos por litro de medio de cultivo (ES.l-1), los cuales se clasificaron de forma visual en globular, corazón y torpedo en función de la etapa en que se encontraban dentro del proceso de diferenciación.
La presencia en el medio de cultivo de los embriones somáticos en etapa globular se determinó de forma visual y la evaluación del número y clasificación de los ES.l-1 se realizó al finalizar el experimento (56 días), Se determinó la masa fresca de toda la biomasa en los frascos de cultivo y luego se tomaron tres muestras de 1.0 g de masa fresca por cada uno, para un total de 15 evaluaciones por tratamiento. Cada muestra se colocó en una placa de Petri de 70 mm de diámetro y se añadieron 2.0 g.l-1 de Phytagel para facilitar el conteo y clasificación de los embriones somáticos, lo cual se realizó mediante el uso de un microscopio estereoscópico modelo WILD M8 (Leica).
El procesamiento estadístico se realizó mediante el paquete SPSS para Windows versión 8.0, los resultados del procesamiento de los datos se obtuvieron directamente al aplicar el test de Mann-Whitney, después de haber generado hasta 10 000 muestras con distribución similar a la real mediante técnicas de Monte Carlo, para estimar de esta forma la significación con el 99.0% de confianza.
Germinación de los embriones somáticos
La germinación de los embriones somáticos constituye un paso importante para validar cualquier proceso embriogénico. Con este objetivo se evaluaron embriones somáticos clasificados de forma visual en etapa de torpedo y que se obtuvieron como resultado del experimento anterior, los cuales fueron colocados en dos variantes de medios de cultivo descritos en la literatura para la germinación de embriones somáticos de cafeto, el primero (1) propuesto por De García y Menéndez (1987) y el segundo (2) por Zamarripa et al. (1990) (Tabla 1).
Los frascos de cultivo se colocaron en cámaras de crecimiento con incidencia de luz solar a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (DFFF) que osciló entre 100 y 125 µE.m-2.s-1 y una temperatura de 28.0 ± 2.0°C. Cada tratamiento estuvo compuesto por 40 réplicas (frascos de cultivo de 250 ml de volumen) y se colocaron cinco embriones somáticos por frasco, para evaluar después de ocho semanas de cultivo la supervivencia y el número de embriones somáticos que germinaron.
Según Merkle et al. (1995), en la mayoría de los trabajos realizados hasta esa fecha, los diferentes autores no hacen una clara distinción entre los términos germinación y conversión. Es importante definir que la germinación se refiere al crecimiento del brote y la raíz de los embriones somáticos en condiciones in vitro y puede ser considerada germinación total si el crecimiento del brote y la raíz se produce simultáneamente o parcial si el embrión somático sólo emite brote o raíz (Söndahl et al., 1991), mientras que la conversión fue un término descrito por Stuart y Strickland (1984), referido a la supervivencia y desarrollo de las plantas producidas in vitro a partir de embriones somáticos, pero en condiciones ambientales, o sea ex vitro.
Para procesar estadísticamente los resultados de la germinación, se aplicó el mismo procedimiento que se siguió con los resultados del experimento anterior.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diferenciación de las suspensiones celulares embriogénicas en agitador orbital
Efecto de la densidad de inoculación
Al analizar el efecto de la densidad de inoculación sobre el proceso de diferenciación de las suspensiones celulares, se observó que sólo se formaron embriones somáticos en los tratamientos inoculados con 0.5 y 1.0 gMF.l-1; mientras que, en los tratamientos inoculados con 5.0 y 10.0 gMF.l-1 se produjo una multiplicación de los agregados celulares.
El proceso de formación de los embriones somáticos se favoreció en el tratamiento inoculado con 1.0 gMF.l-1, pues los embriones somáticos fueron observados a los 19 días de cultivo, dos días antes que el tratamiento inoculado con 0.5 gMF.l-1 y fueron observados de forma individual y también asociados en pequeños grupos que podían ser separados con facilidad (Figura 1).
El mayor número de embriones somáticos (23 154 ES.l-1) se produjo al inocular 1.0 gMF.l-1, con diferencias estadísticas al tratamiento inoculado con 0.5 gMF.l-1, en el cual se obtuvieron 12 507 ES.l-1 (Figura 2).
También se presentaron diferencias estadísticas entre ambos tratamientos en cuanto al número de embriones somáticos según la etapa en que estos se encontraban dentro del proceso de diferenciación (Tabla 2).
Resultados similares fueron obtenidos por Barbón (1997), al trabajar con suspensiones celulares de C. arabica cv. Caturra rojo. Este autor al inocular 0.5 y 1.0 gMF.l -1 observó que los embriones somáticos obtenidos transitaron por todas las etapas del proceso de diferenciación. Sin embargo, a diferencia de los resultados del presente trabajo, al inocular 5.0 gMF.l-1 observó la formación de una gran cantidad de embriones somáticos, pero sólo en la etapa globular, después de transcurridas ocho semanas de cultivo.
Numerosos autores han hecho referencia al papel de la densidad de inoculación y su relación con el proceso de diferenciación, al utilizar como cultivo modelo la zanahoria (Osuga et al., 1993; Osuga y Komamine, 1994; Shigeta et al., 1996). Los mismos han evidenciado que existe un efecto de autoinhibición del proceso embriogénico que está ligado a las elevadas densidades de inoculación y que con anterioridad había sido descrito por Ozawa y Komamine (1989).
Germinación de los embriones somáticos
Los mejores resultados se lograron al emplear el medio de cultivo descrito por Zamarripa et al. (1990), ya que después de ocho semanas de cultivo germinaron como promedio 2.87 embriones somáticos de cada cinco colocados inicialmente en los frascos de cultivo (Tabla 3), lo que representó un 57.5% de germinación. Bajo estas condiciones los embriones somáticos que germinaron alcanzaron a las 12 semanas de cultivo un desarrollo morfológico similar al que se muestra en la figura 3d.
En ambos medios de cultivo se observó entre 40 y 42% de embriones somáticos que sólo presentaron desarrollo del primer par de hojas o de la raíz (Fig.4). Según Al-Khayri (2003) este hecho puede estar relacionado con el empleo en el medio de cultivo de ácido naftalenacético (ANA) como regulador del crecimiento en detrimento del ácido indol butírico (AIB), lo cual sucede en el medio de cultivo propuesto por De García y Menéndez (1987). Por su parte, Perán et al. (2004) también lo atribuyen a la presencia sólo de 6-bencilaminopurina (6-BAP) como único regulador del crecimiento durante el proceso de germinación, lo cual es una de las características del medio de cultivo propuesto por Zamarripa et al. (1990).
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Zamarripa et al. (1990) con este medio de cultivo, lograron entre un 50 y 60% de germinación de embriones somáticos de C. canephora obtenidos a partir de suspensiones celulares. Por su parte, Quiala (1995) realizó un estudio con nueve medios de cultivo para la germinación de embriones somáticos de la especie C. arabica cv. Catimor 9722 y obtuvo los mayores porcentajes de germinación (52.8%) también con el mismo medio de cultivo propuesto por Zamarripa et al. (1990). Según Ziv et al. (1995), la germinación de los embriones somáticos se estimula al ser expuestos a concentraciones bajas de citoquininas o cultivados en medios de cultivo libres de reguladores del crecimiento.
Vázquez et al. (1998) en un estudio con diferentes híbridos de C. arabica, alcanzaron entre 17 y 79% de germinación y plantearon que la diferencia en los porcentajes obtenidos se debió a las características propias de cada híbrido. Cevallos (2000) refirió porcentajes de germinación que oscilaron entre 30 y 39% después de 60 días de cultivo en la especie C. arabica cv. Catimor 9723, mientras que para la especie C. canephora cv. Robusta fueron entre 44 y 53% de germinación a los 70 días. Con anterioridad otros autores han obtenido diferentes porcentajes al trabajar con distintos genotipos, Ducos et al. (1993) informaron para el híbrido Arabusta valores que oscilaron entre 32 y 35%, mientras que para C. canephora cv. Robusta fueron de un 47%. Con este mismo cultivar Zamarripa (1993) y Tahara et al. (1994) indicaron 46 y 48% de germinación respectivamente.
CONCLUSIONES
La densidad de inóculo para el cultivo de células en suspensión varía para cada especie en particular, y es uno de los parámetros de cultivo que define el comportamiento de las suspensiones celulares, independientemente en muchos casos de la fase de desarrollo y la composición del medio de cultivo.
Los resultados obtenidos demostraron que en el cultivo de Coffea arabica cv. Catimor 9722, las bajas densidades de inoculación estimularon el proceso de diferenciación de los agregados celulares y por consiguiente la formación y diferenciación de los embriones somáticos, mientras que al emplear altas densidades de inoculación se favorecieron las condiciones para la multiplicación de los agregados celulares.
Se demostró además, que las condiciones en que se realizó el proceso de diferenciación provocaron asincronía en el desarrollo fisiológico de los embriones somáticos, lo cual constituye uno de los aspectos importantes a estudiar, pues como se conoce, sólo los embriones somáticos que han madurado morfológica y fisiológicamente, son capaces de germinar y dar lugar in vitro a una planta completa, lo cual constituye en definitiva la finalidad de este proceso. No obstante, los porcentajes de germinación obtenidos fueron similares a los valores más elevados descritos para este y otros cultivares y variedades de cafeto hasta el presente.
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