Vol.5, No.1, 2005
Artculo Cientfico                                                                       Biotecnologa Vegetal Vol. 5, No. 1: 33 - 38, enero - marzo, 2005

 

 

Evaluacin de la tolerancia a Finale® en la germinacin y regeneracin in vitro de dos variedades cubanas de arroz (IACuba-17 e IACuba-19)

Daym Abreu*, Maylin Prez, Annerys Gonzlez, Julio Alfonso, Onel Valdivia, Carlos Hernndez y Ral Armas. Autor para correspondencia.

Departamento Investigaciones. Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa de Sancti Spritus. Apartado 83. Sancti Spritus. Cuba. CP 60 200. e-mail: daymi.abreu@cigb.edu.cu

RESUMEN

La eficiencia del proceso de obtencin de plantas transgnicas depende, entre otros factores, del adecuado empleo del agente de seleccin durante el cultivo in vitro del material vegetal transformado. En este trabajo se evalu la tolerancia de dos variedades cubanas de arroz, IACuba-17 e IACuba-19, al herbicida Finale®y se determin la concentracin mnima inhibitoria y las condiciones de incubacin en la germinacin de semillas y la regeneracin de plantas a partir de callos. Concentraciones de 5 y 10 mg.l-1 de Finale®en el medio de cultivo y diez das de incubacin fueron suficientes para inhibir la germinacin de semillas en IACuba-17 y 19, respectivamente. Callos cultivados (0, 2, 4, y 6 das) en el medio de cultivo de regeneracin sin Finale®fueron posteriormente empleados para evaluar la concentracin del agente, capaz de inhibir totalmente la formacin de brotes durante la regeneracin. La combinacin de callos cultivados durante dos das y 3 mg.l-1 de Finale® en el medio de cultivo de regeneracin fue la ms eficiente para la inhibicin de la formacin de brotes. Esta metodologa de seleccin de brotes reduce de nueve a tres semanas el tiempo de cultivo in vitro del material vegetal durante el proceso de obtencin de plantas transgnicas de arroz.

Palabras clave: agente de seleccin, fosfinotricina, germinacin, Oryza, regeneracin, semillas maduras

ABSTRACT

Selection agent used during the shoot selection has an important role on the transgenic plant generation efficiency. In this work, the tolerance to the herbicide Finale® in two Cuban rice cultivars, IACuba17 and IACuba-19 was evaluated, and determined that 10 days exposure to 5 and 10 mg.l-1 of Finale® were enough to avoid seedlings of IAC-17 and IAC-19, respectively. Cultivated calluses (0, 2, 4 and 6 days) in the absence of Finale®in the regeneration medium were used to evaluate the minimal concentration of Finale®that totally inhibits shoot regeneration. Pre-induced calluses cultured during two days and 3 mg.l-1 of Finale® in the regeneration medium was the most efficient combination to select shoots during the generation of transgenic plants resistant to the herbicide. Our shoot selection procedure reduces to 3 weeks the time to obtain shoots during the generation of transgenic rice plants.

Key words: germination, mature seeds, Oryza, phosphinothricin, regeneration, selection markers

INTRODUCCIN

Se estima que cada ao, el arroz (Oryza sativa L.) cultivado reduce en un 50% su rendimiento mximo terico debido a problemas fitosanitarios entre los que se destacan plagas, enfermedades, malas hierbas y factores abiticos (Krattriger, 1997; Toenniessen,1999).

Se considera que las malas hierbas infectan hasta el 80% de las reas destinadas al cultivo del arroz, siendo este factor responsable de las mayores prdidas que limitan su produccin (Herd, 1991). La presencia de malezas taxonmicamente relacionadas, como lo es el arroz rojo, constituye un agravante debido a la imposibilidad de emplear herbicidas selectivos para su control.

La ingeniera gentica posibilita obtener plantas transgnicas de arroz resistentes a herbicidas, mediante la introduccin de genes forneos que codifican para protenas capaces de conferir a las plantas la capacidad de soportar la aplicacin de herbicidas de amplio espectro. Con esto se favorece el uso de productos de nueva generacin, que tienen las ventajas de usar dosis reducidas, ser rpidamente degradados en el suelo y tener una toxicidad ambiental extremadamente inferior a la de los herbicidas selectivos que generalmente se utilizan.

Los herbicidas son potentes agentes de seleccin. Varios genes que confieren resistencia a herbicidas importantes comercialmente han sido aislados, tales como el que expresa glifosato oxirreductasa (GOX) en plantas, que confiere resistencia a glifosato (Barry,1992). El gen bar, que codifica para la enzima fosfinotricina acetiltransferasa, es el gen marcador de seleccin ms comnmente usado en arroz (Cao et al., 1992; Chirtesen et al., 1992; Park,1994; Toki, 1997; Goto et al., 1999; Jiang et al., 2000). Este gen confiere resistencia a L-fosfinotricina (PPT), principio activo de varios herbicidas comerciales como el Finale que ha sido utilizado como agente de seleccin para la obtencin de plantas transgnicas de arroz resistentes a dicho herbicida (Messeguer, 2001; 2004). La fosfinotricina acta inhibiendo la enzima glutamino sintetasa que es responsable de la asimilacin del nitrgeno acumulado en la fotorrespiracin y reduccin de nitrato o metabolismo de aminocidos. En presencia de Finale® las plantas no resistentes acumulan amonio, sufren una rpida inhibicin de la fotosntesis y mueren (Wendler et al., 1990).

La identificacin y seleccin de eventos de transformacin depende del crecimiento diferencial, en presencia del agente de seleccin, del tejido transformado en relacin con el no transformado. El proceso de seleccin puede tomar entre seis y diez semanas y requiere el uso de diferentes concentraciones del agente de seleccin para eliminar escapes (Malabika et al., 2000). Diferentes variedades de arroz exhiben diferentes sensibilidades hacia los agentes de seleccin. Es comn que existan concentraciones de Finale® que no son lo suficientemente txicas, a las cuales las plantas sobreviven debido a una tolerancia basal al herbicida, y esto puede alterar la seleccin del material vegetal verdaderamente resistente. Por esta razn, para obtener plantas transgnicas resistentes a Finale®, es necesario conocer las concentraciones txicas mnimas del herbicida que causan la muerte de la especie de inters durante el cultivo in vitro.

En este trabajo se determin la mnima concentracin de Finale® que inhibi tanto la germinacin in vitro de semillas como la formacin de brotes a partir de callos en las variedades cubanas de arroz IACuba-17 e IACuba-19. El ulterior propsito de esta determinacin es establecer un mtodo efectivo de seleccin que incluya el Finale® como agente se seleccin en la obtencin de plantas transgnicas en ambas variedades de arroz. El empleo del gen bar como gen marcador de seleccin, eliminara el uso del gen que codifica para la higromicina fosfotransferasa (HPT), evitando de este modo los aspectos de percepcin pblica inherentes a la utilizacin de un antibitico como marcador de seleccin.

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal

Se utilizaron semillas maduras de dos variedades cubanas de arroz (Oryza sativa L.) IACuba-17 e IACuba-19, las cuales fueron obtenidas de la Estacin Experimental de Arroz Sur del Jbaro de la provincia de Sancti Spritus.

Finale®

Para determinar la influencia de Finale® sobre la germinacin de semillas y regeneracin de brotes a partir de callos se utiliz el procedente de la Firma Comercial AGREVO, que contiene 150 gramos de ingrediente activo por litro de formulacin.

Desinfeccin

Las semillas fueron descascaradas manualmente y se desinfectaron embebindolas un minuto y medio en etanol 90% con agitacin vigorosa y continua. Seguidamente fueron sumergidas 20 minutos en 2.5% de Hipoclorito de Sodio y se agitaron ocasionalmente. Finalmente se lavaron con agua destilada estril y se secaron sobre papel de filtro estril en una cabina de flujo laminar.

Formacin de callos

Las semillas desinfectadas fueron colocadas, a razn de 10 semillas por placas de Petri (100 x 20 mm), sobre 25 ml de medio de cultivo N6 semislido (Chu et al., 1975) suplementado con 2 mg.l-1 de 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico), 1 g.l-1 de hidrolizado de casena y solidificado con 3 g.l-1 de fitagel. Las semillas se incubaron de 21 a 30 das en condiciones de oscuridad a 27 ± 1C y al cabo de este tiempo los callos con estructuras embriognicas formados fueron colectados y se utilizaron en experimentos de evaluacin de tolerancia al agente de seleccin durante la regeneracin.

Efecto del Finale® en la germinacin de semillas

Se sembraron 15 semillas por placa de Petri de 100 x 20 mm. Cada una contena 25ml de medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) enriquecido con 30g.l-1 de sacarosa, 100 mg.l-1 de mio-inositol y 3g.l-1 de fitagel como agente gelificante. En dependencia del tratamiento las placas contenan las siguientes concentraciones del herbicida Finale®: 0, 1, 3, 5, 10, 15 y 20mg.l-1 respectivamente y se emplearon tres placas por cada tratamiento. Se realizaron dos evaluaciones: una a los 10 das y la otra a las tres semanas y en ambas se determin el nmero de semillas germinadas y la altura de las plantas (cm) medida desde el comienzo del tallo hasta el pice del primordio. La concentracin a la cual se inhibi totalmente la germinacin fue tomada como mnima inhibitoria.

En todos los casos las placas de Petri se incubaron inicialmente durante 30 horas en la oscuridad a 27 ± 1oC y posteriormente se sometieron a un rgimen de fotoperodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad, a 27 ± 1oC.

Regeneracin de brotes a partir de callos en presencia de Finale®

La regeneracin de brotes se realiz en placas de Petri de 100 x 20 mm que contenan 25 ml del medio de cultivo de regeneracin KIBAN (Coll et al., 1998). Se utilizaron, para cada variedad, un total 800 callos de 5-6 mm de dimetro. La preinduccin de brotes se realiz durante 0, 2, 4 y 6 das en el medio de cultivo KIBAN sin agente de seleccin. Transcurridos el tiempo de preinduccin establecido para cada tratamiento los callos fueron transferidos al mismo medio de cultivo de regeneracin con la presencia de Finale® a las siguientes concentraciones: 0, 1, 3, 5, 10, 15 y 20 mg.l-1. A las tres semanas se realiz la evaluacin donde se cuantific el nmero de callos con brotes.

Anlisis estadstico de los resultados

Los resultados se analizaron mediante un anlisis de varianza completamente aleatorizado. Se efectu una comparacin mltiple de medias con la prueba de Student-Newman-Keuls y LSD, haciendo uso del programa COSTAT 2.04.

RESULTADOS Y DISCUSION

Efecto del Finale® en la germinacin de semillas

El efecto inhibitorio del Finale® sobre la germinacin de semillas de las variedades de arroz IACuba-17 e IACuba-19 fue comprobado. El porcentaje de semillas germinadas y la altura promedio de las plantas decrecieron con el aumento de la concentracin del herbicida segn se muestra en las tablas 1 y 2.

En la evaluacin realizada a los 10 das se encontr que 5 y 10 mg.l-1 de Finale® inhibieron totalmente la germinacin de IACuba-17 e IACuba-19, respectivamente. Estas concentraciones inhibitorias fueron iguales a las referidas para esta especie vegetal por Sandhu et al. (2002). La influencia de la variedad en los niveles de tolerancia al herbicida qued demostrada para la germinacin con una significacin estadstica (p= 0.05), sin embargo, al analizar la altura promedio de las plantas no se encontraron diferencias significativas entre las variedades (p=0.05). A las concentraciones inhibitorias se distingui la necrosis tisular por el cambio de color de los primordios de verde a amarillo y se manifest un limitado crecimiento de los embriones de las semillas, que apenas lograron emitir una dbil raz y nunca la primera hoja completa.

La germinacin es favorecida por la actividad de numerosas enzimas engendradas por la base proteica de los cotiledones, que utilizan las reservas a favor del embrin. Entre ellas se encuentran catalasas, amilasas, sacarasa, maltasa, que actan sobre las reservas de las semillas para transformarlas en sustancias nutritivas utilizadas por la planta joven. El embrin y despus la plntula, hasta la tercera hoja primaria inclusive, se desarrollan totalmente a partir de las reservas del grano o semilla (Angladette, 1969).

En una segunda evaluacin, realizada a las tres semanas, se comprob que el efecto inhibitorio del Finale® sobre la germinacin haba disminuido: la inhibicin de la germinacin ocurri a concentraciones entre 15 mg.l-1 y 20 mg.l-1 para cada variedad. Sung et al. (1996) examinaron, en una variedad de arroz tipo Indica, la herencia de un gen forneo mediante germinacin en un medio de cultivo que contena PPT y la concentracin inhibitoria establecida por ellos para la germinacin fue de 2 mg.l-1. La elevada concentracin letal que se obtuvo en el ensayo a las tres semanas, en comparacin con el referido, sugiere que el factor tiempo es determinante en los resultados finales del experimento, pues se corresponde con un agotamiento o degradacin del agente de seleccin en el medio de cultivo lo que permite a las clulas una recuperacin parcial del efecto negativo del Finale®, y ocurre una germinacin tarda que tergiversa los resultados esperados.

Estos resultados sugieren que la concentracin letal mnima de Finale® para la germinacin de semillas de arroz debe quedar establecida a los 10 das de colocadas en medio de cultivo de germinacin y que en el caso especfico de las variedades IACuba-17 e IACuba-19, 5 y 10 mg.l-1 de Finale® son suficientes para la evaluacin de semillas de plantas transgnicas por esta metodologa.

Regeneracin de brotes a partir de callos en presencia de Finale®

Un importante paso en la obtencin de plantas transgnicas de arroz lo es la regeneracin de brotes en los callos sometidos a presin de seleccin.

Las figuras 1A y 1B muestran los resultados obtenidos para cada variedad a las tres semanas de aplicacin de Finale®. La influencia de la variedad fue significativa (p=0.05), el 100 % de los callos de la variedad IACuba-19 colocados directamente en medio de cultivo con Finale®, correspondientes a cero (0) das de preinduccin, fueron capaces de emitir brotes, mientras solamente el 65 % de los de la variedad IACuba-17 lo lograron. Este resultado se mantuvo incluso para los callos con dos das de preinduccin an cuando en ambos cultivares el porcentaje de callos con brotes, para cada concentracin de Finale®, aument a medida que se increment el tiempo de preinduccin de brotes en KIBAN sin Finale®.

La concentracin letal mnima de Finale® en la formacin de brotes a partir de callos de 4 y 6 das de preinduccin result por encima de 10 mg.l-1 en ambas variedades. Esta concentracin estuvo muy por encima de la obtenida por Wan y Lemaux (1994) que utilizaron 3mg.l-1 para cebada (Hordeum vulgare) y a la sugerida por Sonriza et al. (1999) quienes usaron una concentracin de fosfinotricina de 4mg.l-1 como agente de seleccin tambin en la regeneracin de brotes de cebada.

El tiempo de preinduccin en medio de cultivo de regeneracin con un adecuado balance de reguladores del crecimiento y en ausencia del agente de seleccin posibilita en los callos la formacin de embriones somticos, que ms tarde darn lugar a los brotes. Mientras mayor sea el tiempo de preinduccin mayor es el grado de desarrollo de los embriones somticos por lo que al transferir dichos callos al medio de cultivo de regeneracin, ahora en presencia del agente de seleccin, las clulas ms desarrolladas de los embriones somticos son ms tolerantes al Finale® y continan el proceso de regeneracin previamente iniciado en ausencia del herbicida, mientras que las menos desarrolladas son menos tolerantes y manifiesten rasgos de necrosis paulatina y comienzan a extinguirse los brotes incipientes.

La combinacin ms conveniente para la seleccin de brotes resistentes a Finale® result la de 2 das de preincubacin y aplicar despus 3 mg.l-1 del herbicida, pues fue la concentracin mnima a la cual no aparecieron brotes.

Esta metodologa fue diseada para ser empleada en el proceso de transformacin gentica de arroz, pues durante la primera etapa sin agente de seleccin se garantiza la multiplicacin y recuperacin de las clulas transformadas en un medio de cultivo que al mismo tiempo promueve la formacin de brotes. La posterior seleccin con la concentracin inhibitoria definida permiti la continuidad del proceso de regeneracin previamente inducido en los clones resistentes y se aceler la obtencin de brotes respecto al caso en que se iniciara la regeneracin directamente sobre el agente de seleccin.

El procedimiento descrito redujo a tres semanas el tiempo de cultivo in vitro del material vegetal transformado, respecto las nueve semanas que requiere la metodologa tradicional de seleccionar los callos en medio de cultivo crecimiento N6-2 con Finale® para luego transferirlos a medio de cultivo de regeneracin. Este es un factor importante en la eficiencia del procedimiento, ya que alargar el tiempo de cultivo in vitro puede inducir variaciones somaclonales, anomalas fenotpicas, adems de la presencia del regulador de crecimiento 2,4-D en el medio de cultivo N6-2 que en perodos prolongados y elevadas concentraciones puede actuar como agente mutagnico sobre los explantes. (Arencibia et al , 1998).

CONCLUSIONES

El herbicida Finale® inhibi tanto la germinacin in vitro de semillas como la regeneracin de brotes a partir de callos en las variedades cubanas de arroz IACuba-17 e IACuba-19. La concentracin letal mnima para la germinacin se estableci a los 10 das de colocadas las semillas en medio de cultivo de germinacin con 5 y 10 mg.l-1 de Finale® para IACuba-17 e IACuba-19, respectivamente. Para la seleccin de brotes formados a partir de callos la combinacin ms conveniente result ser 2 das de preincubacin y aplicar despus 3 mg.l-1 del herbicida en ambas variedades.

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