Artículo original Biotecnología Vegetal Vol. 15, No. 4: 243 - 249, octubre - diciembre, 2015

ISSN 2074-8647, RNPS: 2154 (Versión electrónica)

Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.

Efecto del estrés hídrico inducido con PEG 6000 sobre la germinación in vitro de semillas de Phaseolus vulgaris L. cv. ‘ICA Pijao’

Lourdes R García1, Michel Leiva-Mora1, Annerys Carabeo Pérez2, Raúl Collado1, Ivian Poveda Martínez2, Novisel Veitía1, Amanda Martirena1, Damaris Torres1, Leonardo Rivero1

1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830

e-mail: lourdes@ibp.co.cu

2Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara.

RESUMEN

La producción de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) tiene gran importancia en Cuba, sin embargo, diversos factores afectan el rendimiento de este cultivo y no todos los cultivares de frijol responden de la misma forma a las condiciones estresantes. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del estrés hídrico inducido con PEG 6000 sobre la germinación in vitro de semillas del cultivar ‘ICA Pijao’. Los resultados mostraron que el incremento de las concentraciones de PEG 6000 redujo el porcentaje de germinación in vitro de semillas de P. vulgaris cv. ‘ICA Pijao’. Esto confirmó que el agente estresante puede ser utilizado para determinar la respuesta fisiológica y que las concentraciones de PEG 6000 a utilizar en bioensayos para evaluar la respuesta de la planta en este cultivar deben ser menores de 18%.

Palabras clave: frijol común, selección in vitro, sequía

Effect of water stress induced by PEG 6000 on in vitro germination of Phaseolus vulgaris L. cv. ‘ICA Pijao’ seeds

ABSTRACT

The common bean (Phaseolus vulgaris L.) production has been very important in Cuba, however, several factors affect the yield of this crop and not all cultivars of beans respond the same way to the stressful conditions. The aim of this study was to determine the effect of water deficit induced by PEG 6000 on the cultivar ‘ICA Pijao’. The results showed that increasing concentrations of PEG 6000, reduced the percentage of P. vulgaris cv. ‘ICA Pijao’ in vitro germination, it confirmed that this stressor agent could be useful to elucidate the physiological response and PEG 6000 concentration to be used in bioassays to evaluate the plant response in this cultivar should be less than 18%.

Key words: common beans, drought, in vitro selection

INTRODUCCIÓN

En varios países del mundo las leguminosas constituyen un elemento básico en la dieta debido a su alto contenido de proteínas, vitaminas, calorías y otros minerales. Dentro de este grupo, el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una especie valiosa. Este cultivo es oriundo de América Latina, aunque se encuentra distribuido en los cinco continentes (Ramírez y Rangel, 2011).

A pesar de su alto valor alimenticio la producción de frijol es limitada, pues frecuentemente este cultivo es afectado tanto por factores bióticos como abióticos. Los factores abióticos como la sequía, la salinidad, la temperatura, la humedad, la intensidad luminosa y la acidez de los suelos influyen en el desarrollo del cultivo (Campos et al., 2011).

De hecho, todos estos factores pueden provocar estrés en la planta (Mahajan y Tuteja, 2005; Abdellatif et al., 2012) lo cual afecta su rendimiento biológico y agrícola. Se ha estimado que la sequía reduce en un 60% la producción mundial de granos de frijol común (Porch et al., 2009). Por ello, se hace necesario el desarrollo de investigaciones encaminadas a la identificación y la obtención de cultivares tolerantes al estrés hídrico, que contribuyan al incremento de la producción de este cultivo (Domínguez et al., 2014). Para ello el cultivo de tejidos y la selección in vitro pudieran ser herramientas a utilizar en programas de mejoramiento genético en esta especie.

A nivel de laboratorio, con el empleo de agentes estresantes, es posible simular condiciones de estrés hídrico. Dentro de los compuestos empleados para este fin el polietilenglicol (PEG) es el más utilizado porque permite mantener el medio experimental a valores predeterminados de potencial hídrico y es capaz de competir con las células por el agua debido a su alto peso molecular. Esto facilita la retención de líquido y provoca descensos en el potencial osmótico de manera similar a lo que ocurre cuando se seca el sustrato en el que se cultivan las plantas (Rai et al., 2011).

Entre las variables morfofisiológicas que permiten observar en qué medida se producen los daños en una especie y cómo se afecta la germinación y el crecimiento ante condiciones edafoclimáticas adversas se encuentran las relacionadas con el crecimiento y el sistema radical. Dentro de ellas, la longitud de la raíz principal, longitud del tallo, número total de raíces, número de hojas, área foliar, materia seca, contenido hídrico relativo, discriminación de isótopos de carbono, porcentaje de pérdida de electrólitos, liberación de fosfato inorgánico, formación de áreas necróticas en el tejido foliar, entre otros (Schulze et al., 2005).

No todos los cultivares de frijol responden de la misma forma a condiciones estresantes pues el nivel de susceptibilidad o tolerancia varía de una a otra. El grado de tolerancia depende además de la intensidad y la etapa de desarrollo del cultivo sobre la que el factor actúe (Domínguez et al., 2014). Por estas razones se requieren ensayos que permitan discriminar entre los cultivares en base a su respuesta. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto del estrés hídrico inducido con Polietilenglicol 6000 sobre la germinación in vitro de semillas de frijol común cv. ‘ICA Pijao’.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se emplearon semillas maduras de P. vulgaris cv. ‘Ica Pijao’, obtenidas por selección en el Centro Internacional de Agricultura Tropical de Colombia (CIAT) y cultivadas en Cuba.

Desinfección

Las semillas se colocaron en una solución de etanol al 70% (v/v) por 2 min y se agitaron de forma manual. A continuación se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 3% (v/v), por 10 min con agitación constante en un agitador orbital a 110 rpm. Posteriormente, se enjuagaron tres veces con agua destilada. Las semillas desinfectadas se colocaron 24 h en agua desionizada estéril a razón de 100 semillas/100 ml para su total imbibición.

Estrés hídrico inducido

El Polietilenglicol 6000 (PEG 6000) se utilizó como agente estresante para simular condiciones de estrés hídrico in vitro. Para ello se prepararon soluciones de PEG 6000 con agua destilada a diferentes concentraciones 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18% (m/v). Como control se empleó agua destilada. El cálculo del potencial osmótico equivalente para cada una de las soluciones, se realizó mediante la ecuación descrita por Michel y Kaufmann (1973) dónde: 6% (−0.066 MPa), 8% (−0.103 MPa), 10% (−0.148 MPa), 12% (−0.201 MPa), 14% (−0.262 MPa), 16% (−0.330 MPa) y 18% (−0.407 MPa).

Cada semilla embebida se colocó sobre un papel de filtro (Whatman No. 42) colocado en forma de M dentro de un tubo de ensayo (150 mm largo x 20 mm diámetro) con 10 ml de la solución de PEG 6000.

El material vegetal se mantuvo en una cámara de cultivo a 25 ± 2 °C bajo un fotoperíodo de 16 h luz / 8 h oscuridad. Para la iluminación de la cámara se emplearon lámparas fluorescentes con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 45 µmol m-2 s-1.

A las 48 h se calculó el porcentaje de germinación (PG) de acuerdo con la siguiente ecuación: PG = (SG / NTS) x 100. Donde SG es el número de semillas que emitieron radícula a las 48 h y NTS es el número total de semillas.

Entre los tres y seis días se evaluaron otras variables asociadas a la germinación tales como: longitud del tallo (longitud del hipocótilo + longitud del epicótilo (mm), longitud de la raíz (mm) y área foliar de las primeras hojas (cm2).

El área de la hoja se determinó a través de la ecuación propuesta por Barrios et al. (1998):

Ah = 0.603 + 0.581 (L x A), donde Ah (área de la hoja), 0.603 y 0.581 (coeficientes establecidos para cálculo de área foliar en la especie P. vulgaris), L (Largo de la hoja) y A (ancho de la hoja).

Para el análisis estadístico de los datos experimentales se utilizó el Paquete estadístico SPSS versión 21.0. Se comprobó la normalidad y la homogeneidad de varianza, mediante la prueba de Shapiro-Wilk y la prueba de Levene, respectivamente. Como los datos no cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza, se aplicó un análisis no paramétrico mediante las pruebas de Kruskal Wallis y Mann Whitney para un nivel de confianza del 95%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las semillas previamente embebidas germinaron en todos los tratamientos. Sin embargo, con el aumento de las concentraciones de PEG 6000 disminuyó el porcentaje de germinación (Figura 1).

Con la menor concentración de PEG 6000 (6%) no se afectó la germinación, en este tratamiento al igual que en el control se alcanzó un 100% de germinación. En las soluciones con concentraciones entre 8 y 14% el porcentaje de germinación decreció más de un 20% sin diferencias entre estos tratamientos, pero significativamente inferior al valor presentado en el control. La germinación fue drásticamente reducida con 16 y 18% de PEG 6000, las semillas colocadas en ambas concentraciones mostraron los porcentajes más bajos en esta variable (Figura 1).

En este sentido, la germinación de la semilla y el crecimiento prematuro de la plántula son consideradas fases críticas para la colonización y el establecimiento de cualquier especie de planta. Según Zhu et al. (2011) la inducción in vitro del estrés hídrico, utilizando PEG 6000 en semillas de P. vulgaris, facilita la evaluación de parámetros fisiológicos asociados con la germinación que podrían ser usados como fuente para discriminar líneas de P. vulgaris tolerantes a la sequía.

En este trabajo, las altas concentraciones de PEG 6000 (16 y 18%) redujeron la absorción de agua por las semillas, lo que trajo como consecuencia la disminución en un 50% del porcentaje de germinación. Estos resultados son similares a los obtenidos por Moraes et al. (2005), quienes observaron una significativa reducción de la germinación y el vigor de las plántulas de P. vulgaris cuando las concentraciones de PEG 6000 estaban por encima del 14%.

De igual forma, con la aplicación de este agente estresante, Hamidi y Safarnejad (2010) detectaron una disminución del porcentaje de germinación en semillas de alfalfa (Medicago sativa L.). Por el contrario, Erice et al. (2010), en esta misma especie no encontraron diferencias entre cuatro genotipos respecto a la longitud y la masa seca de las semillas bajo condiciones de estrés hídrico in vitro. Sin embargo, en investigaciones realizadas por Suárez et al. (2014) evaluaron el efecto del PEG 8000 sobre la germinación de las semillas de P. vulgaris L. y obtuvieron como resultado una disminución marcada del porcentaje de germinación en los diferentes cultivares al 10 y 15% de PEG 8000 al compararlos con el control no estresado.

La adición de PEG 6000 también afectó el crecimiento de otros órganos como la raíz y el tallo. Con el incremento de las concentraciones de este agente estresante se observó un aumento del número de raíces secundarias y una reducción de la longitud del tallo y la raíz en comparación con el control. Para la variable longitud de las raíces se observaron menores afectaciones que para la longitud del tallo. Las diferencias en el crecimiento de ambos órganos (tallo y raíz), en dependencia de la concentración de PEG 6000 empleada, se apreciaron al inicio de la germinación, a los tres días y en la culminación de esta etapa, a los seis días (Figura 2).

El crecimiento del tallo y la raíz fue inversamente proporcional al aumento de las concentraciones de PEG 6000. Las mayores afectaciones se obtuvieron con la concentración de 18% donde fue muy pobre el crecimiento del tallo, tanto a los tres como a los seis días después de la germinación, lo que difirió significativamente con los demás tratamientos (Figura 3). Estos resultados evidencian que en el cultivar ‘ICA Pijao’ las concentraciones de PEG 6000 a utilizar en bioensayos para evaluar la respuesta de la planta deben ser menores de 18%.

Los resultados de este trabajo se corresponden con lo planteado por Barrios et al. (1998) quienes demostraron que el frijol común duplica el número de raíces secundarias y terciarias en respuesta a la sequía. Una respuesta común de las plantas a la sequía es la disminución del crecimiento de las semillas y favorecer el crecimiento de la raíz para aumentar la absorción de agua (Wu et al., 2008). Sobre lo anterior, Rashidi (2011) observó una reducción del crecimiento de las semillas de diferentes genotipos de P. vulgaris sometidos a los efectos de la sequía en condiciones de campo. De igual forma, Suárez et al. (2014) al analizar la longitud del tallo y la raíz comprobaron que estos parámetros de crecimiento se afectaron en los genotipos estudiados de P. vulgaris, en las condiciones de sequía experimental, siendo la afectación más severa en las semillas germinadas en la concentración de 20% de PEG.

Además, según lo planteado por Bhatt y Srinivasa (2005), la reducción del crecimiento en las plantas está asociada con la disminución del ancho de la célula y una mayor senescencia bajo el estrés hídrico. Por esto, se puede decir que las deformaciones observadas en la arquitectura de la planta después del proceso de germinación de las semillas (la reducción del tallo y la raíz principal y el aumento de ramificaciones de raíces secundarias), puede estar relacionado con la tolerancia a la sequía, pues esta adaptación le facilita a la planta extraer más agua del suelo y el transporte de esta hacia otros tejidos para realizar el proceso más importante, la fotosíntesis (Jaleel et al., 2009).

Un profundo y extenso sistema radicular respalda el incremento de la productividad de las leguminosas bajo condiciones de sequía. La longitud de la raíz podría ser una característica importante en la selección in vitro de cultivares de frijol tolerantes a la sequía con una mejor capacidad para obtener agua.

El PEG 6000 también afectó el desarrollo del área foliar de P. vulgaris cv. ‘ICA Pijao’. En presencia de las menores concentraciones (6, 8 y 10%) de este agente estresante, la expansión de las hojas primarias fue significativamente inferior comparada con el tratamiento control (Figura 4). El incremento de las concentraciones de PEG 6000 a partir del 12% redujo considerablemente el área de las hojas primarias. La mayor afectación en el área foliar, se observó con PEG 6000 al 16 y 18%. En estos tratamientos las plántulas no presentaron hojas expandidas.

Resultados similares fueron informados por Gunton y Evenson (1980) y Barrios et al. (1998), quienes observaron una reducción del área foliar de las plantas de frijol cuando estas fueron expuestas a estrés hídrico durante la fase de crecimiento vegetativo. De igual forma, concuerdan con lo planteado por Passioura (2002), quien refiere que la variación del área foliar es una de las respuestas macroscópicas más tempranas en plantas que sufren déficit hídrico. Se ha considerado que el déficit hídrico reduce el crecimiento de la hoja y como consecuencia el área foliar en muchas especies de leguminosas como el frijol (Zhang et al., 2004), lo que trae como consecuencia una disminución de los procesos fotosintéticos. En este sentido, Sánchez-Blanco et al. (2009) indujeron la disminución del área foliar en plantas expuestas a diferentes regímenes de agua y Emam et al. (2010) observaron reducción del área foliar en dos cultivares de frijol común con diferentes hábitat de crecimiento bajo los efectos de sequía.

La disminución del área foliar por planta constituye una respuesta adaptativa que se produce una vez que aumenta la concentración de la solución de PEG 6000, lo cual contribuye a controlar la pérdida de agua bajo condiciones de sequía inducida. Por tanto la disminución del área foliar constituye una variable morfofisiológica que podría servir como criterio de selección para encontrar genotipos de frijol tolerantes al estrés hídrico en programas de mejoramiento genético.

CONCLUSIONES

El PEG 6000 puede ser utilizado para determinar la respuesta fisiológica de plantas de frijol común ‘ICA Pijao’ ante estrés hídrico. El incremento de las concentraciones de de este agente estresante redujo el porcentaje de germinación in vitro de semillas. Las concentraciones a utilizar deben ser menores de 18%.

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Recibido: 22-06-2015

Aceptado: 25-09-2015



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