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ARTÍCULO ORIGINAL
Biotecnología
Vegetal Vol. 14, No. 2: 91 - 97, abril - junio, 2014
ISSN 2074-8647,
RNPS: 2154 (Versión electrónica)
Instituto
de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.
Efecto de la densidad de inoculación en la germinación de embriones somáticos de Coffea arabica L. cv. `Caturra rojo' en Sistemas de Inmersión Temporal RITA®
Effect of the inoculation density in Coffea arabica L. cv. `Caturra rojo' somatic embryos germination in RITA® Temporary Immersion System
Raúl Barbon1*, Hien Nguyen Thi1,2, Alina Capote1, Manuel de Feria1, Elisa Quiala1, Anabel Pérez1 *Autor para correspondencia
1Instituto
de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las
Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara, Cuba.
CP 54 830. e-mail: raulb@ibp.co.cu
2Facultad
de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera
a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830.
RESUMEN
El desarrollo de la embriogénesis somática de cafeto (Coffea spp.) en medios de cultivo líquido es una alternativa viable para la propagación de esta especie. El empleo de medios de cultivo líquido y sistemas de inmersión temporal, podría incrementar la germinación de los embriones somáticos y mejorar la calidad de las plantas. Para ello se propuso como objetivo determinar el efecto de la densidad de inoculación en la germinación de embriones somáticos de Coffea arabica L. cv. `Caturra rojo' en Sistemas de Inmersión Temporal tipo RITA®. Se emplearon 40, 50, 60, 70 y 80 embriones somáticos por RITA® como densidades de inóculo. A los 90 días de cultivo se cuantificó el número de embriones somáticos germinados, síntomas de hiperhidricidad, número de hojas verdaderas, longitud y desarrollo radical. Con la densidad de inóculo de 70 embriones somáticos por RITA®, se logró el mayor porcentaje de germinación (60%) con buen desarrollo foliar y de longitud de las plantas obtenidas.
Palabras clave: embriogénesis somática, germinación parcial, germinación total, hiperhidricidad, medio de cultivo líquido
ABSTRACT
The development of somatic embryogenesis of coffee (Coffea spp.) in liquid culture medium is a viable alternative for the propagation of these species. The use of liquid culture medium and temporary immersion systems could increase the germination of somatic embryos and improve the quality of plants. The objective of this work was to determine the effect of inoculation density on germination of somatic embryos of Coffea arabica L. cv. `Caturra rojo' in temporary immersion systems RITA®. It were used as inoculum densities 40, 50, 60, 70 and 80 somatic embryos per RITA®. After 90 days of culture the number of somatic embryos germinated, hyperhydricity symptoms, number of true leaves, length and root development was quantified. With inoculum density of 70 somatic embryos per RITA®, it was obtained a highest germination percentage (60%) with good leaf development and length of the plants.
Key words: hyperhydricity, liquid culture medium, partial germination, total germination, somatic embryogenesis
INTRODUCCIÓN
El café
es uno de los productos agrícolas más importantes, ocupa el segundo
lugar en el comercio internacional después del petróleo. Como
cultivo las plantaciones de cafeto (Coffea spp.) abarcan aproximadamente
10.2 millones de hectáreas en más de 80 países sobre todo
en las regiones tropicales y subtropicales de África, Asia y América
Latina.
La economía de muchos países productores de café depende
en gran medida de las ganancias de este cultivo. Más de 100 millones
de personas obtienen sus ingresos directa o indirectamente de las áreas
cultivadas de cafeto (ICO, 2013).
El cultivo de células y tejidos vegetales desempeña un papel importante en la biotecnología agrícola. La embriogénesis somática como método de regeneración de plantas se ha logrado en un gran número de familias y especies y se ha usado para los estudios básicos de fisiología vegetal y en aplicaciones más prácticas, como la micropropagación y la transformación genética.
El cultivo de tejidos aplicado al cafeto es un tema que ocupa a varios laboratorios en todo el mundo. La producción de embriones somáticos en biorreactores, su germinación en Sistemas de Inmersión Temporal (SIT), la crioconservación y el mejoramiento genético han sido y continúan estando entre las principales temáticas de investigación (Santana-Buzzy et al., 2007). En este sentido, la multiplicación acelerada de plantas de cafeto a través de embriogénesis somática busca establecer la producción de plantas de gran potencial y reducir los costos de producción de posturas (de Rezende et al., 2012).
En la década de los 90, del siglo XX, se lograron importantes avances hacia la implementación comercial de la embriogénesis somática de cafeto en medio de cultivo líquido (Zamarripa et al., 1991; Neuenschwander y Baumann, 1992; Zamarripa et al., 1993; Van Boxtel y Berthouly, 1996).
El desarrollo de
la embriogénesis somática de cafeto en medio de cultivo líquido
es una alternativa viable con respecto a la propagación en medios de
cultivo semisólido
según se ha demostrado al trabajar con Coffea canephora P. ex
F. (Robusta) e híbridos F1 de Coffea arabica L. (Ducos et al.,
2007).
El empleo de medios de cultivo en estado líquido combinado con sistemas de cultivos basados en la inmersión temporal de los explantes, podría disminuir los plazos de tiempo, incrementar los porcentajes de germinación y mejorar la calidad de las plantas para su conversión en condiciones ex vitro. Es por ello, que se propone como objetivo de este trabajo: determinar el efecto de la densidad de inóculo en la germinación de embriones somáticos de cafeto en Sistemas de Inmersión Temporal RITA®.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron embriones somáticos de Coffea arabica L. cv. `Caturra rojo' en etapas avanzadas de desarrollo (torpedo y cotiledonal) (Figura 1). Los embriones somáticos fueron obtenidos a partir de suspensiones celulares embriogénicas en fase de diferenciación según la metodología descrita por de Feria et al. (2005). Se empleó el medio de cultivo propuesto por Zamarripa et al. (1991) para la germinación de los embriones somáticos de cafeto. Se dosificaron 200 ml de medio de cultivo por Sistema de Inmersión Temporal RITA®.
comprobación del no cumplimiento de los supuestos de normalidad y homogeneidad
de varianzas, utilizando el paquete estadístico SPSS versión 18.0
sobre Windows.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En los Sistemas de Inmersión Temporal RITA® las primeras señales del desarrollo de los embriones somáticos ocurrieron alrededor de los quince días de cultivo después de ser colocados en el medio de cultivo para la germinación, cuando cambiaron de un color crema a verde brillante (Figura 2).
Los resultados revelaron que existió una relación entre la densidad de inóculo y el número de embriones somáticos germinados en los Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) RITA®. A los 90 días de cultivo se observó la presencia de embriones somáticos germinados en los diferentes tratamientos (Figura 3).
Los mayores valores de porcentaje de germinación (60%) se obtuvieron con una densidad de 70 embriones somáticos por SIT (Figura 4). Estos resultados fueron similares a los descritos por Etienne et al. (2002), pero en otro cultivar de Coffea arabica L.
Efecto de la densidad de inoculación
Para determinar el efecto de la densidad de inoculación en la germinación de los embriones somáticos se conformaron cinco tratamientos con 40, 50, 60, 70 y 80 ES por RITA®. Para cada tratamiento se establecieron cuatro réplicas y el sistema fue programado para transferir el medio de cultivo y sumergir los embriones somáticos durante un minuto cada doce horas.
La fase de germinación de los embriones somáticos de cafeto en Sistema de Inmersión Temporal RITA® se realizó en una cámara de crecimiento con luz solar con un flujo fotosintético de fotones que osciló entre 48.0 62.5 ìmol-2s-1 con una duración del período luminoso máximo y mínimo de 14h y 10h, y una temperatura de 25.0 ± 2.0ºC. A los 90 días de cultivo se cuantificó el número de embriones somáticos con germinación total y el número de embriones somáticos con germinación parcial por tratamiento, así como el número de embriones somáticos con síntoma de hiperhidricidad. Además, se describieron las características morfológicas de las plantas obtenidas a través del número de hojas, la longitud de la planta (cm) y desarrollo radical.
Análisis estadísticos
Para el análisis de los datos se realizó la prueba de Kruskal Wallis/ Mann Whitney previa
A través de la caracterización visual y por la respuesta morfológica observada, las plantas obtenidas a partir de la germinación de los embriones somáticos en los Sistemas de Inmersión Temporal RITA® no presentaron síntomas de hiperhidricidad (Figura 5), aspecto también señalado por Cabasson et al. (1997), en embriones somáticos de Citrus deliciosa L. y por Escalona (2003), en brotes de Ananas comosus (L.) Merr multiplicados en SIT.
En los tratamientos con una densidad de inóculo inferior a 70 embriones somáticos por SIT se obtuvo un menor porcentaje de germinación con respecto a este tratamiento. La densidad de inóculo como variable tuvo su fundamento en la cantidad de volumen de medio de cultivo disponible por explante, además del espacio físico para su desarrollo. Teniendo esto como base es posible que en el tratamiento con menor densidad de inóculo (40 ES), el cual se corresponde con el mayor volumen de medio de cultivo por explante, estos estaban expuestos a condiciones de cultivo que provocaron estrés. En dependencia de la magnitud del estrés, los explantes pueden normalizarse por un incremento en su desarrollo morfofisiológico (Joyce et al., 2003). Sin embargo, si se exceden los límites de tolerancia se observan daños permanentes en el desarrollo y crecimiento e incluso la muerte de los embriones somáticos como pudo haber sucedido en el tratamiento con una menor densidad de inóculo (Figura 6).
Autores como Lorenzo et al. (1998) en el cultivo de Saccharum spp. en SIT, sugirieron que la influencia negativa de mayores volúmenes de medio de cultivo por explante se debe a que sustancias químicas que se secretan al medio de cultivo y estimulan el desarrollo de brotes son diluidas en el mismo. Al respecto, Escalona et al. (2003) informaron de la influencia negativa de mayores volúmenes de medio de cultivo en el desarrollo y crecimiento de brotes de Ananas comosus (L.) Merr en SIT. El proceso morfogenético en las plantas está controlado por una interacción entre el material vegetal, el medio de cultivo y el ambiente in vitro, aspecto que es muy importante en los Sistemas de Inmersión Temporal.
En el tratamiento con 80 embriones somáticos como densidad de inóculo hubo una mayor competencia por los nutrientes, lo que se evidenció en el menor desarrollo foliar y una mayor presencia de germinación parcial de los embriones somáticos (Figura 7). Esto pudiera ser el resultado de la interrupción y la no sincronización de señales de inducción en la secuencia normal de los eventos de organización celular (Ziv, 2000).
La densidad de inoculación tuvo influencia en la longitud de las plantas que disminuyó significativamente con la mayor densidad (80 ES/SIT). Sin embargo, el mayor número de hojas por planta se obtuvo en las variantes con densidades de inóculo de 50 y 60 embriones somáticos por SIT (Tabla 1).
Las características morfológicas de de las plantas obtenidas en los Sistemas de Inmersión Temporal RITA®, no difirieron de las propagadas en medios de cultivo semisólido en estudios previos (de Feria et al., 2005). Los embriones somáticos germinaron de forma individualizada en los SIT y tenían una morfología parecida a la de los embriones cigóticos, aspectos descritos anteriormente por Etienne y Berthouly (2002). En ninguno de los tratamientos se encontró presencia de hiperhidricidad, ni en los embriones somáticos ni en las plantas germinadas a partir de ellos. Todas las ventajas de estos sistemas parecen ser el resultado de las condiciones físicas creadas en el recipiente de cultivo como son: la permanencia de una película superficial de medio de cultivo líquido sobre los tejidos que puede ser una de las principales razones de éxito de este sistema, pues no solamente asegura una disponibilidad nutritiva fuera de los períodos de inmersión, sino también interrumpe mucho menos los intercambios gaseosos que la inmersión total. Esta permanencia de medio de cultivo explica también la ausencia de daños y desecación de los embriones somáticos, incluso en el caso de una inmersión muy ocasional y breve, lo cual también fue descrito por Etienne y Berthouly (2002).
Otra variable ligada con las condiciones físicas que parece significativa es la concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo líquido cuyo efecto en los fenómenos in vitro es conocido desde hace muchos años (Teisson y Alvard, 1995). En el Sistema de Inmersión Temporal esta concentración alcanza la saturación solo un minuto después del burbujeo. En el caso de Erlenmeyers agitados sin tejido vegetal y sin consumo de oxígeno, la concentración de este gas disuelto nunca sobrepasa el 95% de saturación. Todos estos puntos significan que, en tal aparato, las condiciones físicas de nutrición, de intercambios de gases y de relaciones con el agua de los tejidos vegetales son completamente diferentes de las que se encuentran en las técnicas tradicionales. Estas condiciones fisiológicas conducen a un crecimiento totalmente diferente (Cabasson et al., 1997).
CONCLUSIONES
La densidad de inoculación tuvo efecto sobre la germinación de embriones somáticos de cafeto cv. `Caturra rojo' en SIT RITA®. Con 70 embriones somáticos/SIT se logró el mayor porcentaje de germinación (60%) con un buen desarrollo foliar y de longitud de las plantas obtenidas.
REFERENCIAS
Cabasson C, Alvard D, Dambier D, Ollitrault P, Teisson C (1997) Improvement of Citrus somatic embryo development by temporary immersion. Plant Cell Tiss. Org. Cult 50: 33 - 37
De Feria, M, Jimenéz E, Barbón R, Capote A, Chavez M, Quiala E (2005) Diferenciación y germinación de embriones somáticos de Coffea arabica L. cv. Catimor 9772 obtenidos en agitador orbital. Biotecnología vegetal 5(2): 95 101
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Etienne H, Anthony F, Dussert S, Fernandez D, Lashermes P, Bertrand B (2002) Biotechnological applications for the improvement of coffee (Coffea arabica L.). In Vitro. Dev. Biol. Plant 38: 129 138
Etienne H, Berthouly M (2002) Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell,Tissue and Organ Culture 69: 215 - 231
ICO (International Coffee Organization) (2013) Trade Statistics. [En línea] En: http://www.ico.org/trade_statistics.asp. Consultado el 16 de septiembre de 2013
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Ziv M (2000) Bioreactor technology for plant micropropagation. Hortic Rev 24: 1-30
Recibido: 12-02-2014
Aceptado:
28-03-2014
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