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Artículo original
Biotecnología Vegetal Vol. 16, No. 4: 231 - 237, octubre - diciembre, 2016
Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.
eISSN 2074-8647, RNPS: 2154
Efecto de la densidad de inóculo sobre la morfología y fisiología de los brotes de Bambusa vulgaris Schrad. ex Wendl cultivados en Sistema de Inmersión Temporal
Effect of inoculum density on the morphology and physiology of Bambusa vulgaris Schrad. ex Wendl shoots cultured in Temporary Immersion System
Yudith García-Ramírez1, Mallelyn González-González2, Sinesio Torres García2, Marisol Freire-Seijo1, Martha Pérez1, Ángel Mollineada Trujillo3, Leonardo Rivero1
1Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54830. e-mail: yudith@ibp.co.cu
2Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara, Cuba. CP 54830.
3Centro de Investigaciones Agropecuarias, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara, Cuba. CP 54830.
RESUMEN
Bambusa vulgaris Schrad. ex Wendl es una especie de gran importancia ambiental y desempeña un papel vital en el desarrollo económico de Cuba. El presente trabajo se llevó a cabo con el objetivo de determinar el efecto de la densidad de inóculo sobre la morfología y fisiología de brotes de B. vulgaris cultivados en SIT. Se evaluaron variables morfológicas y fisiológicas de plantas cultivadas con diferentes densidades de inóculo (6, 12 y 18 explantes por SIT) durante 30 días. Los resultados mostraron que las densidades estudiadas tuvieron efecto sobre el crecimiento y la fisiología de los brotes durante la multiplicación in vitro. Los estudios revelaron que el número de brotes, la longitud del brote principal, el número de hojas y la clorofila aumentaron con la densidad del inóculo de 12 explantes. Sin embargo, con el experimento se demostró que el aumento de la densidad del inóculo disminuyó la acumulación de clorofila total, el contenido de masa seca de los brotes y aumentó el contenido de agua. Estos resultados mostraron una mejor respuesta morfo-fisiológica de los brotes cultivados con 12 explantes. Este estudio proporciona una comprensión inicial de la respuesta de los brotes de B. vulgaris al cultivo de condiciones in vitro, lo que es importante para aumentar la producción de plantas de bambú.
Palabras clave: bambú, contenido de agua, clorofila, masa fresca, masa seca
ABSTRACT
Bambusa vulgaris Schrad. Ex Wendl is a species of great environmental importance and plays a vital role in the economic development of Cuba. The present work was carried out with objective of determining effect of inoculum density on morphology and physiology of the shoots of B. vulgaris cultivated in SIT. Morphological and physiological parameters of cultivated plants were evaluated at different inoculum densities (6, 12 and 18 explants per SIT) for 30 days. The results showed that densities studied had an effect on growth and physiology of shoots during in vitro multiplication. Studies revealed that number of shoots, shoot length, leaf numbers and chlorophyll increased with inoculum density of 12 explants. However, experiment showed that increase in inoculum density decreased accumulation of total chlorophyll, dry mass content of the shoots and water content. These results showed a better morpho-physiological response of shoots cultivated with 12 explants. This study provides an initial understanding of response of B. vulgaris shoots to cultivation of in vitro conditions, which is important for increasing production of bamboo plants.
Keywords: bamboo, chlorophyll, fresh and dry mass content, water content
INTRODUCCIÓN
Los bambúes tienen gran importancia práctica a nivel mundial (Pratibha y Sarma, 2014). Sin embargo, Bambusa vulgaris Schrad. ex Wendl es la especie más extendida y bien adaptada a las condiciones del Caribe. Cuba, en particular tiene enmarcada la reforestación con esta especie, debido a su impacto ambiental en muchas áreas deforestadas y degradadas (Cordero-Miranda, 2010).
Desarrollar la propagación in vitro vía organogénesis sería una alternativa para incrementar el número de plantas de B. vulgaris en todo el territorio nacional (Álvarez et al., 2003). En la actualidad la mayoría de los resultados describen protocolos a partir del empleo de los medios de cultivo en estado semisólido principalmente para Bambusa arundinacea Retz. Willd (Kalaiarasi et al., 2014; Venkatachalam et al., 2015), Guadua angustifolia Kunth (Correa et al., 2015) y Dendrocalamus strictus (Roxb.) (Goyal et al., 2015).
En estudios previos se ha desarrollado la regeneración vía organogénesis de B. vulgaris en medio de cultivo líquido estático y se destacan deficiencias como los bajos coeficientes de multiplicación, número de hojas emitidas y la longitud de los brotes (García-Ramírez et al., 2015). Conjuntamente con una pérdida del contenido de clorofilas totales, altos porcentajes de contenido de agua en los tejidos, bajos porcentajes de ligninas y fenoles en las hojas (González-González, 2013). Dicha deficiencia se asocia a una alta humedad relativa, un intercambio gaseoso limitado entre la atmósfera interna de los recipientes de cultivo y su medio ambiente circundante y la acumulación de etileno, condiciones que pueden inducir trastornos fisiológicos (Dewir et al., 2014).
Con el objetivo de mejorar estas limitante se han ensayado diversas alternativas a través del empleo de sistemas de inmersión temporal (SIT). Estos garantizarían una mayor calidad morfo-fisiológica de las plantas (Aragón et al., 2010) debido a una mejor aireación provocada por la inmersión periódica y la renovación del ambiente interior, lo que resulta en una reducción de la hiperhidricidad (Vidal et al., 2015).
En este sentido, la densidad de inóculo y el volumen de medio de cultivo son factores que pudieran contribuir a incrementar el número y la calidad morfo- fisiológicas de los brotes multiplicados in vitro de B. vulgaris. Se ha demostrado que el ajuste de estos factores mejora el desarrollo y crecimiento de los brotes, además de la morfología y fisiología con respecto a las plantas obtenidas en los sistemas en medio de cultivo líquido estático y semisólido (Gutiérrez et al., 2016).
Por todo lo antes planteado la presente investigación se desarrolló con el objetivo de determinar el efecto de la densidad del inóculo sobre la respuesta morfológica y fisiológica en la proliferación de brotes de Bambusa vulgaris Schrad. ex Wendl. en SIT.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se emplearon brotes de B. vulgaris multiplicados in vitro (tercer subcultivo) en medio de cultivo líquido estático según el protocolo propuesto por García-Ramírez et al. (2010). Cada explante consistió en grupos de 10-12 brotes con hojas expandidas (Figura 1).
Procedimientos generales
Para la multiplicación en SIT se empleó el medio de cultivo compuesto por sales inorgánicas MS de Murashige y Skoog (1962), 6-BAP (6.0 mg l-1), mio-inositol (100 mg lˉ1) y sacarosa (30 g lˉ1). El pH se ajustó a 5.7 con el uso de HCl y KOH antes de la esterilización en autoclave.
Para la multiplicación in vitro de los brotes de B. vulgaris se emplearon sistemas de inmersión temporal (SIT) según el sistema de funcionamiento descrito por Escalona et al. (1999). Cada sistema emplea dos frascos de vidrio de 1500 ml de capacidad, uno como reservorio de medio de cultivo y otro como frasco de cultivo para crecimiento del material vegetal. El tiempo de inmersión fue de dos minutos y la frecuencia de inmersión cada 6 horas (4 inmersiones en 24 horas). En cada tratamiento se utilizaron cuatro SIT, cada frasco con 225 ml de medio de cultivo de multiplicación in vitro.
Los frascos de cultivo se colocaron en cámaras de crecimiento de luz solar a 28±2.0°C, el flujo de fotones fotosintéticos osciló entre 38.0-45.7 µM m-2s-1. El fotoperíodo fue de aproximadamente 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad.
Efecto de la densidad de inóculo
Para determinar el efecto de la densidad de inóculo sobre la respuesta morfológica y fisiológica de los brotes en los SIT se analizaron tres densidades de inóculo: 6, 12 y 18 explantes por SIT.
Posteriormente, se realizaron renovaciones de medio de cultivo, cada 15 días hasta los 30 días de cultivo (Figura 1).
A los 30 días de cultivo, se determinaron indicadores morfológicos y fisiológicos.
Indicadores morfológicos: se cuantificó el número de nuevos brotes y hojas expandidas por explante. Además, se midió la longitud del brote principal (cm) desde la base hasta el punto de inserción de la primera hoja.
Indicadores fisiológicos: contenido de agua (%) y de pigmentos fotosintéticos (clorofilas a, b y totales).
Para determinar el contenido de agua se tomaron 20 explantes con hojas abiertas por cada tratamiento, que se obtuvieron por multiplicación in vitro en los SIT. Se enjuagaron con agua destilada y se secaron con papel de filtro. Se determinó la masa fresca (g) (MF) de los brotes y posteriormente su masa seca (g) (MS). Para esto último se colocaron a 60 ºC durante 72 h hasta peso constante. El contenido de agua (%) se calculó mediante la fórmula descrita por Bandyopadhyay et al. (2004): CA%= (MF-MS)/MF*100. Para calcular el área foliar (dm2) se empleó la fórmula descrita por García-Ramírez et al. (2015).
El contenido de pigmentos fotosintéticos se determinó en tejido foliar. A partir del segundo par de hojas de los brotes multiplicados in vitro, se tomó una muestra de 100 mg de masa fresca obtenida después de triturar el tejido en nitrógeno líquido, con el empleo de morteros y pistilos preenfriados. Para la cuantificación se utilizó el protocolo descrito por Mahmood et al. (2012). Brevemente, 100 mg de tejido vegetal fueron homogenizados con 1.7 ml de acetona al 80%, disuelta con fosfato de sodio 2.5 µM (pH 7.8), se agitó en vortex durante 15 minutos y luego se centrifugó a 4 ºC por 15 minutos a 3 000 rpm. Posteriormente, se midió la absorbancia a 663 nm (clorofila a) y 646 nm (clorofila b) contra el blanco (1.0 ml de acetona al 80% en lugar del extracto). Para calcular el contenido de clorofilas totales (µg ml-1 g-1) se emplearon las fórmulas descritas por Porra (2002).
Procesamiento estadístico
Para el análisis estadístico de los datos experimentales se utilizó el programa SPSS ver. 18.0, para el sistema operativo Windows. Se empleó la prueba Tukey (p≤0.05) para todas las variables analizadas, previa comprobación de los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados demostraron que la densidad de inóculo afectó la morfología y fisiología de los brotes de B. vulgaris cultivados en SIT (Tabla 1).
Los brotes obtenidos en el tratamiento con 12 explantes alcanzaron una mayor longitud del brote principal, número de brotes y hojas expandidas por explante. De igual manera, en este tratamiento se obtuvieron los mayores valores en el área foliar y la masa seca por SIT. Además, el contenido de agua fue menor en los brotes respecto al tratamiento donde se empleó una densidad de inóculo de 18 explantes, sin la presencia de brotes hiperhídricos. Todos estos análisis indicaron una mejor respuesta morfológica de los brotes obtenidos en el tratamiento con 12 explantes, con diferencias significativas con respecto al resto de los tratamientos. Tales hallazgos revelan, que esta densidad de inóculo incrementa y desarrolla el crecimiento de los brotes durante la multiplicación in vitro en los SIT, debido posiblemente a una relación óptima entre el explante y el medio de cultivo, así como la aeración en los frascos (Jin et al., 2013).
En el tratamiento con menor densidad de inóculo (6 explantes/SIT) se alcanzaron los menores valores en las variables evaluadas. A los 30 días de cultivo se observaron brotes pequeños, con hojas enrolladas con una coloración de verde clara (código hex: #CCFFCC) a amarillo claro (código hex: #FFFFCC) (Figura 2). Es posible que estas afectaciones morfológicas pudieran estar determinada por la insuficiente densidad de inóculo, influenciado a su vez por el medio de cultivo y el ambiente in vitro. En este sentido, Rahman et al. (2015) refieren que la densidad de inóculo se encuentra estrechamente relacionada con la cantidad de nutrientes, la cual está influenciada por el volumen de medio de cultivo disponible por explante. Estas variables según Watt (2012), influyen directamente en la morfología y fisiología de las plantas cultivadas en los SIT.
En el tratamiento con 18 explantes por SIT se incrementó el contenido de agua en los brotes (92.129%), con una reducción significativa en el contenido de clorofilas totales (92.85 mg gMS-1) y la masa seca (0.090 g). Además, en este tratamiento los brotes mostraron una coloración verde clara (código hex: #CCFFCC), con hojas poco expandidas (Figura 2c) a diferencia del tratamiento con 12 explantes/SIT donde los brotes desarrollaron hojas expandidas con una coloración verde oscuro (código hex: #00CC33) (Figura 2b). Las variaciones morfo-fisiológicas observadas en los brotes de B. vulgaris, pudieran deberse a desórdenes fisiológicos y anatómicos inducidos por el alto contenido de agua en los brotes (van den Dries et al., 2013). Según Derwin et al. (2014) a medida que aumenta el contenido de agua en los espacios apoplásticos de los tejidos se induce una alteración fisiológica, lo cual provoca la formación de células deformadas, con ausencia de sistemas membranosos y cloroplastos deformados. Esto pudiera guardar relación con la coloración verde clara mostrada en los brotes con el menor contenido de clorofilas totales y masa seca alcanzado en el tratamiento de mayor densidad.
Al respecto, Cui et al. (2014) plantearon que la densidad de inóculo es un parámetro físico importante que influye en el crecimiento de las plantas in vitro. En este sentido, estos autores demostraron que las bajas densidades de inóculo podrían resultar en la subutilización de los SIT, mientras que altas podrían causar reducir el área foliar, contenido de masa seca y fresca, además del contenido de clorofila totales, dando como resultado plantas de menor calidad fisiológica.
De igual manera, Polzin et al. (2014) informaron un bajo desarrollo y crecimiento de los brotes de Dioscorea cayenensis-rotundata en SIT cuando emplearon una densidad de inóculos de 5 explantes/SIT. Al respecto, Pérez-Alonso et al. (2015) informaron que las bajas densidades de inóculo en los SIT provocaron una afectación en el desarrollo morfo-fisiológico de las plantas de Digitalis purpurea L.
Por otra parte, en los últimos años escasos trabajos científicos (Marulanda et al., 2005; Holst, 2010) hacen referencia al empleo de SIT para la multiplicación in vitro de bambúes, y a pesar de que la densidad de inóculo es una variable básica para establecer métodos de cultivo en SIT, se desconoce su efecto sobre el crecimiento y desarrollo de los brotes de bambú. En este sentido, los resultados de este trabajo permitirán optimizar las condiciones de cultivo in vitro y reducir los desórdenes fisiológicos, lo cual conducirá a un perfeccionamiento de los métodos de propagación in vitro de este cultivo.
Los resultados hasta aquí descritos permiten seleccionar la densidad de inóculo de 12 explantes/SIT como el mejor tratamiento para la multiplicación de los brotes de B. vulgaris en los SIT, con lo cual se logra un incremento del número de brotes (9.60 brote/explante) y la obtención de brotes de adecuada calidad morfo-fisiológica. Los estudios realizados resultan novedosos pues no fueron encontradas referencias en la literatura especializada para especies de bambúes. Esto puede abrir una nueva dimensión de oportunidad para futuras investigaciones y escalado a los laboratorios comerciales, para la propagación in vitro de bambúes.
CONCLUSIONES
La densidad de inóculo influye en la calidad morfo-fisiológica de plantas in vitro de B. vulgaris multiplicadas en SIT, por ello, debe ser ajustada en aras de optimizar las condiciones de cultivo para la propagación masiva de esta especie.
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Recibido: 08-09-2016
Aceptado: 20-10-2016
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