Artículo original

Biotecnología Vegetal Vol. 17, No. 1: 19 - 24, enero - marzo, 2017

Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.

eISSN 2074-8647, RNPS: 2154

Establecimiento in vitro de Zephyranthes spp.

In vitro establishment of Zephyranthes spp.

Diego Müller1, Pablo García Giménez1, AndrésTravacio2, Mirian Bueno1

1Cátedra de Biología, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario. CC14. Zavalla. Santa Fe. Argentina. CP S2125ZAA e-mail: diego.muller@unr.edu.ar

2Regional Agro Insumos SA, Corrientes 729 Piso 8, Oficina 807. Rosario. Santa Fe. Argentina. CP 2000


RESUMEN

Las plantas del género Zephyranthes son bulbosas, herbáceas y perennes, con gran valor ornamental, debido a que sus flores presentan gran variedad de tamaños y colores. El objetivo del presente trabajo fue establecer in vitro de Zephyranthes spp. a partir de semillas y bulbos como explantes iniciales. Las semillas se sumergieron durante 10 min en hipoclorito de sodio al 1.5%. En los bulbos se extrajeron las catáfilas exteriores y se cortaron en forma longitudinal en tantas secciones (SB) como fue posible. Se evaluaron tres métodos de desinfección: I. 1 min en etanol 90% y 20 min en hipoclorito de sodio al 1.5 %. II. 1 min en etanol 90% y tres tiempos de exposición, 10, 15 y 20 min en el fungicida Mancozeb (4 g l-1). Cada siete días se cuantificó el número de explantes contaminados con microorganismos y se calculó el porcentaje de contaminación microbiana después de 20 días de cultivo. En las semillas se cuantificó el número de semillas germinadas y se calculó el porcentaje de germinación fisiológica (protrusión de la raíz primaria) y formación de órganos. En los bulbos también se evaluó el desarrollo de brotes hasta los 20 días de cultivo. En las semillas la contaminación microbiana fue del 2% y la germinación del 95%. Se observó desarrollo de órganos tales como bulbos, raíces y hojas. Aunque se desarrollaron brotes, los métodos de desinfección de los bulbos no fueron efectivos por 100% de contaminación.

Palabras clave: desinfección, geófita, micropropagación, ornamental


ABSTRACT

The genus Zephyranthes plants bulbous, herbaceous and perennial, with great ornamental value, because their flowers have a great variety of sizes and colors. The objective of the present work was to in vitro establish of Zephyranthes spp. from seeds and bulbs as initial explants. The seeds were immersed for 10 min in 1.5% sodium hypochlorite. In the bulbs, the outer catheles were removed and cut longitudinally in as many sections (SB) as possible. Three methods of disinfection were evaluated: I. 1 min in ethanol 90% and 20 min in 1.5% sodium hypochlorite. II. 1 min in 90% ethanol and three exposure times, 10, 15 and 20 min in the fungicide Mancozeb (4 g l-1). Every seven days the number of explants contaminated with microorganisms was quantified and the percentage of microbial contamination was calculated after 20 days of culture. In the seeds, the number of germinated seeds was quantified and the percentage of physiological germination (protrusion of the primary root) and organ formation were calculated. Bulbs were also evaluated for shoot development up to 20 days of culture. In the seeds microbial contamination was 2% and germination 95%. Organs such as bulbs, roots and leaves were observed. Although shoot were developed, the methods of disinfecting the bulbs were not effective for 100% contamination.

Keywords: disinfection, geophyte, micropropagation, ornamental


INTRODUCCIÓN

La familia Amaryllidaceae J. St.-Hil, de distribución predominantemente pantropical, está representada por especies bulbosas bianuales o perennes (Dahlgren et al., 1985). Existen aproximadamente 860 especies distribuidas en 59 géneros (Meerow y Snijman, 1998). Se encuentran principalmente en el hemisferio sur, especialmente en África (19 géneros) y Sudamérica (28 géneros) (Meerow y Snijman, 1998). Ambas zonas se consideran centro de diversificación. El género Zephyranthes Herb. está incluido en la tribu Hippeastreae (Pax & Hoffmann) Hutch. (1931) (Meerow y Snijman, 2001) y comprende 90 especies, de las cuales 12 se distribuyen en Argentina. Se caracterizan por ser plantas bulbosas, herbáceas y perennes, con gran valor ornamental, debido a que sus flores presentan gran variedad de tamaños y colores.

La mayoría de las especies de Zephyranthes se propagan vegetativamente por medio de división de bulbos. Aunque este método es efectivo, puede llegar a ser muy lento ya que en algunas especies toma dos años o más hasta que la planta florece, como describe Mujib et al. (2014) para Zephyranthes rosea Lindl.

Mediante cultivo de tejidos también se han obtenido resultados en la propagación de especies de Zephyranthes. Los distintos tipos de explantes y los reguladores de crecimiento juegan un rol importante en la micropropagación, una de las aplicaciones más generalizadas. Las catáfilas con una sección del disco basal (catáfilas dobles) son ampliamente usadas (Zhang et al., 2013; Paredes et al., 2014). La organogénesis también se ha informado a partir de explantes como pequeñas secciones de catáfilas (Han et al., 2004), ápices (Shivakumar y Krishnamurthy, 2004) y cormos (Kamo et al., 2014). Los explantes de la sección inferior del bulbo y segmentos completos regeneraron vástagos en Zephyranthes grandiflora Lindl. (Gangopadhyay et al., 2010). La acción de los reguladores de crecimiento, particularmente bencilaminopurina (BAP) y ácido naftalenacético (ANA), en la inducción de vástagos fue informada en la micropropagación de otras especies bulbosas como Polianthes tuberosa L. (Dehdezi et al., 2014) y Fritillaria persica L. (Kizil y Khawar, 2014). Entre varios factores, las concentraciones de reguladores de crecimiento y sacarosa, afectan directamente el éxito en la bulbificación. Este hecho implica la transferencia de los explantes a medios de cultivos con diferentes combinaciones y concentraciones de reguladores a medida que se produce la regeneración de los órganos (Arulanandam et al., 2015; Malik y Bach, 2016).

La prevención de la contaminación microbiana en los estadios iniciales es el mayor reto en el cultivo de tejidos de bulbos y requiere de la aplicación de varios agentes desinfectantes (Smith et al., 1999). Diversos productos químicos se utilizan para desinfectar superficialmente los explantes. Con mayor frecuencia se emplea etanol (70% v/v) e hipoclorito de sodio (1-3%) y con menor frecuencia hipoclorito de calcio (6-12%) y bicloruro de mercurio (0.1-1.25%). Las concentraciones del desinfectante y el tiempo de exposición deben ser ajustados para cada especie y tipo de explante utilizado (Roca y Mroginsky, 1991).

Si bien es factible la regeneración de plantas a partir de técnicas de cultivo in vitro, el potencial regenerativo depende del genotipo, del explante empleado y de las condiciones de cultivo (Appezzato et al., 1999; Passos y Bernachi, 2005).

Debido a que el género estudiado es una geófita, el bulbo representa una fuente importante de explantes para su cultivo in vitro, además de las semillas u otras partes de la planta. Ya que su desinfección es un paso crucial para lograr el éxito en el establecimiento in vitro y, considerando que los bulbos están expuestos a una elevada carga microbiana por ser órganos de almacenamiento subterráneos, el objetivo del presente estudio fue establecer in vitro Zephyranthes spp. a partir de semillas y secciones de bulbos como explantes iniciales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se seleccionaron plantas de Zephyranthes spp. proveedoras de explantes de un lote experimental de la localidad de Funes, Santa Fe, Argentina (32° 54’ 57’’ S, 60° 48’ 29’’ O). El material vegetal se multiplicó en forma vegetativa en invernadero en la Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario. Para los ensayos se utilizaron como explantes semillas y bulbos.

Medio de cultivo

El medio de cultivo consistió en 4.4 g l-1 de la base salina propuesta por Murashige y Skoog (1962) (MS) con vitaminas de Gamborg et al. (1976) y 30 g l-1 de sacarosa. El pH se ajustó a 5.8 con hidróxido de sodio (NaOH) y ácido clorhídrico (HCl) y luego se solidificó con 8 g l-1 de agar-agar. Posteriormente, se esterilizó en autoclave por 20 minutos a 121 °C y 1 atm de presión.

Establecimiento in vitro a partir de semillas

Las semillas se sumergieron durante 10 min en hipoclorito de sodio al 1.5%, luego se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Posteriormente, se colocó una semilla por frasco de vidrio de 4 cm alto x 2 cm diámetro con 1 ml de medio de cultivo. Se emplearon 100 semillas.

A los 20 días de cultivo, las semillas germinadas, se transfirieron a tubos de 12 cm alto x 3 cm de diámetro con 4 ml de igual medio de cultivo.

Establecimiento in vitro a partir de bulbos

Los bulbos se lavaron con agua corriente, se extrajeron las catáfilas exteriores y, dependiendo del tamaño del bulbo, se cortaron en forma longitudinal en tantas secciones (SB) como fue posible. Siempre se mantuvo una porción del disco basal.

Se evaluaron tres métodos de desinfección: I. 1 min en etanol 90% y 20 min en hipoclorito de sodio al 1.5 %. II. 1 min en etanol 90% y tres tiempos de exposición, 10, 15 y 20 min en el fungicida Mancozeb (4 g l-1). Se enjuagaron tres veces con agua estéril. Se realizaron tres réplicas de 10 repeticiones por tratamiento, obtenidas a partir de 25 bulbos.

Condiciones de crecimiento

Los explantes se colocaron en cuarto de crecimiento a una intensidad lumínica de 60 µmol m-2 s-1, fotoperiodo de 16 horas diarias a 24 ± 2 °C.

Evaluaciones

Para ambos tipos de explante, cada siete días se cuantificó el número de explantes contaminados con microorganismos y se calculó el porcentaje de contaminación microbiana después de 20 días de cultivo. Esto se realizó por observación directa bajo lupa binocular y microscopio óptico (400x). Además, en las semillas se cuantificó el número de semillas germinadas y se calculó el porcentaje de germinación fisiológica (protrusión de la raíz primaria) y formación de órganos. Se consideró que la radícula había protruido de la semilla cuando alcanzaba una longitud aproximada de 3 mm (López, 1995). En los bulbos también se evaluó el desarrollo de brotes hasta los 20 días de cultivo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los métodos de desinfección empleados en las semillas fueron efectivos y permitieron el establecimiento in vitro de Zephyranthes spp. La incidencia de contaminantes microbianos en el total de semillas utilizado fue de 2%. La contaminación estuvo ocasionada por hongos de los géneros Aspergillus y Penicilium. Este resultado coincide con lo informado por Fernández et al. (2008) para la especie Zephyranthes filifolia Herb. ex Kraenzl.

Transcurrida una semana, se observó en el 95% de las semillas la protrusión de la radícula (Fig. 1 A). El porcentaje de germinación obtenido supera a los referidos por Rodrigo et al. (2006) en Rhodophiala bifida (Herb.) Traub (Amaryllidaceae) y se aproximan a los informados en esta misma especie por Echeverría y Alonso (2010) y Maritano et al. (2011).

Dentro de los 15 días posteriores a la germinación fisiológica se observó la producción de hojas desde el meristemo apical y un ligero ensanchamiento de la base del brote conjuntamente con la formación de raíces (Fig. 1 B). Tal como lo describe Mujica et al. (2008) en ajo (Allium sativum L.) y Him y Paez (1998) en jengibre (Zingiber officinale R.), esta respuesta pudo estar dada por la acumulación de fotoasimilados y nutrientes en las hojas, lo cual favorece el crecimiento y llenado del bulbo y contribuye a su engrosamiento.

La transferencia de las semillas germinadas a medio de cultivo fresco a los 20 días, permitió el desarrollo de bulbillos en la base de las plantas y en la sección inferior del tallo (Fig. 1 C). Fuentevilla (2004), en cultivo in vitro de Leucocoryne purpurea (Alliaceae), arribó a resultados similares excepto que realizó la transferencia de las plántulas a un medio de cultivo de bulbificación, el cual contiene la misma base salina (MS) pero el doble de concentración de sacarosa (60 g l-1). Los carbohidratos son la principal fuente energética y estructural en los vegetales. Considerando que los órganos de almacenamiento, tales como cormos, rizomas o bulbos, permiten a las plantas resistir periodos desfavorables a través de la acumulación de agua y otros nutrientes, se puede asumir que el suministro de carbohidratos al medio de cultivo induce la formación del bulbo y su posterior desarrollo. En las raíces de algunas pocas plantas se observó la proliferación de tejido calloso (Fig. 1 D).

Las plantas obtenidas por este método pueden ser utilizadas como plantas madre para la posterior producción de explantes libres de contaminantes microbianos.

La desinfección de los bulbos con los distintos agentes desinfectantes no permitió eliminar la carga microbiana inicial presente en los explantes. Debido a esto, aunque se observó desarrollo de brotes, su establecimiento in vitro no fue exitoso.

A los 20 días de cultivo de las SB se observó el desarrollo de brotes en el 1% del total de los explantes (Fig. 2 A), lo cual representa una prueba del potencial organogénico. El 10% se mantuvo viable, pero sin desarrollo de brotes (Fig. 2 B).

El total de los explantes presentaron contaminación por microorganismos. Ningún método de desinfección fue efectivo para controlar la contaminación por hongos del suelo (Fig. 2 C y D). En concordancia con estos resultados, Paredes et al. (2014) obtuvieron porcentajes elevados de contaminación microbiana en el cultivo in vitro de Traubia modesta (Amarillydaceae).

Teniendo en cuenta lo anterior, resulta necesario continuar los estudios para establecer un protocolo de desinfección eficaz para eliminar la contaminación fúngica en bulbos de Zephyranthes spp. De esta manera se podría emplear este tipo de material vegetal como explante inicial para el cultivo in vitro de la especie trabajada. En próximos trabajos pudiera incrementarse la concentración de hipoclorito de sodio según lo indicado por Navarro (2014) o utilizar bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno para la desinfección según lo propuesto por Castro y Londoño (2008).

CONCLUSIONES

Zephyranthes spp. se estableció a partir de semillas y se observó el desarrollo de órganos tales como bulbos, raíces y hojas. Sin embargo, aunque se formaron órganos a partir de las secciones de bulbos, la contaminación microbiana afectó al 100% de los explantes.

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Recibido: 16-11-2016

Aceptado: 25-01-2017

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