Protocolo

Biotecnología Vegetal Vol. 17, No. 4: 236 - 247, octubre - diciembre, 2017

Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.

eISSN 2074-8647, RNPS: 2154

 

Protocolo para la propagación in vitro de Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’

 

Protocol for in vitro propagation of Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’

 

 

Yenisey Gutierrez1, Maryluz Folgueras1, Arletys Santos1, Jorge López1, Damicela Reinaldo1, Marisel Bauta1, Greisy López1, Yelenys Alvarado-Capó2

1Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales. Apdo 6. Santo Domingo. Villa Clara. Cuba. CP 53 100. e-mail: contam.biotec@inivit.cu

2Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: yelenys@ibp.co.cu

 

 


RESUMEN

El establecimiento in vitro de malanga (Xanthosoma y Colocasia) a partir de material vegetal procedente de campo ha sido una de las vías para iniciar su propagación in vitro. Para ello se han empleado diferentes tipos de explantes y métodos. Este trabajo persiguió como objetivo presentar un protocolo para la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’. Se incluyen procedimientos para el establecimiento in vitro a partir de yemas axilares de rizomas primarios de plantas cultivadas en campo y de yemas axilares de plantas propagadas en campo que se modificaron para disminuir el impacto de la contaminación bacteriana. Además, se presenta un procedimiento para la detección visual de contaminantes bacterianos y alternativas para la propagación in vitro de este cultivar.

Palabras clave: contaminación bacteriana, malanga, meristemos


ABSTRACT

The in vitro establishment of malanga (Xanthosoma and Colocasia) from plant material cultivated in the field has been one of the ways to initiate the in vitro propagation. For this purpose different types of explants and methods have been used. The objective of this work was to present a protocol for the in vitro propagation of C. esculenta cv. 'INIVIT MC-2012'. Procedures are included for in vitro establishment from axillary buds of primary rhizomes of field-grown plants and axillary buds from field propagated plants that were modified to decrease the impact of bacterial contamination. In addition, a procedure for the visual detection of bacterial contaminants and alternatives for the in vitro propagation of this cultivar is presented.

Keywords: bacterial contamination, taro, meristems


 

 

INTRODUCCIÓN

El establecimiento in vitro de malanga (Xanthosoma y Colocasia) a partir de material vegetal procedente de campo ha sido una de las vías para iniciar su propagación in vitro.

García et al. (1999) propusieron el empleo de yemas axilares de rizomas primarios de plantas cultivadas en campo de los cuales posteriormente se extraen meristemos. También como alternativa, Gálvez et al. (2013) refirieron el establecimiento in vitro de malanga cv. ‘INIVIT MC-2001’ a partir de yemas axilares de plantas propagadas en campo. Además, se cuenta con una norma ramal (NRAG 205:11) para la propagación de este cultivo (NRAG, 2011).

Varias modificaciones de ambos métodos han sido realizadas para la propagación de diferentes cultivares. En este sentido, el cultivar ‘INIVIT MC-2012’, ha sido objeto de estudio y se han ensayado diferentes tipos de explantes (Santos et al., 2015), medios de cultivo (Santos et al., 2017), además de la aplicación práctica de otros aspectos desarrollados para diferentes cultivares. Sin embargo, no se cuenta con un documento que los integre.

Por otra parte, en la propagación in vitro de malanga (Xanthosoma y Colocasia) varios autores han descrito la presencia de contaminantes bacterianos que limitan su propagación a escala comercial (Carrazana et al., 2011; Vilchez et al., 2011). El cultivar ‘INIVIT MC-2012’ no es una excepción y se ha observado una alta incidencia de dichos contaminantes (Gutierrez et al., 2015).

Una de las estrategias para el manejo de los contaminantes microbianos incluye la aplicación de métodos de detección temprana (Alvarado-Capó, 2003). Para el cultivo in vitro de malanga, autores como García et al. (1999) propusieron el uso del método de siembra de fragmentos de tejido vegetal en medios de cultivo bacteriológico con el empleo de secciones de la parte basal (González et al., 1997) y Santos et al. (2005) emplearon agua de coco y extracto de levadura en el medio de cultivo de las plantas para similar fin. No obstante, existen diversos criterios a la hora de hacer la detección visual de contaminantes bacterianos de forma rutinaria en la propagación in vitro de este cultivo.

Para reunir en un solo documento todo lo relativo a la propagación in vitro de este cultivar mediante los métodos propuestos, los cuales se modificaron para disminuir el impacto de la contaminación bacteriana, se presenta el siguiente protocolo. Se incluye además, un procedimiento para la detección visual de contaminantes bacterianos.

 

PROCEDIMIENTOS

I. Detección visual de contaminantes bacterianos en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’

Materiales

Material vegetal

-​ Meristemos o yemas axilares establecidos in vitro, plantas in vitro en fase de multiplicación o enraizamiento.

Otros materiales

-​ Agua destilada estéril

-​ Cubreobjetos

-​ Lámpara fluorescente

-​ Portaobjetos

Equipos e instrumental

-​ Microscopio óptico

Precauciones y medidas de seguridad

Evitar el contacto directo de la piel o mucosas con los cultivos microbianos. Emplear guantes. Lavarse las manos al concluir el ensayo. Descontaminar los recipientes de cultivo contaminados en autoclave durante al menos 40 minutos y lavarlos separados de los no contaminados.

Procedimiento

-​ Colocar los recipientes de cultivo contra una lámpara fluorescente y observar cambios de color, transparencia o consistencia en el medio de cultivo o crecimiento microbiano sobre el medio de cultivo.

-​ En la fase de establecimiento in vitro comparar el recipiente de cultivo (tubo de ensayo) con medio de cultivo líquido y explante con uno similar sin explante. Detectar la presencia de turbidez, sedimento o mucosidad. Se puede colocar por detrás del recipiente a la altura del medio de cultivo un aditamento metálico fino (por ejemplo, alambre de un asa de siembra) que facilite la comparación.

-​ En las fases de multiplicación y enraizamiento in vitro detectar la presencia de opacidad o halos debajo de la base del explante o crecimiento sobre el medio de cultivo (Figura 1).

-​ Descartar los recipientes de cultivo con presencia de turbidez, opacidad, cambio de color, halos debajo de la base del explante o crecimiento sobre el medio de cultivo.

-​ Comprobar la presencia de contaminantes bacterianos por observación directa en el microscopio óptico (400 y 1000x) en preparaciones frescas con agua destilada estéril.

-​ Hacer registro de número de explantes contaminados por línea y subcultivo. Registrar también la presencia de otros grupos microbianos (hongos filamentosos o levaduras). Calcular el porcentaje de contaminación por línea y subcultivo con respecto al número inicial de explantes en el subcultivo que se trate.

II. Establecimiento in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ mediante el método propuesto por García et al. (1999) modificado

Materiales

Material vegetal

-​ Rizomas primarios de plantas crecidas durante 12 meses en campo, con las características típicas del cultivar y adecuado desarrollo, que no presenten síntomas de enfermedades ni presencia de plagas. Rizomas primarios sin daños mecánicos, por insectos, ni síntomas de pudriciones secas, con masa fresca entre 400-500 g, cosechados después de al menos tres días sin lluvia o riego.

Medio de cultivo (líquido)

-​ 80% de las sales y vitaminas Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962), 30 g l-1 de sacarosa, 0.1 mg l-1 de 6-bencilaminopurina (6-BAP), 0.1 g l-1 de mio-inositol, 0.05 mg l-1 de ácido indol acético (AIA), pH ajustado a 5.7 con NaOH 0.5 N y/o HCl 0.5 N antes de la esterilización en autoclave (García et al., 1999 modificado por Santos et al., 2017).

Otros materiales

-​ Agua corriente

-​ Agua destilada estéril

-​ Cepillo de lavar

-​ Detergente comercial

-​ NaOCl

-​ Recipientes para la manipulación del material vegetal (placas Petri, platos metálicos)

-​ Tubos de ensayo (145.0 mm x 25.0 mm)

-​ Vaso de precipitado de 500 o 1000 m

Equipos e instrumental

-​ Aditamento metálico para extracción de yemas axilares

-​ Bisturíes

-​ Cabina de flujo laminar

-​ Esterilizador eléctrico

-​ Microscopio óptico

-​ Pinzas

Precauciones y medidas de seguridad

Para todo el trabajo en cabina de flujo laminar debe emplearse vestuario, protector de cabello y tapaboca limpios y de uso exclusivo para esa área. Las manos deben protegerse con guantes. Las pinzas y bisturíes después de colocadas en el esterilizador eléctrico alcanzan altas temperaturas y existe riesgo de quemadura. Evitar el contacto de la piel y la inhalación de vapores de las soluciones de hipoclorito de sodio que pueden causar quemaduras e irritación, respectivamente.

Procedimiento

-​ Cosechar rizomas primarios de plantas de 12 meses de cultivo con al menos tres días sin lluvia.

-​ Lavar con agua corriente y un cepillo para eliminar todo resto de suelo.

-​ Colocar en lugar fresco y seco, protegido de la luz directa del sol por 72 h.

-​ Seleccionar las yemas axilares más grandes y con ayuda de un aditamento metálico proceder a su extracción (Figura 2 a-d).

-​ Reducir el tamaño de las yemas hasta 1.0-2.0 cm mediante cortes longitudinales y trasversales en los bordes de la base y eliminar el tejido que las recubre (Figura 2 e-g).

-​ Lavar tres veces con agua corriente y detergente comercial.

-​ Trasladar a cabina de flujo laminar y sumergir en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5% (v/v), durante 20 minutos.

-​ Eliminar el desinfectante por decantación y enjuagar con agua desionizada estéril tres veces.

-​  Extraer meristemos (0.3-0.5 mm) o yemas (0.3-0.5 cm) con empleo de un microscopio estereoscópico con aumento de 100x y escala micrométrica auxiliar (Figura 2 h).

-​ Colocar los explantes (meristemos o yemas) de forma individual por cada tubo de ensayo (145.0 mm x 25.0 mm) con 10 ml de medio de cultivo líquido para establecimiento in vitro de C. esculenta (García et al., 1999 modificado por Santos et al., 2017).

-​ Identificar cada tubo de ensayo con un número que identificará la línea hasta el tercer subcultivo de multiplicación.

-​ Mantener por 18 días en cámara de crecimiento a 26±2 °C, con luz continua blanca fluorescente (150 μmol m-2 s-1) y fotoperíodo 16 horas luz.

-​ Realizar observación visual detallada contra una fuente de luz para detectar la presencia de contaminantes bacterianos en el medio de cultivo según Protocolo para la detección visual de contaminantes bacterianos. Descartar los explantes contaminados.

-​ Transferir a medio de cultivo fresco de igual composición y se colocaron por similar período en las mismas condiciones.

III. Establecimiento in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ mediante el método propuesto por Gálvez et al. (2013) modificado

Materiales

Material vegetal

-​ Rizomas primarios de plantas crecidas durante 2-6 meses en campo o 2-6 meses en casa de cultivo con las características típicas del cultivar y adecuado desarrollo, que no presenten síntomas de enfermedades ni presencia de plagas. Rizomas primarios sin daños mecánicos, por insectos, ni síntomas de pudriciones secas, cosechados después de al menos tres días sin lluvia o riego.

Medio de cultivo (líquido)

-​ 80% de las sales y vitaminas Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962), 30 g l-1 de sacarosa, 0.1 mg l-1 de 6-bencilaminopurina (6-BAP), 0.1 g l-1 de mio-inositol, 0.05 mg l-1 de ácido indol acético (AIA), pH ajustado a 5.7 con NaOH 0.5 N y/o HCl 0.5 N antes de la esterilización en autoclave (García et al., 1999, modificado por Santos et al., 2017).

Otros materiales

-​ Agua corriente

-​ Agua destilada estéril

-​ Cepillo de lavar

-​ Detergente comercial

-​ NaOCl

-​ Recipientes para la manipulación del material vegetal (placas Petri, platos metálicos)

-​ Tubos de ensayo (145.0 mm x 25.0 mm)

-​ Vaso de precipitado de 500 o 1000 ml

Equipos e instrumental

-​ Bisturíes

-​ Cabina de flujo laminar

-​ Esterilizador eléctrico

-​ Microscopio óptico

-​ Pinzas

Precauciones y medidas de seguridad

Para todo el trabajo en cabina de flujo laminar debe emplearse vestuario, protector de cabello y tapaboca limpios y de uso exclusivo para esa área. Las manos deben protegerse con guantes. Las pinzas y bisturíes después de colocadas en el esterilizador eléctrico alcanzan altas temperaturas y existe riesgo de quemadura. Evitar el contacto de la piel y la inhalación de vapores de las soluciones de hipoclorito de sodio que pueden causar quemaduras e irritación, respectivamente

Procedimiento

-​ Seleccionar rizomas primarios de plantas jóvenes (2-6 meses de cultivo).

-​ Eliminar sus hojas y raíces (Figura 3 a).

-​ Reducir su tamaño hasta 15 cm de altura (dejando 4 cm de diámetro y 5 cm de altura de tejido del rizoma) (Figura 3 b)

-​ Lavar tres veces con agua corriente y detergente comercial.

-​ Eliminar las hojas externas y extraer yemas axilares de 0.5-0.8 cm con la ayuda de un bisturí (Figura 3 c).

-​ Trasladar las yemas a cabina de flujo laminar y sumergir en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5% (v/v), durante 15 minutos.

-​ Eliminar el desinfectante por decantación y enjuagar con agua desionizada estéril tres veces.

-​ Extraer meristemos (0.3-0.5 mm) y yemas (0.3-0.5 cm) con el empleo de un microscopio estereoscópico con aumento de 100x y escala micrométrica auxiliar (Figura 3 d).

-​ Colocar los explantes individuales (meristemos o yemas) en cada tubo de ensayo (145.0 mm x 25.0 mm) con 10 ml de medio de cultivo líquido para establecimiento in vitro de C. esculenta (García et al., 1999, modificado por Santos et al., 2017).

-​ Identificar cada tubo de ensayo con un número que identificará la línea hasta el tercer subcultivo de multiplicación.

-​ Mantener por 18 días en cámara de crecimiento a 26±2 °C, con luz continua blanca fluorescente (150 μmol m-2 s-1) y fotoperiodo 16 horas luz.

-​ Realizar observación visual detallada contra una fuente de luz para detectar la presencia de contaminantes bacterianos en el medio de cultivo según Protocolo para la detección visual de contaminantes bacterianos. Descartar los explantes contaminados.

-​ Transferir a medio de cultivo fresco de igual composición y colocar por similar periodo en las mismas condiciones.

IV. Multiplicación y el enraizamiento in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’

Materiales

Material vegetal

-​ Procedente de la fase de establecimiento para la fase de multiplicación: plantas in vitro libres de contaminantes microbianos visibles, con altura mayor de 8 mm, al menos una yema axilar que permita su posterior multiplicación y coloración verde.

-​ Procedente de la fase de multiplicación para la fase de enraizamiento: plantas in vitro libres de contaminantes microbianos visibles, con 20 - 30 mm de altura y de 2 - 3 hojas.

Medios de cultivo

-​ Medio de cultivo semisólido para la multiplicación in vitro: sales y vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962), 30 g l-1 de sacarosa; 3 mg l-1 de 6-BAP; 1 mg l-1 de ácido indol acético (AIA), 0.1 g l-1 de mio-inositol, pH 5.7, solidificado con 6.5 g l-1 de Agar E (BIOCEN) (García et al., 1999).

-​ Medio de cultivo semisólido para el enraizamiento in vitro: 50% de las sales y vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962), 15 g l-1 de sacarosa, 1 mg l-1 de ácido indol butírico (AIB), solidificado con 6.5 g l-1 de Agar E (BIOCEN), pH 5.7 según García et al. (1999).

Otros materiales:

-​ Recipientes para la manipulación del material vegetal (placas Petri, platos metálicos)

-​ Tubos de ensayo (145.0 mm x 25.0 mm)

Equipos e instrumental

-​ Bisturíes

-​ Cabina de flujo laminar

-​ Esterilizador eléctrico

-​ Pinzas

Precauciones y medidas de seguridad

Para todo el trabajo en cabina de flujo laminar debe emplearse vestuario, protector de cabello y tapaboca limpios y de uso exclusivo para esa área. Las manos deben protegerse con guantes. Las pinzas y bisturíes después de colocadas en el esterilizador eléctrico alcanzan altas temperaturas y existe riesgo de quemadura.

Procedimiento

IV.1 Multiplicación

-​ Realizar observación visual detallada contra una fuente de luz fluorescente para detectar la presencia de contaminantes bacterianos en el medio de cultivo debajo de la base del explante según Protocolo para la detección visual de contaminantes bacterianos (I). Descartar los explantes contaminados.

-​ Extraer los explantes de los tubos de ensayo y colocar en recipiente para su manipulación (placa Petri, plato metálico). Manipular un tubo cada vez y mantener la numeración por líneas hasta el 3rer subcultivo. Posteriormente, si se continúa la fase de multiplicación se pueden formar lotes con el material vegetal de varias líneas.

-​ Individualizar los brotes con la ayuda de pinzas y bisturíes estériles.

-​ Eliminar de los explantes el tejido muerto, seco o fenolizado con cortes en la base y bordes laterales del explante.

-​ Decapitar los explantes, eliminar la parte foliar y cuidar no dañar el meristemo.

-​ Cambiar de juego de instrumental cada vez que se trabaje con un tubo nuevo.

-​ Transferir a medio de cultivo de multiplicación semisólido en tubos de ensayo (150.0 mm x 30.0 mm) con 15 ml de medio de cultivo y un explante por recipiente de cultivo.

-​ Colocar los explantes en cámara de crecimiento a 26±2 °C, con luz continua blanca fluorescente (150 μmol m-2 s-1) y fotoperíodo 16 horas luz.

-​ Realizar observación visual detallada contra una fuente de luz para detectar la presencia de contaminantes bacterianos en el medio de cultivo debajo de la base del explante según Protocolo para la detección visual de contaminantes bacterianos (I). Descartar los explantes contaminados.

-​ Realizar subcultivos cada 18 días de forma similar a lo descrito anteriormente cuando los explantes deben tener varios brotes (Figura 4).

IV.2 Enraizamiento

-​ Realizar observación visual detallada contra una fuente de luz para detectar la presencia de contaminantes bacterianos en el medio de cultivo debajo de la base del explante según Protocolo para la detección visual de contaminantes bacterianos (I). Descartar los explantes contaminados.

-​ Extraer los explantes de los recipientes de cultivo y colocar en recipiente para su manipulación (placa Petri, plato metálico). Manipular un recipiente cada vez.

-​ Eliminar de los explantes el tejido muerto, seco o fenolizado.

-​ Individualizar los brotes con la ayuda de pinzas y bisturíes estériles. Cambiar de juego de instrumental cada vez que se trabaje con un recipiente nuevo.

-​ Clasificar los explantes por altura (menores de 1 cm, de 1-2 cm y mayores de 2 cm).

-​ Transferir a medio de cultivo de enraizamiento semisólido.

-​ Colocar los explantes en cámara de crecimiento a 26±2 °C, con luz continua blanca fluorescente (150 μmol m-2 s-1) y fotoperíodo 16 horas luz durante 21 días.

-​ Transferir a la fase de aclimatización.

Consideraciones finales

A partir de los procedimientos anteriores se pueden conformar varias alternativas para la propagación in vitro de C. esculenta ‘INIVIT MC-2012’ (Figura 5).

CONCLUSIONES

La propagación de C esculenta cv. INIVIT-2012 a partir de materiales vegetal de campo puede efectuarse por dos procedimientos que reducen el tamaño del explante y contribuyen a disminuir la incidencia de contaminantes bacterianos.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo forma parte de la tesis de maestría “Estrategia para el manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ del programa de maestría en Biotecnología vegetal del Instituto de Biotecnología de las Plantas.

 

REFERENCIAS

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García M, Mederos V, Rodríguez S, López J, Ventura J, Cabrera M, Hernández R, González JE, Bermúdez D, Gálvez D, Gutiérrez V, Gálvez JR (1999) Generalización de la metodología para la micropropagación de la malanga (Xanthosoma spp.) en Cuba. En: Alvarado-Capó Y, Gregorio O (eds) 5to coloquio internacional de Biotecnología vegetal, Santa Clara, 16-19/junio/1999, pp. 167-169. IBP, Santa Clara; ISBN: 959-7122-03-0

González R, Borras O, Morales M (1997) Introducción de una metodología para el control de las contaminaciones en el cultivo de tejidos de plantas en biofábricas y laboratorios de investigaciones. BIOVEG’97 Centro de Bioplanta, Ciego de Ávila

Gutierrez Y, Torres Y, Robaina A, Bauta M, Rayas A, Santos A, Basail M, López J, Mederos V, Beovides Y, Rodríguez D (2015) Incidencia de contaminantes microbianos en la propagación in vitro de Xathosoma spp. clon ‘INIVIT MX-2007’ y Colocasia esculenta (L.) Schott. clon ‘INIVIT MC-2012’. Biotecnología Vegetal 15(3): 157 - 161

NRAG (2011) NRAG 205:11 Norma Ramal de la Agricultura, Biotecnología, Propagación in vitro de la malanga (Colocasia esculenta y Xanthosoma spp.) Especificaciones. MINAG, La Habana

Santos A, López J, Basail M, Gutiérrez Y, Rayas A, Medero V, Rodríguez D, Rodríguez D, Beovides Y, Reinaldo D, Bauta M (2017) Efecto de 6-BAP y AIA en el establecimiento in vitro de meristemos de Colocasia esculenta (L.) Schott cv. ‘INIVIT MC 2012’. Biotecnología Vegetal 17(1): 67 – 70

Vilchez J, Albany N, Martínez L, Molina M, Alvarez C, Leal E, Bermúdez L (2011) Establecimiento in vitro de ocumo blanco (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott). Rev Fac Agron (LUZ) 28 Supl 1: 434-444

 

 

Recibido: 18-09-2017

Aceptado: 06-11-2017



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