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Artículo original
Biotecnología Vegetal Vol. 19, No. 2: 139 - 146, abril - junio, 2019
Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.
eISSN 2074-8647, RNPS: 2154
Efecto del uso combinado de dos citoquininas en la multiplicación y regeneración de yemas adventicias de banano cv. ‘Gros Michel’ (Musa AAA)
Effect of the combined use of two cytokinins in the multiplication and regeneration of adventitious banana buds cv. ‘Gros Michel’ (Musa AAA)
Idalmis Bermúdez-Caraballoso1*, Mayelín Rodríguez Urquiza1, Maritza Reyes Vega1, Alejandro Jiménez Padrón2
1Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830.
2Facultad de Ciencias Agrícolas, Departamento de Biología Aplicada, Universidad de Cienfuegos Carlos Rafael Rodríguez. Carretera a Rodas km 4 Cuatro Caminos. Cienfuegos. Cienfuegos. Cuba. CP 55100.
*Autora para correspondencia e-mail: idalmis@ibp.co.cu
RESUMEN
En los programas de mejoramiento genético es importante contar con un sistema de regeneración de plantas eficiente. En el cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA) resulta difícil la obtención de yemas adventicias debido a la alta dominancia apical. La presente investigación se desarrolló con el objetivo de determinar el efecto de las citoquininas en la multiplicación y regeneración de yemas adventicias en dicho cultivar. Se establecieron tres tratamientos 6-BAP y TDZ combinados y cada uno de ellos por separado. Se emplearon secciones de 0.4 mm2 de yemas adventicias con un subcultivo de multiplicación. Cada 30 días se cuantificó el número de yemas adventicias y brotes formados por explante. Posteriormente, se colocaron en un medio de cultivo libre de reguladores del crecimiento y a los 30 días se evaluó el porcentaje de brotes regenerados por explante, la altura del brote y el número de hojas emitidas. Los resultados demostraron que con cuatro subcultivos en un medio de cultivo con 6-BAP (2.0 mg l-1) y TDZ (1.0 mg l-1) se forman entre 1.5 y 8.0 yemas adventicias por explante con 92% de regeneración y altura superior a 2.0 cm, sin mostrar evidencias de cambios fenotípicos. Todo lo anterior confirma que la utilización de estas dos citoquininas combinadas a concentraciones más bajas y en un menor número de subcultivos brinda mayores posibilidades para la formación de yemas adventicias, su multiplicación y posterior regeneración lo cual posibilitará su empleo en los Programas de Mejora Genética de bananos.
Palabras clave: mejora genética, reguladores del crecimiento, tidiazuron
ABSTRACT
In breeding programs it is important to have an efficient plants regeneration system. In the cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA) it is difficult to obtain adventitious buds due to high apical dominance. The present investigation was developed with the objective of determining the effect of cytokinins on the multiplication and regeneration of adventitious buds in that cultivar. Three treatments were established with the combination of 6-BAP and TDZ and each of them separately. Sections of 0.4 mm2 of adventitious buds with one multiplication subculture were used. The number of adventitious buds and shoots formed by explant was quantified every 30 days. Subsequently, it were placed in a culture medium free of growth regulators and after 30 days the percentage of shoots regenerated by explant, the height of the shoot and the number of leaves emitted were evaluated. The results showed that with four subcultures in a culture medium with 6-BAP (2.0 mg l-1) and TDZ (1.0 mg l-1) were achieved 1.5 to 8.0 adventitious buds per explant with 92% regeneration and height greater than 2.0 cm without showing evidence of phenotypic changes. All of the above confirms that the use of these two cytokinins combined at lower concentrations and in a smaller number of subcultures provides greater possibilities for the adventitious buds formation, their multiplication and subsequent regeneration which will enable their use in the Genetic Improvement Programs of bananas.
Keywords:genetic improvement, growth regulators, thidiazuron
INTRODUCCIÓN
Los bananos (incluidos los plátanos y los bananos de cocción) son la fruta que más se produce en el mundo. En el 2018 se produjeron 148 millones de toneladas en 135 países y constituye una fuente de alimento y sustento para más de 400 millones de personas (Dusunceli, 2017). Las áreas de cultivo y producción se han incrementado progresivamente (FAO, 2018).
Por otro lado, a inicios del pasado siglo la industria y cultivo del banano experimentó una drástica reducción debido a la enfermedad conocida como Marchitez por Fusarium en bananos, ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) raza 1 y 2 y mucho más dramática recientemente con el avance de la raza Tropical de Foc (RT4) que afecta a más del 80% de los cultivares de Musa (Bubici et al., 2019) .
En los programas de mejoramiento genético es importante contar con un sistema de regeneración de plantas eficiente, que permita que las células mutadas o modificadas genéticamente puedan desarrollarse y regenerar plantas que manifiesten las características deseadas (Sinha et al., 2018). En la mayoría de estos programas se utilizan estructuras multicelulares, lo cual provoca la aparición de quimeras que constituye una limitante. La obtención de explantes que se formen a partir de una o pocas células como los embriones somáticos y yemas adventicias resulta de suma importancia (García et al., 2006).
El banano es uno de los cultivos que más intensamente se ha micropropagado, sin embargo una gran cantidad de sus cultivares necesitan ser evaluados in vitro antes de iniciar un programa de propagación masiva o de mejoramiento genético (Wijerathna y Kumarihami, 2016).
En Musa se ha desarrollado el cultivo de ápices por la vía de organogénesis directa a través de yemas axilares o adventicias (Kulkarni et al., 2007) con el empleo de diferentes citoquininas, pero se ha determinado que la tasa de multiplicación y de regeneración de las yemas se ve afectada significativamente por el tipo y concentración del regulador del crecimiento, el número de subcultivos así como el cultivar con el que se esté trabajando (Arinaitwe et al., 2000).
La citoquinina más comúnmente utilizada ha sido 6-Bencilaminopurina (6-BAP) (Kulkarni et al., 2007). Otros autores han empleado tidiazuron (TDZ) para inducir un mayor número de brotes. Sin embargo a altas concentraciones pueden inhibir su elongación y aumentar la aparición de plantas fuera de tipo o anormales (Bairu et al., 2008). Otros autores las han utilizado de manera combinada (Liu et al., 2017) pero demostraron que la respuesta dependía de la constitución genómica del cultivar objeto de estudio.
Hasta el momento, no se ha referido el uso combinado de estas citoquininas en la obtención de yemas adventicias, ni se ha descrito su efecto en la multiplicación y regeneración en plantas a partir de estas en el cultivar ‘Gros Michel’. Por esta razón, la presente investigación tuvo como objetivo determinar el efecto de la combinación de citoquininas en la multiplicación y regeneración de yemas adventicias de banano cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron ápices de plantas del cultivar ‘Gros Michel’ crecidas en condiciones de campo, obtenidos de hijos tipo espada con una altura aproximada de 50 a 100 cm que fueron establecidos de acuerdo con la metodología propuesta por Orellana (1995).
Para la obtención de las yemas adventicias se colocaron brotes seccionados de 0.4 mm2 provenientes de la fase de establecimiento in vitro, en los tres medios de cultivo que se describen y en lo adelante serán los tratamientos establecidos.
Multiplicación de las yemas adventicias
Con el objetivo de determinar la influencia del número de subcultivos en la multiplicación in vitro de yemas adventicias del cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA), se utilizaron dichas estructuras provenientes del primer subcultivo de multiplicación in vitro.
Se establecieron tres tratamientos:
Tratamiento 1: Medio de cultivo de formación de yemas adventicias, constituido por las sales y vitaminas Murashige y Skoog (1962) (MS) al 100% y sacarosa (30 g l-1), ácido ascórbico (10 mg l-1), ácido indol acético (AIA) (0.2 mg l-1), 6-BAP (2.0 mg l-1) y TDZ (1.0 mg l-1), pH 5.8 y solidificado con Gelrite (MERCK) (2.0 g l-1), según Bermúdez-Caraballoso et al. (2017) en estudios previos en este cultivar de banano.
Tratamiento 2: Medio de cultivo P4 compuesto por Sales y vitaminas MS, sacarosa (30 g l-1), mio-inositol (100 mg l-1), ácido ascórbico (10 mg l-1), AIA (0.17 mg l -1), 6-BAP (22.5 mg l-1), pH 5.8 y se utilizó Phytagel (SIGMA) 2.2 g l-1 como agente gelificante, según Schoofs et al. (1998) comúnmente utilizado para la formación de yemas adventicias en Musa.
Tratamiento 3: Medio de cultivo compuesto por Sales y vitaminas MS, sacarosa (30 g l-1), mio-inositol (100 mg l-1), ácido ascórbico (10 mg l-1), AIA (0.17 mg l-1), TDZ (2.0 mg l-1), pH 5.8 y se utilizó Phytagel (SIGMA) 2.2 g l -1 como agente gelificante, según Nahamya (2000) comúnmente utilizado para la formación de yemas adventicias en Musa.
Por cada tratamiento se emplearon cinco frascos de vidrio de 250 ml de volumen total con 30 ml de medio de cultivo cada uno y se colocaron cinco explantes por frasco para un total de 25 explantes por tratamiento. Los subcultivos se realizaron cada 30 días, y se evaluó el número de yemas adventicias y el número de brotes formados por explante.
Las condiciones de cultivo del material vegetal fueron cámaras de cultivo de luz solar con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos que osciló entre 48.0-62.5 µmol m-2 s-1 y 27±2 °C.
Regeneración de brotes a partir de las yemas adventicias
Con los resultados obtenidos en el experimento anterior relacionados con el efecto del número de subcultivos en la multiplicación de las yemas adventicias, se colocaron dichas estructuras en un medio de cultivo libre de reguladores del crecimiento, que contenía: Sales MS 4.3 g l-1, tiamina 1.0 mg l-1 y sacarosa 20 g l-1 (García et al., 2006).
Se utilizaron cinco frascos de cultivo con cinco explantes cada uno para un total de 25 explantes por tratamiento. Las condiciones de cultivo fueron similares al experimento anterior.
A los 30 días de cultivo se cuantificó el número de hojas emitidas por brote, el número de brotes regenerados por yema adventicia y se calculó el porcentaje de regeneración, se midió la altura del brote (cm) desde la base del pseudotallo hasta la primera hoja totalmente expandida y se describió la presencia de variaciones fenotípicas. Para describir el color del follaje, se utilizó el código hexadecimal de colores (http: www.cwp.linet.edu/cwis/cwp.html).
Análisis estadísticos
El diseño experimental empleado fue completamente aleatorizado. El procesamiento estadístico de los datos experimentales se realizó con la ayuda del Paquete estadístico Statistic Packaged for Social Science (SPSS) versión 18.0 para Windows (Microsoft). Al no cumplirse los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza de los datos se utilizaron las pruebas H de Kruskal-Wallis y U de Mann Whitney con un nivel de significación para p≤0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Multiplicación de las yemas adventicias
Se pudo comprobar que en el tratamiento donde se combinó 6-BAP y TDZ, el número de yemas adventicias aumentó desde el primer hasta el cuarto subcultivo (Figura 1 A). Sin embargo, la formación de brotes por explante disminuyó (Figura 1 B), lo cual resultó muy favorable teniendo en cuenta que este tipo de material vegetal por su origen unicelular, es muy útil en los programas de mejoramiento genético. Ambas citoquininas suprimieron la dominancia apical y se favoreció la multiplicación de yemas adventicias. A partir del cuarto subcultivo los valores de estas variables no mostraron diferencias entre los tratamientos utilizados por lo que se decidió seleccionar este para aplicar cuando los objetivos de las investigaciones sean la obtención de yemas adventicias.
Resultados similares obtuvieron Liu et al. (2017) al estudiar la capacidad de formación de yemas adventicias de cinco cultivares de Musa con diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento. Estos autores, al combinar Bencilaminopurina con tidiazuron en cuatro subcultivos, lograron los mayores porcentajes de yemas adventicias por explante.
En el caso del número de brotes por explante, en todos los subcultivos los tratamientos 1 (6-BAP (2.0 mg l-1 y TDZ 1.0 mg l-1) y 2 (6-BAP 22.5 mg l-1) no mostraron diferencias significativas entre ellos pero sí respecto al tratamiento 3 donde se utilizó el TDZ como único regulador del crecimiento, mostrando este último los valores mayores para esta variable.
Figura 1. Efecto del número de subcultivos en la formación de yemas adventicias (A) y brotes por explante (B) ‘Gros Michel’ (Musa AAA). Tratamiento 1: 2.0 mg l-1 de 6-BAP + 1.0 mg l-1 de TDZ, Tratamiento 2: 22.5 mg l-1 de 6-BAP, Tratamiento 3: 2.0 mg l-1 de TDZ
Según los resultados de la presente investigación la multiplicación de yemas adventicias fue mayor con el empleo de la combinación de 2.0 mg l-1 de 6-BAP + 1.0 mg l-1 de TDZ (tratamiento 1), y con 22.5 mg l-1 de 6-BAP (tratamiento 2) en cuatro subcultivos con valores entre 1.5 y 8.0 yemas adventicias por explante y con una considerable reducción del número de brotes. Además, se emplearon menores concentraciones de ambos reguladores del crecimiento cuando se usaron combinados con respecto a su uso de forma individual. La utilización conjunta de ambas citoquininas indujo mayor multiplicación de las yemas adventicias, lo cual sugiere un efecto sinérgico y aditivo de ambos, siendo muy ventajoso para reducir la variación somaclonal y lograr la posterior regeneración de plantas (Sadik et al., 2015).
Al respecto, Sadik (2013), refirió que el efecto negativo de emplear yemas adventicias para regenerar plantas de bananos del este de África (EA-AAA) en Programas de Mejora Genética ha estado en la necesidad de utilizar más de siete subcultivos. Estos resultados pueden atribuirse a la constitución genómica de los cultivares (el porcentaje del genoma B), la dominancia apical in vitro y el número de subcultivos en el medio de cultivo de multiplicación necesarios para sobreponer la dominancia apical. Cultivares con genoma BB y ABB tienen una baja dominancia y en relativamente bajas concentraciones de citoquininas pueden multiplicarse eficazmente, mientras que los cultivares AAA requieren hasta nueve subcultivos antes de que la dominancia apical se elimine (INIBAP, 1996).Teniendo en cuenta estos antecedentes, con los resultados que se obtuvieron se logró disminuir la concentración de la citoquinina y reducir el tiempo para la obtención de las yemas adventicias a cuatro subcultivos en un cultivar donde predomina el genoma acuminata, como es el caso del cv. ‘Gros Michel’ (AAA).
Además, es importante tener en cuenta que períodos largos de cultivo in vitro, con altas concentraciones de reguladores del crecimiento, puede ser una de las causas de variación somaclonal. La edad del cultivo aumenta la variabilidad entre las plantas regeneradas pues las condiciones del cultivo in vitro y la rápida multiplicación de un tejido afecta su estabilidad genética (Leela et al., 2003). Este mismo fenómeno también se ha observado tanto en plátanos como en bananos (El-Dougdoug et al., 2007).
Regeneración de brotes a partir de las yemas adventicias
A los 30 días de cultivo más del 90% de las yemas adventicias obtenidas en el cuarto subcultivo de multiplicación, regeneraron plantas. El porcentaje de regeneración cuando se emplearon ambas citoquininas (6-BAP y TDZ) fue del 92% mientras que los tratamientos controles donde se usaron ambas por separado fue inferior (Figura 2).
Figura 2. Porcentaje de explantes que regeneraron brotes in vitro a partir de yemas adventicias obtenidas con la combinación de 2.0 mg l-1 de 6-BAP y 1.0 mg l-1 de TDZ en un medio de cultivo libre de reguladores del crecimiento, a los 30 días de cultivo. Tratamiento 1: 2.0 mg l -1 de 6-BAP + 1.0 mg l-1 de TDZ, Tratamiento 2: 22.5 mg l-1 de 6-BAP, Tratamiento 3: 2.0 mg l-1 de TDZ
Se ha demostrado que altas concentraciones del TDZ puede afectar el desarrollo de los explantes durante el enraizamiento (Wijerathna y Kumarihami et al., 2016) y que altas concentraciones de 6-BAP logran bajos porcentajes de brotes regenerados (García et al., 2006).
Con este resultado se demostró el uso potencial de ambos reguladores del crecimiento para la multiplicación de yemas adventicias, lo cual permite obtener en breves períodos de tiempo dichas estructuras sin afectar su posterior regeneración.
Al analizar el número de brotes por explante y el número de hojas por brote se pudo apreciar que no existieron diferencias significativas entre los tratamientos estudiados. En el caso de la variable altura del brote, el tratamiento 1 (2.0 mg l-1 de 6-BAP + 1.0 mg l-1 de TDZ) alcanzó los valores mayores con respecto a ambos controles (Tabla 1). Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Manjula et al. (2015) quienes demostraron que altos niveles de citoquininas y entre ellas TDZ retardan la elongación de las yemas adventicias.
En todos los tratamientos, el 100% de las plantas regeneradas presentaron altura ≥ 3.0 cm (desde la base del pseudotallo hasta el punto de inserción de la última hoja completamente expandida), dos o más hojas completamente desarrolladas, diámetro del pseudotallo mayor de 0.4 cm, color del follaje verde (#008000) y más de tres raíces emitidas (Figura 3).
Tabla 1. Efecto del medio de cultivo libre de reguladores del crecimiento en la altura de brotes de banano cv. ‘Gros Michel’ (Musa AAA) regenerados a partir de yemas adventicias a los 30 días de cultivo in vitro.
Figura 3. Plantas de banano cv. ‘Gros Michel’ (Musa AAA) regeneradas a partir de yemas adventicias en un medio de cultivo libre de reguladores del crecimiento en A) 2.0 mg l-1 de 6-BAP + 1.0 mg l-1 de TDZ, B) 22.5 mg l-1 de 6-BAP, C) 2.0 mg l-1 de TDZ.
En la presente investigación en el cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA) con las concentraciones de citoquininas empleadas, a pesar de ser altas en los tratamientos 2 (22.5 mg l-1 de 6-BAP) y 3 (2.0 mg l-1 de TDZ) no se encontraron plantas fuera de tipo. Al respecto, en la literatura científica consultada se refiere que altas concentraciones de reguladores del crecimiento inducen la regeneración de brotes fuera de tipo, pues el efecto de los reguladores del crecimiento vegetal sobre los tejidos posee un efecto aditivo (Sadik et al., 2015). Por otro lado, el aumento del número de subcultivos con una elevada concentración de citoquinina produce yemas adventicias y brotes fuera de tipo en Musa spp. (Cedeño-García et al., 2016).
Otros autores, como Bairu et al. (2008) al emplear altas concentraciones de 6-BAP en bananos, encontraron una inhibición del crecimiento de las yemas, lo cual provocó la aparición de plantas fuera de tipo en forma de roseta. En este aspecto hay numerosos informes los cuales muestran las diferencias de usar altos niveles de citoquininas que produce efectos negativos en la regeneración de plantas (Shirani et al., 2009).
Todo lo anterior confirma que la utilización de bajas concentraciones de reguladores del crecimiento y en un menor número de subcultivos brinda mayores posibilidades para la formación de yemas adventicias, su multiplicación y posterior regeneración lo cual posibilitará su empleo en los Programas de Mejora Genética.
CONCLUSIONES
El empleo combinado de 6-BAP (2.0 mg l-1) y TDZ (1.0 mg l-1) durante la fase de multiplicación de yemas adventicias de banano cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA) permite obtener entre 1.5 y 8 yemas adventicias por explante hasta el cuarto subcultivo de multiplicación. Además, se logra la regeneración de un 92% de los explantes, con una altura superior a 2.0 cm sin mostrar evidencias de cambios fenotípicos.
Conflicto de interés
Los autores no declaran conflicto de intereses.
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Recibido: 11-02-2019
Aceptado:03-04-2019
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