Artículo original

Biotecnología Vegetal Vol. 19, No. 2: 147-152, abril - junio, 2019

Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.

eISSN 2074-8647, RNPS: 2154

Manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de yemas axilares de Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’

 

Bacterial contamination management on in vitro propagation of axillary buds of Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’

 

 

Yenisey Gutierrez1*, Mariluz Folgueiras1, Arletys Santos1, Jorge López1, Víctor Medero1, Damisela Reinaldo1, Yelenys Alvarado-Capó2

1Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales. Apdo 6. Santo Domingo. Villa Clara. Cuba.

2Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830.

*Autora para correspondencia e-mail: contam.biotec@inivit.cu

 

RESUMEN

La propagación in vitro de Colocasia esculenta se limita por la presencia de contaminantes microbianos, especialmente bacterias. El objetivo de este trabajo fue demostrar que la inclusión de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ a partir de explantes de campo, puede reducir las pérdidas. Se comparó la incidencia de contaminantes bacterianos en las fases de establecimiento y multiplicación con el empleo de dos protocolos de propagación in vitro. Uno modificó al otro con acciones para el manejo de la contaminación bacteriana. En cada protocolo se partió de 20 rizomas primarios de los que se extrajeron al menos dos yemas axilares y de cada una se estableció una línea. En cada subcultivo se cuantificó el número de explantes contaminados con bacterias. La contaminación bacteriana se observó en el medio de cultivo debajo de los explantes o alrededor de estos lo que apunta al explante inicial como fuente primaria de contaminación. Con la aplicación del protocolo modificado se redujo el porcentaje de pérdidas por contaminación bacteriana en todos los subcultivos evaluados. En el establecimiento in vitro no rebasó el 5%. La combinación de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana entre las que se encuentran la reducción del tamaño del explante, el trabajo por líneas y la detección visual de contaminantes previo al subcultivo del material vegetal reduce la presencia de contaminantes bacterianos en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’.

Palabras clave: explante, detección contaminantes, malanga

ABSTRACT

La propagación in vitro de Colocasia esculenta se limita por la presencia de contaminantes microbianos, especialmente bacterias. El objetivo de este trabajo fue demostrar que la inclusión de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ a partir de explantes de campo, puede reducir las pérdidas. Se comparó la incidencia de contaminantes bacterianos en las fases de establecimiento y multiplicación con el empleo de dos protocolos de propagación in vitro. Uno modificó al otro con acciones para el manejo de la contaminación bacteriana. En cada protocolo se partió de 20 rizomas primarios de los que se extrajeron al menos dos yemas axilares y de cada una se estableció una línea. En cada subcultivo se cuantificó el número de explantes contaminados con bacterias. La contaminación bacteriana se observó en el medio de cultivo debajo de los explantes o alrededor de estos lo que apunta al explante inicial como fuente primaria de contaminación. Con la aplicación del protocolo modificado se redujo el porcentaje de pérdidas por contaminación bacteriana en todos los subcultivos evaluados. En el establecimiento in vitrono rebasó el 5%. La combinación de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana entre las que se encuentran la reducción del tamaño del explante, el trabajo por líneas y la detección visual de contaminantes previo al subcultivo del material vegetal reduce la presencia de contaminantes bacterianos en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’.

Keywords: contaminant detection, explant, taro

 

INTRODUCCIÓN

La propagación in vitro de malanga (Colocasia o Xanthosoma) tiene gran importancia económica ya que permite proveer de semilla de alta calidad genética y sanitaria a los productores. Generalmente el material vegetal inicial son yemas axilares o ápices meristemáticos (Yam et al., 1990; García et al., 1999; Rodríguez et al., 2003; Verma y Cho, 2010; Nath et al., 2012; Medero et al., 2016). Sin embargo, las técnicas de propagación in vitro han tenido limitaciones debido a la contaminación microbiana, principalmente por bacterias (Hernández et al., 2005; Folgueras, 2006; Carrazana et al., 2011; Vilchez et al., 2011; Hossain, 2012; Santos et al., 2015).

Estos contaminantes causan pérdidas económicas en las industrias de cultivo de tejidos vegetales. Unido a ello, la manipulación incorrecta del material vegetal y un medio ambiente no estéril aumentan la tasa de contaminación microbiana (Leelavathy y Sankar, 2016; Orlikowska et al., 2017).

En este contexto, para reducir las pérdidas por la presencia de contaminantes bacterianos en el cultivo in vitro de malanga se han referido diferentes estrategias. Entre ellas se menciona el cultivo de las plantas madre en un sustrato estéril (Keolanui et al., 1993), el uso de antibióticos (Rodríguez et al., 2003), la aplicación de electroterapia (Vilchez et al., 2011) o no eliminar las plantas contaminadas con bacterias (Carrazana et al., 2011). Otros autores como Santos et al. (2015) comprobaron que el empleo de meristemos disminuye su incidencia. Sin embargo, también se ha considerado que la aplicación de medidas para la prevención y el manejo de la contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas suelen ser más efectivas, duraderas y económicas (Leifert et al., 1994; Leifert y Cassells, 2001; Alvarado-Capó, 2003). Este enfoque no ha sido empleado de forma rutinaria en la propagación in vitro de malanga.

Atendiendo a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue demostrar que la inclusión de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ a partir de explantes de campo, puede reducir las pérdidas por este concepto.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se emplearon rizomas primarios de Colocasia esculenta (L.) Schott cv. ‘INIVIT MC-2012’, proveniente del Banco de Germoplasma del INIVIT donde se siguieron las indicaciones del Instructivo Técnico de la Malanga (MINAG, 2012) para las atenciones agronómicas. Los rizomas cumplían con las características fenotípicas de los descriptores de la especie y cultivar (Medero et al., 2014), no presentaban síntomas visuales de enfermedades y fueron cosechados después de 12 meses de cultivo en campo (Figura 1).

Figura 1. Plantas (a) y rizomas (b,c) de Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’.

Se comparó la incidencia de contaminantes bacterianos en las fases de establecimiento y multiplicación de C. esculenta con el empleo de dos protocolos de propagación in vitro a partir de rizomas primarios de plantas cultivadas en campo.

El primero, propuesto por García et al. (1999) y el segundo, este mismo protocolo modificado por Gutierrez et al. (2017) que incluye pasos en el procedimiento para el manejo de la contaminación bacteriana.

Para cada protocolo se partió de 20 rizomas primarios de los cuales se extrajeron al menos dos yemas axilares. De cada una se estableció una línea que se conformó por todos los explantes que se derivaron de ella y que se manejaron en cada subcultivo separados de otras líneas.

Los subcultivos se realizaron cada 18 días en cámara de crecimiento a 26±2 °C, con luz continua blanca fluorescente (150 μmol m-2 s-1) y fotoperíodo 16 horas luz (Medero et al., 2015).

En cada subcultivo (establecimiento y tres subcultivos de multiplicación) se cuantificó el número de explantes contaminados con bacterias (por observación visual de los recipientes de cultivo y comprobación de la presencia del grupo microbiano en observaciones directas al microscopio óptico, 400x y 1000x). Se calculó el porcentaje de contaminación bacteriana con respecto al total de explantes al inicio del subcultivo. Todos los explantes contaminados se eliminaron del proceso.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La contaminación bacteriana se observó en el medio de cultivo debajo de los explantes o alrededor de estos lo que coincidió con descripciones previas en el cultivo in vitro de malanga (Carrazana et al., 2011; Gutierrez et al., 2015). De forma general, los caracteres culturales del crecimiento bacteriano fueron similares en todos los explantes de una misma línea lo que apunta al explante inicial como fuente primaria de contaminación.

Con la aplicación del protocolo para la propagación in vitro de C. esculenta a partir de rizomas de plantas cultivadas en campo (García et al., 1999) modificado por Gutierrez et al. (2017) se redujo el porcentaje de pérdidas por contaminación bacteriana en todos los subcultivos evaluados (Figura 2), con cero contaminantes visibles en los dos primeros de multiplicación. Este protocolo incluye como aspectos esenciales para el manejo de la contaminación bacteriana la reducción del tamaño del explante (empleo de yemas axilares de 0.3-0.5 cm), el cultivo individual de los explantes en la fase de establecimiento in vitro en tubos de ensayo con un explante en cada uno, un protocolo para la detección visual de contaminantes bacterianos previo a cada subcultivo, el trabajo por líneas a partir de cada explante inicial hasta el tercer subcultivo de multiplicación, medidas de asepsia y procedimientos para el uso del instrumental y la capacitación del personal en la temática contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas.

Figura 2. Incidencia de contaminación bacteriana en el establecimiento y multiplicación in vitro de yemas axilares de Colocasia esculenta INIVIT MC-2012 con el empleo de dos protocolos de propagación. E establecimiento, M multiplicación, P protocolo de propagación, P1 García et al. (1999), P2 García et al. (1999) modificado por Gutierrez et al. (2017).

Aunque en este trabajo se emplearon explantes iniciales procedentes de campo la contaminación bacteriana no rebasó el 5% en el establecimiento in vitro. La reducción del tamaño del explante inicial es una de las modificaciones que se introdujeron en el protocolo propuesto por García et al. (1999) y que contribuyó a que disminuyeran las pérdidas en más de un 20%. En este cultivar, Santos et al. (2015) demostraron que la utilización de meristemos extraídos de rizomas brotados en zeolita reduce la incidencia de contaminantes. Sin embargo, el porcentaje de regeneración de plantas a partir de meristemos en muchas ocasiones es limitado. La posibilidad de poder emplear yemas axilares de material vegetal diagnosticado como libre de virus, directo de campo, sin alta incidencia de contaminantes bacterianos, es una alternativa para la propagación de plantas in vitro (Rodríguez et al., 2003).

Por otra parte, la detección de contaminantes bacterianos previo al subcultivo de los explantes con un protocolo definido y el entrenamiento del personal contribuye a que solo se manipulen explantes libres de contaminantes microbianos visibles. Esta es una práctica sencilla que no requiere gastos adicionales y garantiza que no se disemine la contaminación con el instrumental durante la manipulación de los explantes.

De igual forma, el trabajo por líneas aseguró que los explantes de diferente origen no se mezclaran. Con ello se garantizó la trazabilidad del material vegetal. Aunque pudieran parecer engorrosas las operaciones de manipulación de los explantes por líneas hasta el tercer subcultivo este procedimiento permite manejar mejor la contaminación bacteriana. En este sentido, pueden ser descartadas las líneas contaminadas o separar las que ya hayan presentado explantes contaminados (en el caso en que no se manifieste crecimiento bacteriano en todos los explantes de la línea a la misma vez, asociado al explante inicial), eliminarlas del proceso o definir otra estrategia productiva como por ejemplo, formar un solo lote con esas líneas, no continuar multiplicándolas sino transferirlas a la fase de enraizamiento para llevarlas a la fase de aclimatización.

En el tercer subcultivo de multiplicación, después de dos sin presencia de contaminantes bacterianos en la propagación con el protocolo modificado por Gutierrez et al. (2017), nuevamente se observó contaminación bacteriana aunque en 73.4% menos que con el protocolo original. La aparición de contaminantes bacterianos en la fase de multiplicación y su incremento con el número de subcultivos ha sido mencionada por otros autores en diferentes cultivos y se asocia a la presencia de contaminantes endógenos (Leifert et al., 1994; Carrazana et al., 2011; Santos et al., 2015; Orlikowska et al., 2017). En tal sentido, Carrazana et al. (2011) determinaron el carácter endófito de las bacterias en el cultivo in vitro de malanga Xanthosoma cv. ‘México 08’.

Los resultados demostraron la importancia de considerar en la propagación in vitro procedimientos de manejo de la contaminación bacteriana que faciliten la toma de decisiones, eviten la mezcla de explantes contaminados y no contaminados en un mismo recipiente de cultivo y la diseminación de los microrganismos. En este contexto el entrenamiento al personal es determinante.

 

CONCLUSIONES

La combinación de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana entre las que se encuentran la reducción del tamaño del explante, el trabajo por líneas y la detección visual de contaminantes previo al subcultivo del material vegetal reduce la presencia de contaminantes bacterianos en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo forma parte de la tesis de maestría “Estrategia para el manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ del programa de maestría en Biotecnología vegetal del Instituto de Biotecnología de las Plantas.Los autores agradecen la contribución de todo el personal que labora en el cultivo in vitro de malanga en el INIVIT.

 

Conflicto de interés

Los autores no declaran conflictos de intereses.

 

REFERENCIAS

Alvarado-Capó Y (2003) Incidencia, identificación y estrategias para la prevención y el control de contaminantes bacterianos en el cultivo in vitro de la caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido). Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Santa Clara, Cuba

Carrazana D, Santos A, Alderete Y, Gálvez D, Cupull R, Navarro M (2011) Bacteria endófita latente no vitropatógena en el cultivo in vitro de Xanthosoma sagittifolium (L. Schot). Centro Agrícola 38(4): 21-29

Folgueras M (2006) La contaminación microbiana en la micropropagación in vitro de las raíces y tubérculos tropicales. Centro agrícola 33(2): 91

García M, Mederos V, Rodríguez S, López J, Ventura J, Cabrera M, Hernández R, González JE, Bermúdez D, Gálvez D, Gutiérrez V, Gálvez JR (1999) Generalización de la metodología para la micropropagación de la malanga (Xanthosoma spp.) en Cuba. En: IBP (ed). Libro de reportes cortos del 5to coloquio internacional de Biotecnología vegetal, pp. 167-169. IBP, Santa Clara

Gutierrez Y, Torres Y, Robaina A, Bauta M, Rayas A, Santos A, Basail M, López J, Mederos V, Beovides Y, Rodríguez D (2015) Incidencia de contaminantes microbianos en la propagación in vitro de Xathosoma spp. clon INIVIT MX-2007 y Colocasia esculenta (L.) Schott. clon INIVIT MC-2012. Biotecnología Vegetal 15(3): 157-161

Gutierrez Y, Folgueras M, Santos A, López J, Reinaldo D, Bauta M, López G, Alvarado-Capó Y (2017) Protocolo para la propagación in vitro de Colocasia esculenta cv. INIVIT MC-2012. Biotecnología Vegetal 17 (4): 236 - 247

Hernández R, Lugo Y, González J, González Y, Rojas X, Herrera L (2005) Detección de microorganismos contaminantes del cultivo in vitro de la malanga. Centro Agrícola 32(1): 41-44

Hossain MJ (2012) In vitro organogenesis of Colocasia esculenta cv. antiquorum L.American Journal of Plant Sciences 3: 709-713

Keolanui R, Sanxter S, Hollyer JR (1993) Handbook for Commercial-Scale Taro (Colocasia esculenta) Tissue Culture in Hawaii. Hawaii Institute of Tropical Agriculture and Human Resources, Honolulu

Leelavathy S, Sankar PD (2016) Curbing the Menace of Contamination in Plant Tissue Culture. Journal of pure and applied microbiology 10(3): 2145-2152

Leifert C, Morris C, Waites W (1994) Ecology of microbial saprophytes and pathogens in tissue culture and field grown plants: reason for contamination problems in vitro. Critical Reviews in Plant Sciences 13: 139-183

Medero V, Rodríguez S, Basail M, Santos A, Rayas A, López J, Beovides Y, Rodríguez D, Torres M, Robaina A, Caballero W, Cruz J, Bravo Y, Pons C (2014) Clon de malanga Colocasia INIVIT MC- 2012, Registro de Variedades Comerciales No 02/2014. Centro Nacional de Sanidad Vegetal Ministerio de la Agricultura, Cuba

Medero V, Basail M, Moreno O, Santos A, Rayas A, López J, Beovides Y, Rodríguez S, Ramos JL, Caballero W, Gutiérrez Y, Rodríguez D, Pons C, Rodríguez D (2015) Impacto de la Biotecnología en la producción de semilla de raíces y tubérculos tropicales. Memorias del III Simposio Internacional de raíces, rizomas, tubérculos, plátanos, bananos y papaya. INIVIT, Santo Domingo; ISBN: 978-959-295-011-5

Medero V, Basail M, Moreno O, Santos A, Rayas A, López J, Beovides Y, Rodríguez S, Maza N, Caballero W, Gutierrez Y, Rodríguez D, Pons C, Rodríguez D, Medero M (2016) Empleo de la biotecnología para la producción de semilla categorizada en malanga. Rev Agricultura Tropical 2 (1): 52-60

MINAG (2012) Ministerio de la Agricultura, Instructivo Técnico para la producción de semillas de viandas. INIVIT-FAO, La Habana

Nath VS, Sankar MS, Hegde VM, Jeeva ML, Misra RS, Veena SS (2012) A Simple and Efficient protocol for rapid regeneration and propagation of taro (Colocasia esculenta (L.) Schott.) in vitro from apical meristems. International Journal of Plant Developmental Biology 6 (1): 64-66

Orlikowska T, Nowak K, Reed B (2017) Bacteria in the plant tissue culture environment. Plant Cell Tiss Organ Cult 128:487–508; doi:10.1007/s11240-016-1144-9

Santos A, López J, Basail M, Gutiérrez Y, Rayas A, Medero V, Rodríguez D, Rodríguez D, Beovides Y, Reinaldo D, Bauta M (2015) Incremento de la eficiencia en el establecimiento in vitro de la malanga INIVIT MC-2012 (Colocasia esculenta (L.) Schott.). Revista Agricultura Tropical 1(1):70-74

Rodríguez A, Quintero S, Rodríguez A, Fundora Z (2003) Establecimiento in vitro de ápices de malanga (Xanthosoma sagittifolium Schoott). Cultivos Tropicales 24(3): 19-22

Verma VM, Cho JJ (2010) Plantlet development through somatic embryogenesis and organogenesis in plant cell cultures of Colocasia esculenta (L.) Schott. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 18 (1): 167-170

Vilchez J, Albany N, Martínez L, Molina M, Alvarez C, Leal E, Bermúdez L (2011) Establecimiento in vitro de ocumo blanco (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott). Rev Fac Agron (LUZ) 28 (1): 434-444

Yam TW, Young JLP, Fan KPL, Arditti J (1990) Induction of callus from axillary buds of taro ( Colocasia esculenta var. esculenta, Araceae) and subsequent plant regeneration. Plant Cell Reports 9: 459-462

 

Recibido: 20-01-2019

Aceptado: 06-03-2019



Copyright (c) 2019 Biotecnología Vegetal

Biotecnología Vegetal eISSN 2074-8647, RNPS: 2154. ISSN 1609-1841, RNPS: 0397 Editada por: Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba CP 54 830 Tel: 53 42200124, e-mail: info@ibp.co.cu

Licencia Creative Commons
Biotecnología Vegetal está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial 4.0 Internacional.