Artículo original

Biotecnología Vegetal Vol. 19, No. 4: 249 - 257, octubre - diciembre, 2019

Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.

eISSN 2074-8647, RNPS: 2154

 

Obtención de perfiles genéticos de plantas de Stevia rebaudiana Bertoni propagadas mediante cultivo in vitro y corte de esquejes

 

Obtaining genetic profiles of Stevia rebaudiana Bertoni plants propagated by in vitro culture and cuttings

 

Dionys González-Hernández1,2*, Elizabeth Kairúz Hernández-Díaz1,2, Alina Capote1, Anabel Pérez1, Leonardo Rivero1, Borys Chong-Pérez1,3, Naivy Pérez-Alonso1

1 Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830.

2 Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830.

3 Sociedad de Investigación y Servicios BioTECNOS Ltda. Camino a Pangal km 2,5. San Javier. Linares. Chile. CP 3660000.

*Autor para correspondencia e-mail: dionys@uclv.cu

 

 

RESUMEN

Stevia rebaudiana Bertoni es una especie reconocida a nivel mundial por sus propiedades medicinales. El objetivo de este trabajo fue obtener perfiles genéticos de plantas cultivadas in vitro y otras propagadas mediante corte de esquejes para detectar polimorfismos genéticos. Para ello, primero se evaluaron dos protocolos de extracción de ADN, ambos con modificaciones. Las muestras purificadas se utilizaron para la amplificación aleatoria de ADN polimórfico con seis pares de cebadores. A partir de los patrones de bandas, se confeccionó una matriz de datos y se calculó la similitud y la distancia genética entre ambos grupos de plantas. Solo fue posible obtener ADN genómico cuando se aplicó el protocolo propuesto por Doyle y Doyle con modificaciones. De los seis cebadores empleados, solo uno fue efectivo para la amplificación de segmentos de ADN de esta especie. El protocolo de purificación propuesto es rápido, simple y eficiente. Se recomienda para la extracción de muestras ADN en la especie en la implementación de otras técnicas para el estudio de la variabilidad genética y la detección de variaciones somaclonales en S. rebaudiana .

Palabras clave: ADN, distancia genética, polimorfismos, protocolo de purificación, RAPD

ABSTRACT

Stevia rebaudiana Bertoni is worldwide known for its medicinal properties. The objective of this work was to obtain genetic profiles of in vitro grown plants or propagated by cuttings to detect genetic polymorphisms. For this, two DNA extraction protocols were first evaluated, both with modifications. The purified samples were used for random amplification of polymorphic DNA with six pairs of primers. A matrix of data was made from the band patterns. The similarity and genetic distance between both groups of plants were calculated. Genomic DNA was obtained only when the modified protocol proposed by Doyle and Doyle was applied. One of the six primers used was effective for the amplification of DNA segments. In this work, we provide a fast, simple and efficient DNA purification protocol for S. rebaudiana leaf samples. This might be applied for the study of genetic variability and the detection of somaclonal variations using other PCR-based techniques.

Keywords: DNA, extraction protocol, genetic profile, polymorphisms, RAPD

 

 

INTRODUCCIÓN

Stevia rebaudiana es una especie que crece preferiblemente en zonas subtropicales, en Paraguay, Kenya, China y Estados Unidos. Sin embargo, su progresiva demanda la ha convertido en un importante renglón comercial a nivel mundial (Gantait et al., 2014). Las plantas de Stevia contienen una compleja mezcla de glucósidos naturales diterpénicos dulces (glucósidos de esteviol) con un poder endulzante de más de 200 veces que la sacarosa. Estos constituyen una alternativa viable para pacientes con enfermedades del metabolismo de los carbohidratos, como la Diabetes mellitus (Gantait et al., 2017).

El cultivo in vitro como método de propagación de esta especie destaca sobre la reproducción convencional, debido a que permite obtener mayor cantidad de plantas (Shahid et al., 2014). Sin embargo, el cultivo de tejidos puede generar variaciones somaclonales. La identificación de estas variaciones en estadios tempranos, así como la disminución de su frecuencia de aparición, son elementos primordiales para el control de la calidad durante el desarrollo de cualquier protocolo de propagación de plantas in vitro (Krishna et al., 2016).

Para estudiar la variación genética existente entre individuos, se emplean marcadores moleculares; segmentos de ADN utilizados para obtener información sobre la variación alélica y distinguir así a los individuos. La Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico (RAPD, por sus siglas del inglés), es una técnica que emplea marcadores moleculares, y que ha sido utilizada con éxito para detectar polimorfismos genéticos, identificar variaciones somaclonales en individuos obtenidos por cultivo in vitro , y generar perfiles genéticos de diversas especies (Chattopadhyay et al., 2008; Sharma et al., 2016; Yadav et al., 2017).

Para estos propósitos, la extracción de material genético limpio, libre de macromoléculas celulares (polisacáridos, fenoles, proteínas y ARN) constituye el paso fundamental en cualquier técnica molecular que tenga como objetivo la caracterización genética (Velázquez et al., 2014).

El presente estudio se realizó con el objetivo de obtener perfiles genéticos de plantas de Stevia rebaudiana , que pueden ser aplicados en la detección de polimorfismos genéticos resultantes de la incidencia de variaciones somaclonales. Para ello, primero se evaluaron dos protocolos de extracción de ADN genómico a partir de hojas de plantas cultivadas in vitro y plantas propagadas mediante corte de esquejes. Luego, se aplicó la técnica de RAPD y se analizaron los patrones electroforéticos resultantes para la comparación de ambos grupos.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se emplearon hojas de dos grupos de plantas de S. rebaudiana crecidas en casa de cultivo. El primer grupo provenía del manejo tradicional mediante corte de esquejes realizado a las plantas del Banco de Germoplasma del Instituto de Biotecnología de las Plantas, Villa Clara, Cuba. Consistía en esquejes que se encontraban a los 60 días de crecimiento luego de la implementación de dicho manejo.

El segundo grupo de plantas provenía del cultivo in vitro . Estas habían sido obtenidas mediante el protocolo propuesto por González-Hernández et al. (2019) y contaban con igual período de tiempo desde su establecimiento en casa de cultivo. Ambos grupos se mantuvieron en sustrato orgánico a base de compost de cachaza y se les realizó manejo cultural basado en saneamiento de plagas, fertilización y riego, limpieza de malezas y aplicación de fungicidas.

Evaluación de protocolos de extracción de ADN

Para la extracción del ADN, se evaluaron dos protocolos: uno presentado por Doyle y Doyle (1990) y otro propuesto por Khayat et al . (2004), ambos con modificaciones.

En el primero, se tomaron 200 mg de tejido vegetal y se trituraron con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Se adicionó 1 ml de tampón de extracción compuesto por 4% (m/v) CTAB (cetil-trimetil bromuro de amonio), 10 mM Tris–HCl/pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA (ácido etilén-diamino-tetracético), 2% (m/v) PVP 10 000 10 mM mercaptoetanol y se homogenizó durante unos segundos. Las muestras fueron incubadas a 55 °C durante 30 min y posteriormente centrifugadas a 2 800 g y 4 °C, durante 5 min. Se colectó el sobrenadante y se le adicionó RNAsa (200 μg ml-1 de concentración final) por 15 min a 37 °C. El extracto fue mezclado con igual volumen de cloroformo y luego centrifugado en iguales condiciones. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y se adicionaron 700 μl de 2-isopropanol helado. Las muestras se mantuvieron toda la noche a -20 °C y posteriormente se centrifugaron a 13 500 g y 4 °C, durante 15 min. El precipitado resultante se lavó con 500 µl de etanol 70% (v/v), se centrifugó según las condiciones anteriormente mencionadas y fue secado en campana por 15 min. A continuación se resuspendió en 30 µl de agua desionizada.

En el segundo protocolo analizado, a 200 mg del material vegetal se adicionó 1 ml de tampón de extracción compuesto por 2% (m/v) CTAB, 10 mM Tris–HCl/pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 0.2% (m/v) 2-mercaptoetanol previamente calentado a 65 °C. Las muestras fueron incubadas a esa temperatura durante 30 min y mezcladas frecuentemente utilizando un vórtex. Luego se adicionó RNAsa (10 µg ml-1 de concentración final) y se incubaron por 15 min a 37 °C. Posteriormente se añadieron 700 µl de cloroformo, se mezcló y se procedió a centrifugar las muestras a 5 480 g durante 10 min a temperatura ambiente. Se transfirió la fase acuosa a tubos limpios y se repitió el paso anterior. Luego se le adicionaron 700 µl de isopropanol helado, y tras mezclarlo se mantuvo a -20 °C por 1 h. A continuación, se centrifugó a 11 180 g a temperatura ambiente, durante 15 min. El precipitado resultante se lavó con 1 ml de tampón de lavado (etanol 76%, v/v, 10 mM acetato de amonio) durante 20 min con agitación frecuente. Luego se centrifugó según las condiciones anteriormente mencionadas y se dejó secar al vacío por 20 min. El precipitado final, se resuspendió en 50 µl de agua estéril.

En ambos casos, se comprobó la integridad del ADN genómico mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% (m/v). Como criterio de pureza se determinaron las razones de Absorbancia a 260/230 nm y a 260/280 nm y la concentración de ADN de doble cadena, empleando un espectrofotómetro (Biophotometer, Eppendorf, Alemania). El proceso de aislamiento de ADN se realizó tres veces para cada muestra.

Obtención de perfiles genéticos

Para establecer un perfil genético que permitiera determinar el nivel de variabilidad genética asociada al proceso de propagación, se seleccionaron hojas jóvenes procedentes de cinco plantas cultivadas in vitro y de cinco plantas propagadas por esquejes. Se lavaron y se procedió a extraer el ADN según el protocolo seleccionado en el experimento anterior. Luego de comprobadas la integridad y el criterio de pureza de las muestras obtenidas, se procedió a ajustarlas a una misma concentración de ADN.

Las secuencias de los seis cebadores empleados para para la amplificación de RAPD fueron: R1: 5´-CGACCGCAGT-3´, R2: 5´-CCCTCTGCGG-3´, R4: 5´-AGCCATTGTC-3´, R5: 5´-GCTCAGGACG-3´, R6: 5´-GCCGTCGGGC-3´, R14: 5´-CTAAGCCATG-3´. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se empleó un Kit de PCR Core con Taq polimerasa (Sigma), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El programa empleado fue el siguiente: 4 min a 94 °C, 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 36 °C, y 90 segundos a 72 °C; seguido de 10 min a 72 °C. Todas las reacciones se realizaron por duplicado.

Al producto de amplificación se le realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1.5% (m/v), empleando el marcador GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus, ready-to-use y el colorante EZVision (Biotechnology ).Las bandas resultantes del RAPD fueron interpretadas según la presencia/ausencia de polimorfismos como valores binarios (1/0 respectivamente), con ellos se confeccionó una matriz de datos. La similitud y la distancia genética entre las diferentes muestras se calculó de acuerdo con la metodología de Nei (1972), utilizando el servidor web DendroUPGMA (Garcia-Vallvé y Puig, 2002).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación de protocolos de extracción de material genético

El empleo del protocolo propuesto por Khayat et al. (2004) no fue efectivo para extraer material genético a partir de muestras de S. rebaudiana . Sin embargo, sí fue posible aislar ADN genómico de esta planta, empleando el protocolo de Doyle y Doyle (1990) con modificaciones.

La extracción y purificación exitosa de ADN constituye el punto más importante para obtener resultados confiables al iniciar cualquier estudio molecular y depende, entre otros factores, del protocolo de extracción utilizado y de su efectividad (Velázquez et al ., 2014). Los protocolos analizados en el presente trabajo se basan principalmente, en la capacidad del CTAB para precipitar el ADN y evitar las co-precipitaciones con polisacáridos (Rahman et al., 2010). No obstante, difieren en las concentraciones de dicho agente, en los tiempos y temperaturas de incubación para la forma de ruptura de la muestra, la velocidad de la centrifugación, el tampón de lavado, entre otros aspectos. Este último resulta especialmente significativo, ya que uno de los pasos más importantes dentro del proceso de purificación es el lavado, el cual influye significativamente en el criterio de pureza del ADN (Velázquez et al., 2014).

El protocolo propuesto por Khayat et al. (2004) ha sido ampliamente utilizado con anterioridad para la extracción de ADN genómico de plantas (James et al., 2004, Chong-Pérez et al., 2012), con incluso mejores resultados, para algunas especies, que otros protocolos clásicos como el de Dellaporta et al. (1983); pero no ha sido probado con anterioridad en Stevia . En el presente estudio, la implementación de este protocolo no mostró resultados favorables, que pudieran estar dados por una deficiencia en la ruptura de las células y la consecuente liberación del material genético (Velázquez et al ., 2014) o por su posible degradación (Rahman et al., 2010).

Por otra parte, el protocolo de Doyle y Doyle (1990), también ha sido extensamente empleado, incluso para la especie objeto de estudio (Thiyagarajan y Venkatachalam, 2015; Bermúdez-Guzmán et al., 2016; Aguilar et al., 2017). Este sí permitió realizar una extracción efectiva. Las muestras obtenidas fueron consideradas de buena calidad, con valores de absorbancia medios de 1.75 para la relación 260/280 y 1.06 para 260/230 (Tabla 1). El grado de pureza de ADN, en ocasiones, puede incrementarse si se aumenta el tiempo de incubación en el tampón de lavado; pues este reduce los efectos de repulsión entre las cadenas, permite su autoplegamiento y disminuye su solubilidad, sin afectar la integridad o concentración del material genético aislado (Velázquez et al., 2014).

Tabla 1. Concentración y pureza de ADN obtenido de Stevia rebaudiana .

La implementación del protocolo propuesto por Doyle y Doyle (1990) modificado, es una alternativa menos costosa, en comparación con el empleo de un kit de extracción comercial. Puede ser realizado en alrededor de tres horas, en dependencia de la habilidad del especialista que lo ejecute y la cantidad de muestras. Debido a su laboriosidad y la capacidad de centrifugación, no se recomienda que sea aplicado para más de 24 muestras por purificación. Adicionalmente, permite obtener altas concentraciones de ADN necesarias cuando se requiere aplicar posteriormente técnicas no basadas en PCR, como la Hibridación por Southern. El protocolo propuesto es recomendable para la extracción de ADN de S. rebaudiana , debido a la sencillez de sus condiciones (solo se requiere un baño térmico y una centrífuga convencional), el bajo costo de los reactivos (en comparación con los kit comerciales), y la efectividad de sus resultados.

Obtención de perfiles genéticos

De los seis cebadores empleados en las reacciones de amplificación, solo en uno (R1) fue posible observar la presencia de bandas. Los cebadores R2, R4, R5, R6 y R14 no produjeron amplificación.

En el patrón de amplificación RAPD obtenido utilizando el cebador R1: 5´-CGACCGCAGT-3´, se produjeron 63 bandas totales para las 10 muestras analizadas. Estas se encontraron distribuidas en 12 líneas de bandas, de las cuales solo dos fueron comunes para todas las muestras (monomórficas). El resto de las bandas resultaron polimórficas y variaron en número entre una y siete para cada muestra (Figura 1). Esto resultó en un polimorfismo del 83.3%.

Los valores de similitud estuvieron entre 0.33 y 1.00 para una diferencia genética entre 0 y 0.66 (Tabla 2). Adicionalmente, la variabilidad de la distancia genética entre ambos grupos se representó en la figura 2. No se detectaron diferencias significativas entre los perfiles genéticos de las plantas cultivadas in vitro y las propagadas mediante cortes de esquejes. Sin embargo, la obtención de un mayor número de bandas es necesaria para excluir la aparición de variaciones somaclonales asociadas al cultivo in vitro de esta especie.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 1.5% del patrón de amplificación RAPD obtenido utilizando el cebador R1. 1: Marcador de peso molecular GeneRuler 100 pb DNA Ladder Plus, ready-to-use, 2-6: muestras de plantas micropropagadas de Stevia rebaudiana, 7-11: muestras de plantas de S. rebaudiana propagadas por cortes de esquejes, 12: control negativo.

Tabla 2. Matriz de similitud genética entre las muestras analizadas (a) plantas propagadas in vitro y (b) plantas propagadas por cortes de esquejes de Stevia rebaudiana .

Figura 2. Dendrograma UPGMA de distancia genética calculado de acuerdo con el perfil electroforético obtenido con el cebador R1, a partir de muestras de ADN genómico de plantas de Stevia rebaudiana (a) propagadas in vitro y (b) propagadas por cortes de esquejes.

Aunque estos resultados no sean robustos, el producto de amplificación de un solo cebador con muchas bandas, permite inferir un perfil genético preliminar y tener una idea general sobre el grado de similitud y distancia genética (Moktaduzzaman y Mahbubur-Rahman, 2009). El dendrograma UPGMA de distancia genética confeccionado con los datos obtenidos mostró que la variabilidad genética entre ambos grupos de plantas es similar. Estos valores corresponden a la variabilidad genética individual intrínseca dentro de una misma especie (Meléndez, 2019).

En la literatura científica se refiere con frecuencia que solo una parte de los cebadores totales utilizados en la técnica de RAPD llega a aportar productos de amplificación, como ocurrió en el presente estudio. Tal es el caso del trabajo de Moktaduzzaman y Mahbubur-Rahman (2009) quienes probaron dos cebadores y solo con uno de ellos se produjo amplificación. Por su parte, Modi et al. (2012) emplearon un total de 80 cebadores de los cuales solo seis fueron efectivos para la identificación de bandas.

De cualquier modo, los datos de la amplificación de un solo cebador no son suficientes para establecer un perfil genético completo. Además, la aplicación de la técnica de RAPD tiene algunas desventajas a tener en cuenta. Entre ellas las más significativas son la presencia de bandas iguales que pueden ser el resultado del peso molecular de los fragmentos y no deberse a la similitud en su secuencia. También, pueden ocurrir solapamientos entre las bandas, enmascarando los resultados. De igual manera, la ausencia de bandas no puede ser atribuida exclusivamente a la falta de la secuencia esperada, pues puede ser consecuencia de la fallos en la amplificación por otros motivos, como la degradación de la muestra o baja concentración de ADN (Kumari y Thakur, 2014). Esto último puede ser minimizado con la optimización del protocolo de purificación, como se propuso en la sección anterior.

La implementación de la técnica RAPD, en este trabajo y otros (Moktaduzzaman y Mahbubur-Rahman, 2009, Modi et al., 2012), no resultó satisfactoria para determinar variaciones somaclonales. Sin embargo, existen otras técnicas que se pueden emplea r con este fin (Yadav et al., 2017). Estas incluyen el uso de marcadores moleculares para determinar polimorfismos genéticos, que se pueden clasificar en tres grupos: los marcadores basados en hibridación de ADN, los basados en PCR y los específicos basados en secuenciación de ADN. Entre los primeros son más reconocidos las técnicas para detectar Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLPs) y las huellas específicas de oligonucleótidos. Dentro de los marcadores basados en PCR se encuentran la Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico, la Repetición de Secuencia Simple o microsatélites (SSRs) y los polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLPs). Mientras que el principal marcador específico basado en secuenciación de ADN es el análisis de polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs).

Aun así, si se desea emplear la técnica de RAPD para la detección de polimorfismos en futuros estudios con S. rebaudiana, es imprescindible la utilización de un alto número de pares de cebadores para asegurar la obtención de mayor número de amplificaciones. Además, es recomendable la aplicación de otras técnicas moleculares que pudieran ser más efectivas en el análisis de material genético de esta especie (como AFLP o ISSR). Estas técnicas deberán ser estandarizadas para la obtención de datos suficientes que permitan concluir sobre el efecto del cultivo in vitro sobre la variabilidad genética de esta especie. Asimismo, estos estudios contribuirán a la optimización de protocolos de propagación masiva de plantas que no afecten la identidad genética del cultivo.

 

CONCLUSIONES

Es posible obtener perfiles genéticos de plantas de Stevia rebaudiana Bertoni propagadas mediante corte de esquejes y cultivadas in vitro . El protocolo de extracción de ADN propuesto en este trabajo es efectivo y permite aplicar técnicas basadas en PCR para la detección de polimorfismos genéticos.

Conflicto de interés

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

 

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Recibido: 24-07-2019

Aceptado: 11-09-2019



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