Artículo original
Biotecnología Vegetal Vol. 20, No. 4: 351-359, octubre - diciembre, 2020
Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.
eISSN 2074-8647, RNPS: 2154
Respuesta diferencial de tres cultivares de Phaseolus vulgaris L. al estrés hídrico in vitro inducido por PEG-6000
Differential response of three Phaseolus vulgaris L. cultivars to in vitro water stress induced by PEG-6000
Milady F Mendoza-Rodríguez1*, https://orcid.org/0000-0002-8946-9838
Novisel Veitía1, https://orcid.org/0000-0001-6357-4843
Amanda Martirena-Ramírez1, https://orcid.org/0000-0002-1152-7735
Luis E Rojas1, https://orcid.org/0000-0002-0107-1842
Damaris Torres1, https://orcid.org/0000-0001-8443-4209
Samuel Hernández1, https://orcid.org/0000-0001-5914-8243
Leonardo Rivero1 , https://orcid.org/0000-0003-3627-9421
1Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP), Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830.
*Autora para correspondencia e-mail: milady@ibp.co.cu
RESUMEN
El crecimiento y rendimiento agrícola de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) se ve afectado, entre otros factores, por limitaciones en la disponibilidad de agua. Por ello, se trabaja en la búsqueda de cultivares tolerantes a dicho estrés abiótico. La investigación tuvo como objetivo determinar el efecto de diferentes concentraciones de PEG-6000 en la germinación in vitro de semillas de tres cultivares de frijol común (ʹIca Pijaoʹ, ʹBAT-93ʹ y ʹTío Canela-75ʹ) con diferente respuesta al estrés hídrico. Se empleó PEG-6000 como agente inductor de estrés in vitro al 10, 12 y 14% (m/v) en el medio de cultivo líquido. Como control se utilizó agua desionizada. Semillas de cada cultivar se colocaron sobre un papel de filtro ubicado en forma de M dentro del tubo de ensayo que contenía la solución correspondiente. A los tres días de cultivo se cuantificó el número de semillas germinadas y se calculó el porcentaje de germinación. Posteriormente, a los siete días se midió la longitud de la raíz, del hipocótilo y del epicótilo, respectivamente. En los tres cultivares el estrés hídrico afectó la germinación in vitro de las semillas en cada uno de los tratamientos. Se evidenció una disminución significativa en los valores de las variables evaluadas con respecto al control. Específicamente, el crecimiento del epicótilo se inhibió. La respuesta al estrés hídrico inducido in vitro con PEG 600 en cada cultivar fue específica y diferencial. Los resultados tributan al desarrollo de estrategias de selección temprana en el programa de mejoramiento genético del cultivo.
Palabras clave: epicótilo, estrés abiótico, frijol común, hipocótilo, raíz
ABSTRACT
The growth and agricultural yield of common beans (Phaseolus vulgaris L.) is affected, among other factors, by limitations in the availability of water. For this reason, there are working on the search for cultivars tolerant to that abiotic stress. The objective of the research was to determine the effect of different concentrations of PEG-6000 on the in vitro seeds germination of three cultivars of common bean (ʹIca Pijaoʹ, ʹBAT-93ʹ and ʹTío Canela-75ʹ) with different responses to water stress. PEG-6000 was used as an in vitro stress-inducing agent at 10, 12 and 14% (m / v) in the liquid culture medium. Deionized water was used as a control. Seeds of each cultivar were placed on a filter paper located in the shape of an M inside the test tube containing the corresponding solution. After three days of culture, the number of germinated seeds was quantified and the percentage of germination was calculated. Subsequently, at seven days the length of the root, hypocotyl and epicotyl, respectively, was measured. In the three cultivars, water stress affected the in vitro germination of the seeds in each of the treatments. There was a significant decrease in the values of the variables evaluated with respect to the control. Specifically, the growth of epicotyl was inhibited. The response to water stress in vitro induced with PEG 600 in each cultivar was specific and differential. The results contribute to the development of early selection strategies in the genetic improvement program of this crop.
Keywords: abiotic stress, common bean, epicotyl, germination, hypocotyl, root
INTRODUCCIÓN
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.), es una de las legumbres más consumidas a nivel mundial sin embargo, su producción está restringida tanto por la acción de factores bióticos como abióticos. Entre los abióticos el estrés hídrico debido a sequía, insuficiente irrigación o problemas en los sistemas de abasto de agua, limita la germinación de la semilla y el crecimiento de las plantas lo que trae como consecuencia disminución en la productividad y los rendimientos en el cultivo (Kusvuran y Dasgan, 2017).
En Cuba el estrés por sequía se considera la segunda causa que limita la producción de la leguminosa (Polón et al., 2014) y constituye un alimento esencial en la dieta alimentaria de la población (Lamz et al., 2016). Según la FAOSTAT la producción del grano en el año 2019 fue de 169 900 toneladas (FAOSTAT, 2019).
Teniendo en cuenta los efectos adversos de la sequía en el cultivo de frijol, la obtención de cultivares tolerantes, constituye una prioridad en los programas de mejoramiento genético. En tal sentido, la realización de investigaciones enfocadas en determinar el efecto del estrés hídrico sobre la germinación de la semilla y el crecimiento de las plantas, constituyen una prioridad. A este propósito, la utilización de la Biotecnología Vegetal como una alternativa a los problemas que se presentan con el mejoramiento genético convencional, hace una gran contribución (Collado et al., 2017).
La inducción de estrés hídrico in vitro con polietilenglicol-6000 (PEG-6000), ha sido una herramienta de gran utilidad en los estudios de mejoramiento genético en Phaseolus. En este sentido, autores como Mohamed y Tawfik (2006) realizaron estudios de resistencia a sequía en varias accesiones de Phaseolus acutifolius. Por otra parte, Collado et al. (2017) estudiaron la diferenciación de cultivares de P. vulgaris mediante la respuesta del tejido foliar expuesto a estrés hídrico.
Es de destacar, que a pesar de la importancia que tiene la obtención y empleo de cultivares de frijol con tolerancia a estrés hídrico, los estudios en la temática aún son insuficientes. Específicamente, los relacionados con su efecto en la germinación, momento más vulnerable del ciclo de vida de una planta (Pérez-Hernández et al., 2018). Por ello, se hace necesario profundizar en el conocimiento de la respuesta de las plantas bajo estas condiciones de crecimiento.
El conocimiento de la respuesta de cultivares de P. vulgaris al estrés hídrico es una premisa para los programas de mejoramiento genético del cultivo en el Instituto de Biotecnología de las Plantas. En él se incluyen los cultivares (cv.) ʹIca Pijaoʹ (Voysest, 2000) y ʹBAT-93ʹ (Sanchez-Valdez et al., 2004) por su alto rendimiento, este último además con resistencia a enfermedades y ambos con susceptibilidad al estrés hídrico. Sin embargo, en estos cultivares no existen estudios previos relacionados con su respuesta a estrés hídrico, excepto para el cultivar ʹIca Pijaoʹ bajo condiciones más estresantes (García et al., 2015). Estos autores concluyeron que para la continuación de los estudios en este cultivar, se deben utilizar concentraciones inferiores del agente estresante.
Teniendo en cuenta la información previa, la presente investigación se propuso determinar el efecto de diferentes concentraciones de PEG-6000 en la germinación in vitro de semillas de tres cultivares de frijol común (ʹIca Pijaoʹ, ʹBAT-93ʹ y ʹTío Canela-75ʹ) con diferente respuesta al estrés hídrico. Los resultados pretenden contribuir al desarrollo de metodologías de selección temprana, como apoyo a los programas de mejora genética del cultivo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y condiciones de cultivo
Se emplearon semillas maduras de P. vulgaris de los cultivares ʹIca Pijaoʹʹ, ʹBAT-93ʹ y ʹTío Canela-75ʹ con un mes de cosechadas, los dos primeros con susceptibilidad y el último con tolerancia al estrés hídrico, respectivamente. Estas fueron obtenidas del banco de germoplasma del Centro de Investigaciones Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas.
Desinfección de las semillas
Las semillas maduras de cada cultivar de P. vulgaris se colocaron por separado en una solución de etanol al 70% (v/v) por 30 segundos y se agitaron de forma manual. A continuación se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 3% (v/v) por 10 minutos (min) con agitación constante, en un agitador orbital a 110 rpm. Posteriormente, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril en la cabina de flujo laminar (Collado et al., 2017).
Preparación del medio de cultivo para la inducción de estrés hídrico
En este ensayo se utilizó como agente estresante PEG-6000, para simular condiciones de estrés hídrico in vitro. Para ello se prepararon soluciones de PEG-6000 con agua destilada a diferentes concentraciones (10, 12 y 14% (m/v). El cálculo del potencial osmótico en Mega Pascals (MPa) equivalente, se realizó de acuerdo con la ecuación descrita por Michel y Kaufmann (1973) dónde: 10% (-0.148 MPa), 12% (-0.201 MPa) y 14% (-0.262 MPa).
Para cada concentración se utilizaron 45 tubos de ensayo (150 mm largo x 20 mm diámetro), a los que se les añadieron 5 ml de la solución correspondiente. Además, se incluyeron 15 tubos de ensayo con 5 ml de agua destilada cada uno como control. Posteriormente, se esterilizaron en una autoclave (SAKURA) a 121 °C y 1.2 kg cm-2 por 15 min.
Diseño del experimento
En cada cultivar (cv.) se estudiaron cuatro tratamientos, que incluían las tres concentraciones de PEG-6000 en estudio y el control. El número de réplicas por tratamiento fue de 15 semillas. En una cabina de flujo laminar cada semilla se colocó sobre un papel de filtro (Whatman No. 42), ubicado en forma de M dentro del tubo de ensayo, que contenía la solución correspondiente. El experimento se repitió una vez en el tiempo. El material vegetal se mantuvo en una cámara de cultivo a 25 ± 2 °C bajo un fotoperíodo de 16 h luz/8 h oscuridad y a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 45 µmol m-2 s-1.
Evaluación experimental
A los tres días de cultivo se cuantificó el número de semillas germinadas y se calculó el porcentaje de germinación de las semillas (PG) (%) (Scott et al., 1984). Posteriormente, a los siete días se midió con una regla graduada la longitud de la raíz (cm), del hipocótilo (cm) (Nakagawa et al., 1999) y del epicótilo (cm) respectivamente.
Análisis estadístico
Los datos experimentales se procesaron con el paquete Statistic Packaged for Social Science (SPSS) versión 21.0 para Window, con previa comprobación de los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza con un valor p≤0.05. Se emplearon las pruebas no paramétricas H de Kruskall-Wallis y U de Mann-Whitney, después de haber generado hasta 10 000 muestras con distribución similar a la real mediante técnica de Monte Carlo, para estimar de esta forma la significación con el 95% de confianza.
RESULTADOS
En este estudio la inducción de estrés hídrico con diferentes concentraciones de PEG-6000, afectó el porcentaje de germinación in vitro de las semillas de los cultivares ʹIca Pijaoʹ, ʹBAT-93ʹ y ʹTío Canela-75ʹ. A los tres días de incubación, en el tratamiento control germinó el 100% de las semillas y en el cultivar tolerante el 69%. En cada cultivar se obtuvo una reducción significativa para este indicador entre tratamientos y con respecto al control. En el cultivar ʹTío Canela-75ʹ, los valores de germinación disminuyeron en correspondencia con el aumento de las condiciones estresantes mientras que en los cultivares susceptibles la respuesta fue más variable (Figura 1).
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Figura 1. Porcentaje de germinación de semillas de tres cultivares de Phaseolus vulgaris L. en presencia de diferentes concentraciones de PEG-6000 a los tres días de incubación.
En la evaluación posterior a los siete días, el 100% de las semillas del cultivar ʹTío Canela-75ʹ germinaron y se incrementaron los porcentajes de germinación en 86.5, 83.6 y 93% en los tratamientos con 10, 12 y 14% de PEG-6000, respectivamente. Por otra parte, en el cultivar ʹIca Pijaoʹ en los tratamientos con 10 y 12% de PEG-6000 se alcanzaron valores de 96.5 y 100% de germinación y en el cultivar ʹBAT-93ʹ de 92 y 83% respectivamente, con 10 y 14%. En el tratamiento control de los tres cultivares se observó la formación de raíz principal y raíces secundarias (Figura 2a). Sin embargo, en condiciones de estrés se observó el crecimiento de la raíz principal y escasas raíces secundarias. A las diferencias observadas en el desarrollo radicular, se adicionó el escaso o nulo desarrollo de la parte aérea de las plantas en los tres tratamientos donde se empleó el agente estresante (Figura 2b).
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Figura 2. Germinación in vitro de semillas de tres cultivares de Phaseolus vulgaris L. en presencia de diferentes concentraciones de PEG-6000 a los siete días de cultivo (a) Control y (b) Concentraciones de PEG-6000.
La variable longitud de la raíz se afectó por las diferentes concentraciones de PEG-6000. Tanto en el cultivar tolerante como en los susceptibles, en cada tratamiento se redujo en más de un 50% la longitud de la raíz con diferencias significativas respecto al control. En el cv. ʹTío Canela-75ʹ la variable disminuyó progresivamente con el aumento del estrés, con valores por debajo de 1.0 cm al utilizar 14% de PEG-6000. Sin embargo, en ʹBAT-93ʹ e ʹIca Pijaoʹ la respuesta fue variable. Los tres cultivares mostraron los menores valores de longitud de la raíz cuando se empleó 14% del agente estresante (Figura 3).
De igual forma, en la variable longitud del hipocótilo, se evidenció un reducción significativa, en las semillas germinadas de los cultivares en cada uno de los tratamientos con respecto al control. En el cv. ʹTío Canela-75ʹ se observó crecimiento hasta la concentración de 12% de PEG-6000. Sin embargo, en ʹIca Pijaoʹ y ʹBAT-93ʹ solo se registraron valores para esta variable para la menor y mayor concentración del agente inductor de estrés (Figura 4).
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Figura 3. Longitud de la raíz de semillas de tres cultivares de Phaseolus vulgaris L. germinadas in vitro en presencia de diferentes concentraciones de PEG-6000 a los siete días de incubación.
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Figura 4. Longitud del hipocótilo de semillas de Phaseolus vulgaris L. germinadas in vitro de tres cultivares de frijol común en presencia de diferentes concentraciones de PEG-6000 a los siete días de incubación.
La respuesta de la variable longitud del epicótilo evidenció la incidencia negativa directa de la inducción de estrés hídrico por PEG 6000 en el desarrollo de la parte aérea de la planta. Solo los cultivares ʹTío Canela-75ʹ e ʹIca Pijaoʹ presentaron crecimiento del epicótilo (por debajo de 0.2 cm) en presencia de 10% de PEG-6000. Sin embargo, en el cultivar ʹBAT-93ʹ no hubo respuesta para esta variable con los tratamientos empleados (Figura 5).
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Figura 5. Longitud del epicótilo de semillas de Phaseolus vulgaris L. germinadas in vitro de tres cultivares en presencia de diferentes concentraciones de PEG-6000 a los siete días de incubación.
DISCUSIÓN
Los resultados mostraron que el agente estresante afectó la germinación in vitro de las semillas, lo que se tradujo en una disminución del porcentaje de germinación, el escaso desarrollo de raíces laterales y reducción de la longitud de la raíz principal, del hipocótilo y el epicótilo respectivamente.
Estos resultados corroboraron hallazgos previos del efecto negativo del PEG-6000 en la germinación de semillas de P. vulgaris. En este sentido, Suárez et al. (2014) encontraron una menor germinación en todos cultivares evaluados, con el incremento de la concentración de PEG-8000. De igual forma en el cv. ʹIca Pijaoʹ García et al. (2015) con el empleo de 8, 10, 12, 14, 16 y 18 de PEG-6000, describieron porcentajes de germinación inferiores a los alcanzados por el tratamiento control.
Una respuesta similar para esta variable también ha sido informada por diversos autores en otros cultivos tales como: Sorghum bicolor (L.) Moench (Rezende et al., 2017), y Solanum lycopersicum L. (Florido et al., 2018). Los resultados de estas investigaciones permitieron a dichos autores la selección de plantas con tolerancia a estrés hídrico. Este tipo de estrés sobre la germinación, se relaciona con desórdenes metabólicos y enzimáticos como la generación de especies reactivas de oxígeno, la reducción del potencial de soluto e hídrico entre otras. La disminución de este último a su vez, restringe la disponibilidad de agua, lo cual es crítico para la activación de procesos metabólicos y bioquímicos en la semilla que culmina con su germinación (Fathi y Tari, 2016). La germinación de la semilla es un proceso complejo y la fase más crítica en el ciclo de vida de una planta, el cual se compromete bajo condiciones de estrés hídrico (Nadeem et al., 2019). En estudios de germinación para la simulación de las condiciones de estrés, el PEG resulta un osmolito eficiente al ser un compuesto inerte y no tóxico. Al respecto, Kosturkova et al. (2014) comunicaron acerca de la correlación que existe entre la tolerancia a sequía en campo y los experimentos a nivel de laboratorio con PEG.
La afectación en la longitud de la raíz, es una de las manifestaciones que se observa en plantas que crecen bajo un régimen de estrés hídrico. Según Sofi et al. (2017) la exposición del frijol común a estrés hídrico reduce la longitud de su radícula. Los resultados presentados en este trabajo así lo confirman ya que, la reducción de esta variable tuvo lugar para los tres cultivares de frijol común estudiados. Además, coincidieron con los informados previamente por Muscolo et al. (2014) en el estudio de cuatro cultivares de Lens culinaris L. y Pérez-Hernández et al. (2018) en S. bicolor. Estos autores informaron que la disminución de esta variable estuvo vinculada con el incremento de la concentración de PEG-6000.
La respuesta al estrés hídrico en una planta está dada por su capacidad para evitar la deshidratación del tejido, lo cual se debe en parte a la arquitectura de la raíz. En investigaciones realizadas por Sofi et al. (2018) estos autores concluyeron que el estrés por carencia de agua cambia la arquitectura de la raíz en el frijol común, al comparar su efecto en el desarrollo del sistema radicular en un cultivar tolerante respecto a uno susceptible. Los resultados de este estudio corroboraron estos informes ya que, en respuesta al estrés inducido por PEG 6000 en los cultivares se favoreció la formación de la raíz principal, en contraste con el desarrollo típico del cultivo que tuvo el sistema radicular en las plantas control.
La disminución observada en la longitud del hipocótilo ante el estrés inducido in vitro por PEG en los cultivares estudiados, concordó con estudios previos realizados en esta temática. Autores como Lejardi et al. (2011), al evaluar 26 cultivares de frijol común, encontraron afectaciones en esta variable en todos los tratamientos que incluían las concentraciones de PEG-6000 a partir de 3%. De forma similar, Suárez et al. (2014) a su vez concluyeron que el aumento de las condiciones de déficit hídrico, influyeron negativamente en el desarrollo del hipocótilo de los ocho cultivares de frijol común utilizados. Por su parte, Pierre et al. (2014), en Medicago truncatula Gaertn también informaron diferencias en el alargamiento del hipocótilo entre los diferentes cultivares. El crecimiento del hipocótilo tiene un papel importante en la emergencia de la planta, lo cual está influenciado por las condiciones ambientales. Sin embargo, pocos estudios han evaluado esta respuesta (Kutschera y Niklas, 2013). La inhibición del crecimiento de las plántulas por estrés hídrico se relaciona directamente con la reducción de entrada de agua hacia los tejidos. Este factor es esencial para el desarrollo de la presión de turgencia para que ocurra el alargamiento celular (Pierre et al., 2014). En correspondencia con lo anterior y de acuerdo con varios autores en casos típicos de estrés hídrico, los órganos subterráneos (raíz o radícula) de la planta se desarrollan más rápido que los órganos aéreos (tallo o hipocótilos), para lograr así su aclimatización (Jiao-jun et al., 2005; Zhu et al., 2006; Lejardi et al., 2011).
A partir de los resultados se pudo constatar que para cada cultivar de frijol común, de los incluidos en el estudio, la respuesta in vitro a la germinación bajo condiciones de estrés inducido por PEG 6000 fue específica y diferencial. De esta forma, en el cv. ʹTío Canela-75ʹ hubo una disminución gradual de todas las variables evaluadas, en la medida que aumentaron las concentraciones del agente estresante. En cambio, los cultivares ʹIca Pijaoʹ y ʹBAT-93ʹ tuvieron una respuesta variable. En los tres cultivares el desarrollo de la parte aérea de la planta fue más sensible que la radicular al estrés inducido in vitro. Es de destacar, que las concentraciones de PEG-6000 empleadas afectaron tanto al cultivar tolerante como a los susceptibles. Los datos obtenidos sugieren que para establecer un criterio de selección in vitro a estrés hídrico con el empleo de PEG-6000 en estos tres cultivares se deben utilizar concentraciones inferiores a las estudiadas. Sin embargo, aportan elementos valiosos para el conocimiento del efecto del estrés hídrico en estos cultivares y abren nuevas interrogantes para estudios posteriores.
CONCLUSIONES
Los cultivares de P. vulgaris ʹIca Pijaoʹ, ʹBAT-93ʹ y ʹTío Canela-75ʹ muestran una respuesta diferencial al estrés hídrico in vitro inducido por PEG 6000 que se manifiesta en el proceso de germinación de las semillas. No obstante, las concentraciones utilizadas (10, 12 y 14) afectan la longitud del hipocótilo, el epicótilo y la raíz tanto en el cultivar tolerante (‘Tío Canela-75’) como en los susceptibles. Este aspecto debe considerarse para establecer métodos de evaluación temprana donde se incluyan dichos cultivares.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado a través del proyecto: Mejoramiento genético de Phaseolus vulgaris L. para la búsqueda de resistencia a estrés biótico y abiótico (código P131LH001084) financiado por el Programa Nacional de Alimento Humano del CITMA. Los financistas no tuvieron participación en el diseño del estudio, la colecta y análisis de los datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito es de la institución y el colectivo de autores del proyecto.
Conflicto de interés
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Contribución de los autores
Conceptualización NV, Análisis formal NV, MFMR y AMR, Investigación MFMR, NV, DT, LR AMR y SH, Metodología NV, MFMR, Escritura-Primera redacción MFMR, NV, Escritura-Revisión y Edición MFMR, NV y AMR.
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Recibido: 06-10-2020
Aceptado: 25-11-2020
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Biotecnología Vegetal eISSN 2074-8647, RNPS: 2154. ISSN 1609-1841, RNPS: 0397 Editada por: Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba CP 54 830 Tel: 53 42200124, e-mail: info@ibp.co.cu
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