INTRODUCCIÓN

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la especie más cultivada en el mundo dentro del género Phaseolus (Hnatuszko-Konka et al., 2019). Esta especie, por cultivarse en hábitats muy diversos, se encuentra expuesta a numerosos factores bióticos y abióticos que afectan su rendimiento. Dentro de estos últimos el estrés originado por altas temperaturas es considerado la mayor limitante para la producción agrícola en el mundo (Salman et al., 2019). Es por ello, que el desarrollo de investigaciones encaminadas a la obtención de nuevos cultivares tolerantes a estas condiciones adversas, son esenciales para contribuir a la seguridad alimentaria de una población creciente que requiere incrementos significativos en la producción de alimentos (Srivastava, 2019).

El cv. ‘ICA Pijao’ está incluido en los programas de mejoramiento genético que se desarrollan en Cuba, debido a que presenta un rendimiento elevado y es uno de los más atractivos para los pequeños productores. Este cultivar presenta grano negro y se cultiva principalmente en la región occidental del país. Además, posee hábito de crecimiento erecto lo que permite la cosecha mecanizada. Sin embargo, presenta como limitante que es susceptible a la sequía y las altas temperaturas (Bastidas, 1989).

Las técnicas de mejoramiento genético convencionales en Phaseolus resultan difíciles debido a numerosas causas como una base genética estrecha y muy estable (Mc Clean et al., 2008). Cuando se emplea la biotecnología para estos propósitos se requieren de métodos rápidos y eficientes para la selección temprana de los materiales vegetales de interés (Hadrami et al., 2011). La posibilidad de realizar la selección in vitro depende de poder contar con un agente selectivo que permita la diferenciación de cultivares resistentes y susceptibles a un factor determinado.

Diversas son las ventajas del empleo de la selección in vitro relacionadas con las posibilidades de selección desde etapas tempranas. Trabajar en estas condiciones significa controlar todos los parámetros ambientales en los cuales las plantas, tejidos o células están creciendo (Rai et al., 2011). En la selección a altas temperaturas los métodos convencionales se hacen inefectivos debido al efecto simultáneo de otros factores como las enfermedades, ataques de insectos, sequía y nutrición (Fernández y Sánchez, 2017). Contar con técnicas in vitro que permitan seleccionar desde etapas tempranas individuos promisorios, representaría un paso inicial que evitaría la evaluación en campo de un elevado número de individuos y se mejoraría la eficiencia de la selección (Gosal y Wani, 2018).

A pesar de las ventajas de la selección in vitro y que el estrés por altas temperaturas ya es considerado la mayor limitante para la agricultura en el mundo, pocos trabajos que abordan esta temática han sido referidos en la literatura científica. Ello se relaciona con el conocimiento limitado de los mecanismos moleculares y los genes relacionados con la tolerancia al calor (Salman et al., 2019).

La mayoría de las investigaciones relacionadas con la tolerancia al estrés por calor en el frijol común se han realizado en condiciones ex vitro (Omae et al., 2012; Collado et al., 2016). Torres et al. (2019) evaluaron el efecto del tratamiento térmico a altas temperaturas sobre la germinación in vitro de semillas de P. vulgaris cv. ‘ICA Pijao’ y propusieron utilizar el tratamiento térmico en una incubadora a 35±2 °C durante 2 h para inducir estrés por altas temperaturas en dicho cultivar. No obstante, para desarrollar un protocolo de selección in vitro se hace necesario lograr la diferenciación entre cultivares tolerantes y susceptibles al factor estudiado. El presente trabajo se realizó con el objetivo de seleccionar la temperatura que permita diferenciar in vitro la respuesta de los cultivares de P. vulgaris ‘ICA Pijao’ (susceptible) y ‘Tío Canela- 75’ (tolerante) a altas temperaturas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se emplearon semillas maduras de 1-4 meses de cosechadas de Phaseolus vulgaris L. de los cultivares ‘ICA Pijao’ y ‘Tío Canela- 75’ obtenidas en casa de cultivo bajo condiciones semicontroladas. Estos cultivares presentan diferentes respuestas al estrés por calor. Se considera el cultivar ‘ICA Pijao’ como susceptible y ‘Tío Canela- 75’ como tolerante, según describen Bastidas (1989) y Rosas et al. (1997), respectivamente.

Tratamiento térmico

Se estudiaron diferentes temperaturas (30, 35, 40, 45 y 50 °C) aplicados sobre semillas de los dos cultivares. Este procedimiento se realizó antes del proceso de desinfección de las semillas. Se emplearon 100 semillas por tratamiento, las cuales fueron expuestas al tratamiento térmico en una incubadora IF-3B (SAKURA) durante dos horas (Torres et al., 2019).

Para la realización del experimento las semillas se colocaron en placas de Petri de 9.0 cm de diámetro, se sellaron con Parafilm y se expusieron al tratamiento térmico. Como control las semillas fueron expuestas a temperatura ambiente (28±2 °C).

Germinación de semillas

Posterior al tratamiento térmico las semillas se desinfectaron y para ello se siguió el protocolo descrito por García et al. (2008). Una vez desinfectadas, se colocaron 10 semillas por frasco en un medio de cultivo de germinación compuesto por Sales MS (Murashige y Skoog, 1962), 1.0 mg l^-1 de tiamina, 1.13 mg l^-1 de 6- bencilaminopurina (6-BAP), 30 g l^-1 de sacarosa, 7.0 g l^-1 de agar (BioCen). Los medios de cultivo en estado semisólido se distribuyeron en frascos de vidrio con capacidad total de 250 ml, a los que se les adicionaron 30 ml de medio de cultivo. Los frascos fueron colocados en cámara de crecimiento a oscuridad constante a 28±2 °C.

A los tres días de cultivo, se cuantificó el número de semillas germinadas por frasco de cultivo y se calculó el porcentaje de germinación por frasco (PG) de acuerdo con la siguiente ecuación: PG = (SG/NTS) x 100. Siendo SG es el número de semillas que emitió radícula a las 72 horas y NTS es el número total de semillas. Además, en 60 semillas por tratamiento seleccionadas al azar, se evaluaron las variables asociadas a la germinación de las semillas: longitud de la radícula (cm) y longitud de la plúmula (cm) según lo recomendado por Torres et al. (2019). Para ello, se empleó una regla graduada (cm) y un pie de rey.

Formación de callos

A los tres días de encontrarse las semillas en el medio de cultivo de germinación se procedió a la obtención del explante a utilizar para la formación de callos. A las semillas germinadas, en ambos cultivares (Figura 1 A) se le eliminó la testa adherida a los cotiledones, la radícula y la plúmula (Figura 1 B) y como explante se utilizó un cotiledón con el nudo cotiledonal (Figura 1 C) para la formación de callo.

[Figure ID: f1] Figura 1..

Obtención del explante para la formación de callos de P. vulgaris cvs ‘ICA Pijao’ y ‘Tío Canela- 75’. A- Semilla germinada, B- Eliminación de la testa, radícula y plúmula, C- Cotiledón con nudo cotiledonal.

Los explantes obtenidos fueron transferidos a un medio de cultivo de formación de callos propuesto por Collado et al. (2013). Este medio de cultivo estaba compuesto por Sales MS, vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), 0.2 mg l^-1 de tidiazuron (TDZ), 0.05 mg l^-1 de ácido indolacético (AIA), 30 g l^-1 de sacarosa y 8.0 g l^-1 de agar (BioCen).

Se utilizaron 10 explantes por frasco y se colocaron en condiciones de oscuridad total a 28±2 °C durante 7 días. Una vez transcurrido este tiempo, los explantes fueron llevados a la cabina de flujo laminar, se le eliminaron los brotes emitidos y se colocaron nuevamente en un medio de cultivo fresco de formación de callos por 14 días para completar los 21 días de cultivo en esta fase. Luego, los frascos se colocaron en cámara de crecimiento a una intensidad luminosa de 45 µmol m^-2s^-1 proveída por lámparas fluorescentes a 25±2 °C.

A los 21 días de cultivo se cuantificó el número de explantes que formaron callos. A partir de estos valores se calculó el porcentaje de explantes que formaron callos según la ecuación: PFC = (NCFC/NTNC) x 100. Donde NCFC es el número de nudos cotiledonales que formaron callos y NTNC es el número total de nudos cotiledonales por frascos de cultivo.

Regeneración de brotes

A los 21 días de cultivo, los callos formados fueron colocados en un medio de cultivo para la regeneración de brotes propuesto por Collado et al. (2013). Este medio de cultivo estaba compuesto por Sales MS (Murashige y Skoog, 1962), vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), 2.25 mg l^-1 de 6- bencilaminopurina (6-BAP), 30 g l^-1 de sacarosa, 7.0 g l^-1 de agar (BioCen). Se colocaron 10 explantes por frascos de cultivo.

Los frascos se ubicaron en cámara de crecimiento a una intensidad luminosa de 45 µmol m^-2s^-1 proveída por lámparas fluorescentes frías a 25±2 °C. A los 21 de cultivo se cuantificó el número de brotes regenerados por callo.

Análisis estadístico

Para el análisis de los valores de porcentaje de germinación, longitud de la radícula y la plúmula, número de explantes que formaron callos y número de brotes por callo se emplearon las pruebas H de Kruskall Wallis y U de Mann Whitney (p<0.05) previa comprobación del no cumplimiento de los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza. El paquete estadístico empleado fue Statistic Packaged for Social Science (SPSS) versión 21.0 sobre Windows.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Germinación de semillas

El tratamiento térmico al que se sometieron las semillas de los dos cultivares estudiados no influyó en su germinación. Se obtuvo 100% de germinación en ambos cultivares hasta 35 °C. Cuando se utilizó 40 °C y 45 °C se alcanzó 98% de germinación en el cultivar ‘ICA Pijao’ (susceptible) y 99% en ‘Tío Canela- 75’ (tolerante). Asimismo, en 50 °C se obtuvo 97% de germinación de las semillas en ambos cultivares. Esta respuesta podría estar relacionada con las condiciones ambientales a las que, posterior al tratamiento térmico, se encontraban expuestas las semillas cultivadas in vitro donde tenían la humedad y nutrientes necesarios para la germinación. Según INIFAT (2016), semillas con un ligero aumento en su contenido de humedad pudieran tener una tendencia a soportar el estrés térmico. En esta misma especie, Vásquez et al. (1990), informaron que en granos de polen de P. vulgaris el porcentaje de germinación in vitro estuvo inversamente relacionado con el nivel de estrés por temperaturas altas y el tiempo de exposición al estrés. En ese estudio, 50 °C resultó ser la temperatura a la cual el polen que se había sometido a estrés durante una hora presentó disminución considerable en su germinación.

Contrario a lo obtenido en el presente trabajo en el cultivo de maní (Arachis hypogaea L.), sí se afectó la germinación de semillas cuando se utilizaron temperaturas hasta 38 °C (Caroca et al., 2016).

Sin embargo, la temperatura sí influyó en la longitud de la radícula de P. vulgaris en los cultivares estudiados. En todos los tratamientos se encontraron diferencias significativas entre los cultivares para los valores medios de longitud de la radícula (Tabla 1), excepto para los controles (28 °C). Los mayores valores para cada tratamiento correspondieron al cultivar ‘Tío Canela- 75’ (tolerante).

Tabla 1..

Longitud de la radícula de semillas de Phaseolus vulgaris L. sometidas a tratamiento térmico previo a la germinación in vitro, a los tres días de cultivo.

En el cultivar susceptible la temperatura afectó considerablemente el crecimiento de la radícula. A medida que aumentó la temperatura esta variable fue disminuyendo a partir de 35 °C, y llegó a valores de 2.14 cm de disminución respecto al control en semillas tratadas con 50 °C. Estos resultados concuerdan con lo referido por Salman et al. (2019) quienes plantean que el estrés por calor puede reducir el crecimiento radical en los primeros estadios de desarrollo. En este cultivar la longitud de la radícula se afectó a partir de 40 °C lo que pudiera estar relacionado con la deshidratación de los tejidos del embrión provocada por el tratamiento térmico a la semilla (Chaves-Barrantes y Gutiérrez-Soto, 2017) que se debe entre otros fenómenos a que las altas temperaturas afectan considerablemente la permeabilidad de las membranas celulares en las radículas (Kurepin et al., 2015). Así mismo, Nava (2013) informó que el aumento de la temperatura a más de 40 °C provocó un incremento en el daño de la membrana celular en cultivares de maíz (Zea mays L.) y frijol. Además, se ha descrito que en el frijol común una de las etapas más sensibles a modificarse bajo la acción del estrés abiótico es el crecimiento (Cabrera-Ponce et al., 2014).

Por el contrario, en el cultivar tolerante se observó menor afectación en la longitud de la radícula. Cuando se utilizaron 30, 35 y 40 °C, se observó un incremento en la longitud de la radícula, respecto al control, de 0.64 cm, 2.11 cm y 0.93 cm respectivamente, mientras que en 45 y 50 °C solo se observó una disminución de 0.01 cm y 0.02 cm. En plantas sometidas a estrés térmico, se ha observado una mayor elongación radical (Martínez et al., 2017). La longitud de la radícula, es un indicador que refleja la capacidad de la planta para poder realizar una mayor absorción de agua y nutrientes, indispensables para las etapas fenológicas posteriores a la germinación (INIFAT, 2016) y esto pudiera ser parte de la respuesta de este cultivar en estas condiciones experimentales. De manera general, se puede señalar, que la longitud del sistema radical es una de las características fundamentales de las especies tolerantes a la sequía y a altas temperaturas por lo que podría ser un indicador a tener en cuenta para la selección de cultivares con adaptabilidad a estas condiciones (Barrios et al., 2014). En el presente trabajo a partir de 30 °C, se logró diferenciar entre el cultivar tolerante y el susceptible cuando fue evaluada la longitud de la radícula.

La longitud de la plúmula mostró diferencias significativas entre los cultivares de P. vulgaris estudiados a partir de 35 °C (Figura 2). Los mayores valores en esta variable se observaron en el cultivar tolerante (‘Tío Canela- 75’). Similares resultados fueron referidos por Collado et al. (2016) quienes encontraron que 35 y 40 °C fueron las temperaturas apropiadas para diferenciar la respuesta de cultivares de P. vulgaris en la variable pérdida de electrolito. La longitud de la plúmula es otro indicador que refleja la capacidad de la planta para poder realizar una mayor absorción de agua y nutrientes (INIFAT, 2016).

[Figure ID: f2] Figura 2..

Longitud de la plúmula en semillas de dos cultivares de Phaseolus vulgaris (‘ICA Pijao’ y ‘Tío Canela- 75’) sometidas a tratamiento térmico previo a la germinación in vitro, a los tres días de cultivo.

En el cultivar susceptible esta variable varió de 0.5 a 0.58 cm, mientras que en el cultivar tolerante se incrementó en todos los tratamientos cuando se compararon con el control y llegó a su máximo valor cuando se utilizó 40 °C. En esta temperatura la longitud media de la plúmula se incrementó en 0.32 cm con respecto al control.

Los resultados de la evaluación de la longitud de la radícula y de la longitud de la plúmula en semillas germinadas in vitro permitieron diferenciar la respuesta a altas temperaturas entre el cultivar susceptible y el tolerante. Ello posibilita utilizar estas variables para la selección de la temperatura a utilizar en la selección in vitro a diferencia del porcentaje de germinación de las semillas donde no se observaron diferencias.

Formación de callos

A medida que se incrementó la temperatura a la que se sometieron las semillas previo a la germinación, hasta 40 °C, se estimuló la formación de callos en los dos cultivares de P. vulgaris incluidos en el estudio (Tabla 2). Este resultado pudiera deberse a la aceleración del metabolismo celular que ocurre cuando se realizan tratamientos térmicos por tiempos definidos al material vegetal, lo que pudo provocar la estimulación de la división celular y la elongación de las células, así como la alteración de los procesos metabólicos como son la síntesis de fitohormonas y ácidos nucleicos (Chaves-Barrantes y Gutiérrez-Soto, 2017).

En esta respuesta pudiera haber influido, además, que dentro de los componentes del medio de cultivo de formación de callos para P. vulgaris se encuentra el thidiazuron (TDZ) del cual se utiliza 0.2 mg l^-1. Este compuesto (C9H8N4OS) es uno de los sustitutos más efectivos de las fenilureas con actividad de citoquinina pero además puede modular los niveles de auxina endógena (Govindaraj, 2018). Según Veerasamy et al. (2007) las citoquininas atenúan los daños causados por el estrés por calor. Estudios llevados a cabo en Agrostis stolonifera L. indicaron que la aplicación exógena de citoquininas aminora los daños debidos al estrés por calor, ya que inhiben la acción de las proteasas sobre la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa, e inducen o sobrerregulan la producción de proteínas de choque térmico.

Al comparar la formación de callos entre los cultivares evaluados se observaron diferencias significativas cuando se utilizaron temperaturas de 35 y 45 °C (Tabla 2). En 45 °C la formación de callos disminuyó en ambos cultivares, no obstante, la disminución fue más acentuada en el cultivar susceptible.

Tabla 2..

Formación de callos a los 21 días de cultivo en Phaseolus vulgaris cv. ʹICA Pijaoʹ y cv. ʹTío Canela-75ʹ a partir de explantes tomados de semillas sometidas a tratamiento térmico con diferentes temperaturas previo a la germinación.

Los explantes de semillas tratadas con 50 °C no formaron callos en los dos cultivares. Esto podría explicarse porque temperaturas muy altas pueden afectar los procesos metabólicos de las células e incluso dañarlas irreparablemente, y por lo tanto no puede evidenciarse un crecimiento celular sucesivo (Butler et al., 2014). De modo similar, estos resultados pudieran deberse a que en la mayoría de estos explantes se produjo la caída del cotiledón, que se ha descrito como la principal fuente de almacenamiento de reguladores del crecimiento que promueven el desarrollo del callo (Collado et al., 2013; Martirena-Ramírez et al., 2018).

Resultados contrarios fueron obtenidos por Kairuz (2013) al aplicar diferentes temperaturas (37-45 °C) sobre discos de hojas de Digitalis purpurea L. No se observó diferencias significativas en el grado de formación de callos por explante para el control, 37 °C y 40 °C, mientras que no se apreció la formación de callos cuando los discos de hojas fueron tratados con 45 °C. En el presente trabajo se comenzó a observar afectaciones en los explantes de semillas tratadas con 45 °C y ya a 50 °C fue nula la formación de callos en ambos cultivares.

En los explantes de semillas tratadas con 35 y 45 °C se observaron diferencias en la formación de callos entre los cultivares estudiados, aunque desde el control se observó diferencia entre ellos por la condición genotipo dependiente de esta especie.

Regeneración de brotes

El tratamiento térmico realizado a las semillas en los cultivares estudiados también influyó en la regeneración de brotes (Tabla 3). A medida que se incrementó la temperatura a partir de 35 °C hubo una tendencia a la disminución de la regeneración de brotes en ambos cultivares.

Tabla 3..

Regeneración de brotes a partir de callos de Phaseolus vulgaris L. en los cultivares ‘ICA Pijao’ y ‘Tío Canela-75’ a los 21 días de cultivo.

En el control y cuando se utilizó 30 °C se observaron mayores valores de regeneración de brotes en el cultivar ‘ICA Pijao’ en comparación con el cultivar ‘Tío Canela -75’. Esta respuesta pudiera estar relacionada con la condición genotipo dependiente de P. vulgaris cuando es cultivado in vitro. Similares resultados fueron obtenidos por Collado et al. (2013) en cinco cultivares de P. vulgaris en condiciones in vitro y encontraron diferencias en la regeneración de brotes entre ellos.

Sólo cuando se empleó 35 °C el número de brotes regenerados fue mayor en el cultivar tolerante. La aplicación de este estrés, podría haber inducido la activación de los factores de golpe térmico (HSFs) y la expresión de proteínas de estrés por calor (HSPs) que podrían modificar la relación entre auxinas y citoquininas, y activar la acción de la segunda (Salman et al., 2019). Posteriormente, la síntesis de proteínas de estrés por calor de bajo peso molecular (sHSPs) de cloroplastos, permitiría proteger el fotosistema II y los tilacoides de la labilidad por estrés ( Wang et al., 2016 ). Ambos procesos justificarían el enverdecimiento notable de los callos al ser transferidos a la luz, en medio de cultivo de regeneración de brotes con 6-BAP.

CONCLUSIONES

Las variables longitud de la radícula, longitud de la plúmula, porcentaje de callos formados y número de brotes regenerados permiten diferenciar la respuesta in vitro a altas temperaturas de los cultivares ‘ICA Pijao’ (susceptible a altas temperaturas) y ‘Tío Canela- 75’ (tolerante). Se puede emplear 35 °C, como agente selectivo, para conducir la selección in vitro a estrés térmico con estos cultivares de P. vulgaris L.