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Comunicación corta Biotecnologia vegetal vol. 2: 43-46, enero-marzo 2002
Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens de suspensiones celulares embriogénicas del cultivar híbrido de plátano FHIA 21(AAAB)
Borys Chong*, Dion Daniels, Rafael Gómez Kosky, Idalmis Bermúdez, Maritza Reyes, Bárbara Ocaña. * Autor para correspondencia.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, C.P. 54830, Santa Clara,Villa Clara. Cuba. Fax:(53-42) 281329, Tel: (53-42) 281693, 281257. e-mail: borys_chong@yahoo.es
RESUMEN
El mejoramiento genético de plátanos y bananos es de gran importancia por el nivel de consumo de estos en el ámbito mundial. La transformación genética constituye una vía alternativa para el mejoramiento genético y ha venido a complementar las metodologías tradicionales. En este trabajo se estudian mediante la expresión transitoria de la β-glucuronidasa algunos parámetros de la transformación genética de plátano cultivar híbrido FHIA-21 mediada por Agrobacterium tumefaciens. Se hace un estudio de las cepas de Agrobacterium tumefaciens AT-2260 y EHA-105, ambas con el plásmido pCAMBIA-3301. Se realizó una comapración entre los tiempos de infección y tiempos de cocultivo. La cepa de mejor comportamiento fue la EHA-105. En el estudio de el tiempo de infección y de cocultivo la mejor combinación resultó ser la de dos horas de infección y seis días de cocultivo.
Palabras clave: At-2260, EHA-105, β-glucuronidasa, Musa
ABSTRACT
The genetic improvement of plantain and banana is of great importance for its level of consumption on a world-wide scale. Genetic transformation constitutes one alternative for genetic improvement and has complemented traditional techniques. In this work some parameters of genetic transformation of plantain were studied by means of transient expression of â-glucoronidase in the hybrid cultivar FHIA-21(AAAB) by Agrobacterium tumefaciens. A study with the β-Agrobacterium tumefaciens strains AT-2260 and EHA-105, both with the plasmid pCAMBIA-3301 was done. A comparison between the time of infection and time of co-culture was studied. The strain of better behavior was EHA-105. In the study of the time of infection and co-culture, the best combination resulted to be the one with two hours of infection and six days of co-culture.
Key words: At-2260, EHA-105, β-glucoronidase, Musa
INTRODUCCIÓN
La producción mundial de bananos y plátanos (Musa spp.) se estima alrededor de 95.1 millones de toneladas anuales (FAO, 2000). Estos son los cultivos de más importancia en los países del trópico y subtrópico, porque además de alimento, suministran empleo e ingreso a los miembros de estas comunidades. Hasta la fecha los programas de mejoramiento genético tradicionales se ven limitados debido a la baja fertilidad y la poca germinación de la semilla (Grapin 1995). Estas dificultades pueden superarse desarrollando alternativas de mejoramiento por medio de la biotecnología y la ingeniería genética. Mediante las técnicas de ingeniería genética se pueden introducir genes que mejoren las características agronómicas de esta especie.
Este trabajo tuvo como objetivo optimizar algunos parámetros de la transformación genética de plátano cultivar híbrido FHIA-21 mediante Agrobacterium tumefaciens estudiando la expresión del gen gusA en suspensiones celulares embriogénicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y medios de cultivo
Para la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens se emplearon suspensiones celulares de Musa spp., cv FHIA-21 (AAAB) obtenidas de estructuras embriogénicas originadas a partir de callos formados de fascículos nodales provenientes de flores masculinas inmaduras, en el medio de cultivo propuesto por Escalant et al. (1994).
Para establecer la metodología de transformación se utilizaron 150ìl de células a una concentración del 33% de volumen de células sedimentadas (VCS). Las suspensiones tenían diez días de subcultivadas y se encontraban a 27ºC de temperatura, oscuridad y una velocidad de agitación de 90 rpm.
Cepas bacterianas y plásmido
En el experimento se utilizaron las cepas de Agrobacterium tumefaciens AT-2260 y EHA-105 portando el plásmido pCAMBIA 3301, el cual contiene el gen bar (Thompson et al., 1987) que codifica para la enzima fosfinotricina N-acetil transferasa que confiere resistencia a los herbicidas que contengan fosfinotricina como producto activo. Este gen se encuentra regulado por el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) y el terminador 35S poliadenilado del mismo virus y el gen reportero gusA (Jefferson et al., 1987) que codifica para la enzima β-glucuronidasa y está regulado por el mismo promotor del gen bar y por la secuencia terminadora T-NOS poliadenilada de la enzima nopalina sintetasa de Agrobacterium.
Transformación de suspensiones celulares
Un primer experimento tuvo como objetivo determinar con que cepa de Agrobacterium tumefaciens y a qué densidad óptica (DO600) se obtenía la mayor actividad transitoria de la enzima β-glucuronidasa. Para esto se probaron las cepas de Agrobacterium tumefaciens AT-2260 y EHA-105.
Los cultivos bacterianos fueron previamente crecidos en medio de cultivo LB (10 g.l-1 de triptona, 5 g.l-1 de extracto de levadura,10 g.l-1 NaCl) durante 24 horas. Posteriormente se pasaron al medio de inducción (sales AB 1X, 2mM NaH2PO4, 30 mM MES, glucosa 1%, 200 ìM acetosiringona). Se estudiaron dos densidades ópticas (DO600=0,5 y DO600=1.0) para cada cepa.
En un segundo experimento se estudió el tiempo de infección. Para ello se dejaron las cepas bacterianas infestando las células vegetales durante dos y seis horas, transcurrido estos tiempos las mismas se colocaron en medio de cultivo semisólido para el crecimiento celular suplementado con acetosiringona 200 ìM.
Se utilizó la cepa de Agrobacterium tumefaciens con la que mejor resultado se obtuvo en el primer experimento.
Se realizó un tercer experimento en el cual se estudiaron dos tiempos de cocultivo en presencia de la cepa bacteriana.
Para esto se dejaron las células vegetales durante tres y seis días en medio de cultivo semisólido, oscuridad y 21ºC.
A los datos obtenidos se le aplicó un análisis de varianza de clasificación simple y el grado de significación fue determinado mediante el test de rango múltiples de Duncan.
Para el procesamiento de los datos se empleó el paquete estadístico SPSS ver. 9.0.
Actividad transitoria GUS
El ensayo histoquímico GUS fue realizado acorde al protocolo propuesto por Jeferson (1987). La actividad GUS fue analizada después del cocultivo y luego de una incubación a 37 ºC en la oscuridad durante 12-14 horas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La presencia de puntos azules mostró la inserción y expresión del gen gusA en las células de plátano cultivar híbrido FHIA-21. El número de puntos azules varió considerablemente entre los tratamientos realizados.
En el primer experimento los mejores resultados se obtuvieron con la cepa EHA-105 y densidad óptica DO600=1,0 donde se visualizaron 32 puntos azules como promedio por cada 150 μl de células al 33% de VCS (Figura 1).
Esta cepa es una derivada de la EHA-101 sin el gen de resistencia a kanamicina. Pérez (2000) refirió que la cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA-101 fue la que mejor afinidad mostró con células de varios cultivares de banano durante experimentos de quimiotaxis y expresión transitoria de la β-glucuronidasa.
En el segundo experimento se utilizó la cepa EHA-105, en este no se observaron diferencias significativas entre los tiempos de infección utilizados (Figura 2).
En el tercer experimento se observó una diferencia marcada entre los dos tratamientos. El tiempo de cocultivo influyó notablemente en la expresió transitoria de la b-glucuronidasa, obteniéndose 85 puntos azules como promedio por cada 150 μl de células al 33% de VCS cuando se dejó el cocultivo por seis días (Figura 3).
Las condiciones óptimas de cocultivo impidieron el crecimiento excesivo de la bacteria en los tiempos evaluados, por lo que no se afectaron las células vegetales. Al estar en contacto la bacteria un mayor tiempo con el tejido vegetal, hubo una mayor transferencia de ADN a las células y por consiguiente una mayor expresión del gen gusA.
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REFERENCIAS
Bieberach, C (1995) Embriogénesis somática y regeneración de plantas en cultivares de Musa spp. Tesis presentada en opción al grado científico de Magister Scientiae. CATIE, Turrialba, Costa Rica. 86p
Escalant JV, Teisson, C y Cote, F (1994) Amplified somatic embryogenesis from male flowers of triploid banana and plantain cultivars (Musa spp.). In Vitro Cell Dev. Biol 30:181-186
Jefferson RA 1987. Assaying chimeric genes in plants: The Gus gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405
Jefferson, A, Kavavagh, A, y Bevan, M, (1987) GUS fusion: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. The EMBO Journal 6: 3901-3907
Pérez JB (2000) Development and application of Agrobacterium-mediated genetic transformation to increase fungus-resistance in banana (Musa spp.). Doctoraatsproefschrift Nr. 442 aan de Facuteit Landbouwkundige en Togepaste Biologische Wetenschappen van de K.U. Leuven
Thompson, C, Movva, R, Tizard, R, Cramer,i R, Davies, J, Lauwereys, M y Bottermann J (1987) Characterization of the herbicide resistance gene bar from Streptomices higroscopicus. EMBO J. 9: 2519- 2523
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