Estrategia de innovación tecnológica para el empleo de embriogénesis somática en medios de cultivo semisólido en  Musa  spp. y su impacto económico

Miguel Suárez-Castellá; Rafael Gómez-Kosky; Borys Chong-Pérez; Maritza Reyes; Leyanis García-Águila; Zoe Sarría; Pedro Orellana; Alexis Rodríguez; Robin Triana; Zaida Pérez; Milagros González; Miladys León; Blanca Pérez

Sintitul4

NOTA TÉCNICA

Biotecnología Vegetal Vol. 12, No. 1: 41 - 48, enero - marzo, 2012
ISSN 2074-8647, RNPS: 2154 (Versión electrónica)
ISSN 1609-1841, RNPS: 0397 (Versión impresa)

Estrategia de innovación tecnológica para el empleo de embriogénesis somática en medios de cultivo semisólido en Musa spp. y su impacto económico

Strategy of technological innovation to use somatic embryogenesis on semisolid culture media in Musa spp. and its economic impact

Miguel Suárez-Castellá*, Rafael G. Kosky, Borys Chong-Pérez, Maritza Reyes, Leyanis García-Águila, Zoe Sarría, Pedro Orellana, Alexis Rodríguez, Robin Triana, Zaida Pérez, Milagros González, Miladys León, Blanca Pérez.

Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas.

RESUMEN

La embriogénesis somática como tecnología de propagación ha sido reconocida por muchos autores como la futura generación en la regeneración de plantas por biotecnología, a escala masiva, por las ventajas en la eficiencia productiva. Sin embargo, se han registrado en la literatura científica especializada los problemas que han confrontado diversas experiencias en su empleo. Se destacan los bajos porcentajes de germinación de los embriones somáticos formados, la presencia de plantas fuera de tipo y los pocos estudios de las plantas en campo, lo que ha limitado su aplicación en la producción de plantas in vitro a escala comercial. El Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) concibió una estrategia de innovación tecnológica que viene aplicando durante los últimos tres años en el escalado para la producción comercial de más de 300 000 plantas in vitro de plátanos y bananos (`Grande naine', `Cavendish enano', `FHIA 18' y `FHIA 21'). El presente trabajo pretende mostrar las ventajas de la producción masiva de plantas in vitro de plátanos y bananos con el empleo de embriogénesis somática en medio de cultivo semisólido. Se realizaron análisis comparativos de los principales gastos de producción de la embriogénesis somática y la organogénesis. A partir de los resultados se constató que el empleo de embriogénesis somática como tecnología para la producción masiva de plantas es viable, eficiente y constituye una herramienta clave en la producción de alimentos.

Palabras clave: bananos y plátanos, biofábrica, escalado de tecnología.

ABSTRACT

Somatic embryogenesis as a propagation technology has been recognized by many authors as the future generation of plant regeneration on mass scale due to the advantages in production efficiency. However, specialized scientific literature has stated the problems faced by various experiences in the use of this technology. It highlights the presence of off-types plants and the few studies of plants in the field, which has limited its application in the in vitro plant production at a commercial scale. The Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) developed a strategy of technological innovation that has been used for the past three years in the production at commercial scale of more than 300 000 in vitro plants of plantains and bananas (`Grande naine', `Dwarf Cavendish','FHIA 18' and 'FHIA 21'). Based on that experience, this paper aimed to show the economic advantages using somatic embryogenesis for plantain and banana propagation in semisolid culture media. Comparative analysis of the main concepts of production cost in somatic embryogenesis and organogenesis werw used. Results demostrated that the use of somatic embryogenesis as a mass production of plants technology is viable, efficient and a key tool for food production.

Keywords: banana and plantain, biofactory, scaling technology.

INTRODUCCIÓN

La embriogénesis somática es un proceso de regeneración de plantas que ha sido descrito para especies vegetales dicotiledóneas y monocotiledóneas. Este ofrece la posibilidad de formación y multiplicación ilimitada de embriones somáticos con capacidad de germinación y regeneración de plantas completas (Ibaraki y Kurata, 2001).

La importancia de la embriogénesis somática (Kosky, 1998) se resume en:

• es el sistema de regeneración de plantas más eficiente debido a la naturaleza bipolar del embrión somático,

• ofrece la posibilidad de automatizar todo el proceso de propagación in vitro,

• permite obtener altos coeficientes de multiplicación en cortos períodos de tiempo,

• da la posibilidad de encapsular estas estructuras y obtener semillas artificiales.

A nivel internacional existen varias metodologías de propagación de plantas de Musa spp. por embriogénesis somática. Las más reconocidas han sido las desarrolladas por Escalant et al. (1994) en el CIRAD-FLHOR, Francia y por Schoot (1997) en la Universidad Católica de Lovaina, en Bélgica. Sin embargo, en todas las variantes hay elementos no abordados que constituyen limitaciones para la validación de la embriogénesis somática para Musa spp. como tecnología comercial de propagación masiva de plantas. Estas se concentran en: bajos porcentajes de germinación de los embriones somáticos formados, presencia de plantas fuera de tipo e insuficientes estudios en campo de plantas obtenidas por esta vía. Por ello, la estrategia de innovación debe estar encaminada a su solución.

Por estas razones, la embriogénesis somática, en el género Musa, se ha empleado fundamentalmente como herramienta en programas de mejoramiento genético (Daniels et al., 2002; Dai et al., 2010). No obstante, Côte et al. (2000) y López et al. (2005) refieren su posible uso para la propagación in vitro de plantas de cultivares de plátanos y bananos.

En Cuba, la propagación in vitro a escala comercial tiene más de 20 años de experiencia práctica, preferentemente mediante tecnologías de propagación vía organogénesis y con énfasis en determinados cultivares de plátanos y bananos. Sin embargo, en muchos de estos su empleo se ha limitado por la presencia de bajos coeficientes de multiplicación. El cultivo en inmersión temporal ha contribuido, a corto plazo, a la propagación in vitro de este cultivo (De Feria et al., 2005; Basail et al., 2007). La necesidad de producir material vegetal de plantación de alta calidad ha requerido de la búsqueda de alternativas que garanticen el incremento de la eficiencia en los métodos de propagación in vitro.

El Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) reconociendo la potencialidad de la embriogénesis somática, la alta demanda existente de plantas in vitro de este cultivo, que requiere de mayor eficiencia económica y considerando las limitaciones ya mencionadas de este método de regeneración, desarrolló bajo una estrategia de innovación tecnológica, un grupo de trabajos científico y productivos que permitieran validar la embriogénesis somática en Musa spp. como una tecnología viable y transferible para la producción a escala comercial de plantas in vitro.

El presente trabajo muestra la estrategia innovadora desarrollada y los impactos económicos en la producción de plantas in vitro por el empleo a gran escala de la embriogénesis somática en bananos y plátanos.

Estrategia de innovación para el empleo de la embriogénesis somática como tecnología de propagación comercial de plantas in vitro de Musa spp.

Esta estrategia parte del análisis de las limitaciones reconocidas de la embriogénesis somática en los bananos y plátanos para que sea validada como tecnología de propagación de plantas escala comercial. Se concibió y aplicó una estrategia que tuvo en cuenta la solución de estas limitantes, que incluyó las variables tecnológicas que influyen y aspectos clave para el empleo progresivo de esta tecnología en las biofábricas o laboratorios comerciales de cultivo de tejidos.

La estrategia de innovación tecnológica desarrollada contempló tres componentes:

1. determinación de la variante tecnológica a emplear para el desarrollo de la embriogénesis somática,

2. definición de los retos tecnológicos a través de investigaciones de I+D y,

3. resultados de las investigaciones y el escalado productivo en biofábrica.

A continuación se define cada componente de la estrategia.

Determinación de la variante tecnológica a emplear para el desarrollo de la embriogénesis somática

En los últimos años se han logrado avances en el escalado de la embriogénesis somática como tecnología para la propagación masiva de plantas del género Musa. Para ello, se han desarrollado distintas variantes derivadas del empleo de diversos equipos y técnicas modernas, aunque en todos los casos presentan limitaciones para su validación absoluta (Kosky et al., 2002; Posada-Pérez et al., 2003).

A partir de los resultados logrados en el desarrollo de la embriogénesis somática en Musa spp. se procedió a analizar la variante más idónea para su aplicación en los laboratorios comerciales de cultivo de tejidos (Biofábricas) (Tabla 1).

Un análisis de las tres variantes mencionadas, sobre la base de sus ventajas y desventajas tecnológicas y teniendo como factor común el empleo de medios de cultivo líquido permitió concluir que:

· se requiere de elevados gastos de inversión inicial para su empleo en los laboratorios comerciales de cultivo de tejidos (Biofábricas),

· se puede enfrentar resistencia al cambio tecnológico en los laboratorios comerciales de cultivo de tejidos (Biofábricas) por sustitución de la propagación vía organogénesis por embriogénesis somática,

· a pesar de las publicaciones científicas al respecto, existían dudas en cuanto a la validez de estas tecnologías a escala comercial.

El empleo de la tecnología de propagación masiva en Musa spp. vía embriogénesis somática mediante las variantes tecnológicas anteriores requiere de preparación técnica, rigor y experiencia por el personal, para la ejecución de las operaciones de trabajo, esto implica capacitación del personal en la nueva tecnología. Además, se necesita de una inversión en equipamiento para su empleo (Biorreactores, SIT, agitador orbital, entre otros).

Como consecuencia de este análisis se determinó la conveniencia en la definición y desarrollo de una variante de aplicación de la tecnología de embriogénesis somática para la propagación masiva de plantas in vitro en Musa spp. con el empleo de medios de cultivo semisólidos.

• se definió un nuevo método para optimizar el establecimiento de las suspensión celulares (Chong-Pérez et al., 2005; Chong-Pérez et al., 2007),

• se determinaron las concentraciones de reguladores de crecimiento mínimas a emplear, así como el número óptimo de subcultivos de las suspensiones celulares (Kosky et al., 2000; Kosky et al., 2001; Chong-Pérez et al., 2005),

• se diseñó un medio de cultivo específico para la fase de maduración de los embriones somáticos que potenciaba su germinación (Kosky et al., 2000),

• se definió una fase de crecimiento de las plantas para aprovechar la germinación asincrónica de los embriones somáticos con el empleo de medios de cultivo semisólidoy

• se determinaron los principales índices tecnológicos de cada fase de la embriogénesis somática y se constató que los resultados fueron superiores a la producción de plantas in vitro empleando organogénesis.

El escalado productivo de esta tecnología contempló la producción de 365 347 plantas in vitro de plátanos y bananos, en especial de los cultivares `Grande naine', `Cavendish enano', `FHIA 18' y `FHIA 21'.

Un análisis comparativo entre la embriogénesis somática Musa spp. empleando medios de cultivo semisólidos y la organogénesis demostró la viabilidad de esta variante seleccionada.

Entre las ventajas se destacaron: como promedio se incrementó en 10 veces el coeficiente de multiplicación, se simplificó la manipulación del material vegetal en la cabina de flujo laminar por el personal, se disminuyeron los porcentajes de contaminación microbiana, se redujeron los gastos de personal, reactivos e insumos, se incrementó en un 30.0% la productividad del trabajo en la cabina de flujo laminar así como se requiere una inversión mínima de equipamiento para su empleo. No obstante, tiene como desventaja la falta de sincronización en la germinación de los embriones somáticos.

Las ventajas de esta variante son:

· disminución de los gastos de inversión inicial respecto al resto de las variantes,

· tiene algunos puntos comunes con las tecnologías de micropropagación vía organogénesis y por ende menos barreras para el cambio tecnológico,

· constituye una variante de tránsito hacia la ES en medios de cultivo líquido y de hecho para la formación del capital humano necesario para la producción comercial y a escala masiva de plantas in vitro.

Definición de retos tecnológicos a través de investigaciones de I+D

Para la solución de las limitaciones de la embriogénesis somática y de las variables que influyen se definieron retos específicos de carácter investigativo y productivo tales como:

• definición del tipo de explante inicial y la época idónea de recolección en campo,

• definición de variables para la selección de callos con estructuras embriogénicas idóneos,

• determinación del tiempo óptimo de cultivo de la suspensión celular y número adecuado de subcultivos,

• estudio sobre la multiplicación secundaria de los embriones somáticos,

• definición de concentraciones mínimas de reguladores de crecimiento a emplear y en general de medios de cultivos simples,

• estudios para lograr sincronización de la germinación de los embriones somáticos,

• escalado a nivel de producción comercial y diseño del sistema de organización, planificación y control de la producción, calidad y los costos y,

• estudios de estabilidad genética y comportamiento productivo por varios ciclos de cosecha en campo de las plantas de diferentes cultivares de Musa obtenidas por embriogénesis somática.

Resultados de la investigación y el escalado productivo en biofábrica

Las soluciones derivadas del desarrollo de las investigaciones del tipo I+D para cada una de las variables definidas, permitió conformar una tecnología para la propagación masiva de plantas in vitro de Musa spp. Esta fue implementada en la biofábrica del IBP para su escalado. Entre los principales resultados de las investigaciones realizadas se encuentran:

• se determinó el tipo de explante a emplear y la influencia del número de brácteas emitidas en el momento de la colecta, la mejor época del año en que se debe hacer su recolección en campo, para la formación de callos con estructuras embriogénicas, lo que optimizó el establecimiento in vitro (García-Aguila et al., 2006; García-Aguila et al., 2009; Posada-Pérez et al., 2010),
• se definió un nuevo método para optimizar el establecimiento de las suspensión celulares (Chong-Pérez et al., 2005; Chong-Pérez et al., 2007),
• se determinaron las concentraciones de reguladores de crecimiento mínimas a emplear, así como el número óptimo de subcultivos de las suspensiones celulares (Kosky et al., 2000; Kosky et al., 2001; Chong-Pérez et al., 2005),
• se diseñó un medio de cultivo específico para la fase de maduración de los embriones somáticos que potenciaba su germinación (Kosky et al., 2000),
• se definió una fase de crecimiento de las plantas para aprovechar la germinación asincrónica de los embriones somáticos con el empleo de medios de cultivo semisólido y
• se determinaron los principales índices tecnológicos de cada fase de la embriogénesis somática y se constató que los resultados fueron superiores a la producción de plantas in vitro empleando organogénesis.

El escalado productivo de esta tecnología contempló la producción de 365 347 plantas in vitro de plátanos y bananos, en especial de los cultivares ‘Grande naine’, ‘Cavendish enano’, ‘FHIA 18’ y ‘FHIA 21’.

Un análisis comparativo entre la embriogénesis somática Musa spp. empleando medios de cultivo semisólidos y la organogénesis demostró la viabilidad de esta variante seleccionada.
Entre las ventajas se destacaron: como promedio se incrementó en 10 veces el coeficiente de multiplicación, se simplificó la manipulación del material vegetal en la cabina de flujo laminar por el personal, se disminuyeron los porcentajes de contaminación microbiana, se redujeron los gastos de personal, reactivos e insumos, se incrementó en un 30.0% la productividad del trabajo en la cabina de flujo laminar así como se requiere una inversión mínima de equipamiento para su empleo. No obstante, tiene como desventaja la falta de sincronización en la germinación de los embriones somáticos.

Además, se trabajó en la definición de los principales subsistemas para el desarrollo de la producción masiva de plantas in vitro, principalmente los de organización del trabajo, planificación y control de la producción y los recursos, calidad, así como el cálculo de los costos de producción.

Como parte del escalado se realizó una generalización en otras biofábricas y empresas agrícolas del país en ocho provincias, que incluyó tanto la evaluación de esta tecnología en la producción de plantas in vitro como su evaluación en campo.

Las investigaciones y el escalado realizado pretendieron dar solución a las limitaciones reconocidas internacionalmente que tiene la embriogénesis somática como tecnología de propagación masiva de plantas in vitro de Musa spp. (bajos porcentajes de germinación de los embriones somáticos formados, presencia de plantas fuera de tipo e insuficientes estudios en campo de plantas obtenidas por esta vía).

Se constató que como promedio a partir de 4.0 ml de suspensión celular se formaron 10 240 embriones somáticos (±50.0) con germinación superior al 90.0%.

En la fase de aclimatización no se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje de supervivencia de plantas in vitro obtenidas por embriogénesis somática (98.0%) y por organogénesis (97.6%).

En relación con la presencia de plantas fuera de tipo los resultados alcanzados en el escalado de la embriogénesis somática con medios de cultivo semisólidos en la producción de plantas in vitro de Musa fueron positivos. En una población de 13 000 plantas de `Cavendish enano' (Musa AAA) obtenidas mediante embriogénesis somática con medios de cultivo semisólidos y evaluadas en la fase de aclimatización se constató que solo el 0.1% de ellas presentaba cambios fenotípicos (Tabla 2).

En los estudios en campo con plantas de diferentes cultivares de plátanos y bananos obtenidas mediante embriogénesis somática se pudo precisar que también fueron bajos los porcentajes de plantas con cambios fenotípicos (Tabla 3).

La embriogénesis somática en medios de cultivo semisólido presenta ventajas respecto a la organogénesis, lo cual se refleja en la eficiencia económica de la producción de plantas in vitro. Existe un grupo de aspectos que se pudieron precisar durante el escalado en la biofábrica de esta tecnología que posibilita mayores ventajas de la embriogénesis somática entre las que se encuentran:

· se simplifican las acciones de los operarios de cabina de flujo laminar, en especial en las fases de germinación y crecimiento de las plantas lo que propicia altos niveles de productividad del trabajo,

· se disminuyen los gastos de reactivos al producir mayores volúmenes de plantas por explante inicial (aprox. 10 000 a partir de 4.0 ml de suspensiones celulares), esto posibilita ahorro en los gastos de producción,

· disminuyen las pérdidas por contaminación microbiana ya que es menor el tiempo en que se expone el material vegetal ante los operarios
de cabinas de flujo laminar, en especial en las fases de germinación y crecimiento de las plantas.

Un análisis comparativo sobre algunas variables seleccionadas en la producción de 10 000 plantas in vitro de Musa spp. vía embriogénesis somática en medios de cultivo semisólido, con respecto a organogénesis, en un periodo de 4 meses, permitió corroborar sus ventajas (Tabla 4).

El impacto económico de la tecnología desarrollada es significativo ya que se reducen los costos de producción además de todas las ventajas señaladas.

El cálculo de la ficha de costos para la producción de plantas in vitro mediante esta tecnología confirma la disminución de los gastos respecto al empleo de organogénesis (Tabla 5).

CONCLUSIONES

La embriogénesis somática de Musa spp. en medios de cultivo semisólido por sus ventajas constituye una variante innovadora ya que requiere menor gasto de inversión inicial, es más compatible con la organogénesis, en especial en las fases de germinación y crecimiento, lo que podría frenar la resistencia al cambio que genera esta tecnología en su transferencia.

La estrategia de innovación tecnológica se sustentó en la solución de las principales limitaciones reconocidas internacionalmente sobre la embriogénesis somática hasta convertir la variante decidida en una opción tecnológica viable y poderosa para la producción de plantas in vitro de Musa spp.

La embriogénesis somática en medios de cultivo semisólido desarrollada por el IBP constituye una tecnología de propagación a escala masiva de plantas in vitro de Musa spp. que representa la primera muestra de la nueva generación tecnológica para la propagación comercial de plantas, de ahí la importancia de estos resultados.

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Recibido: 20-7-2011
Aceptado: 30-9-2011

Miguel Suárez-Castellá.Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54. 830. e-mail: miguel@ibp.co.cu

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