Efecto de la concentración de 2,4-D en la formación de embriones somáticos en variedades cubanas de soya

Idalmis Bermúdez-Caraballoso; Teresa Del Socorro Blanco; Jorge L. Pérez-Pérez; Lourdes R. García; Novisel Veitía; Raúl Collado; Damaris Torres; Carlos Romero

Vol. 12, No.2, 2012.pmd

Art�culo cient�fico                                                   Biotecnolog�a Vegetal Vol. 12, No. 2: 93 - 97, abril-junio, 2012


  ISSN 2074-8647 (Versi�n electr�nica)

Efecto de la concentraci�n de 2,4-D en la formaci�n de embriones som�ticos en variedades cubanas de soya

I. Berm�dez-Caraballoso¹*, T. Del Socorro Blanco ², J. P�rez-P�rez³, L. R. Garc�a¹, N. Veit�a¹, R. Collado¹, D. Torres¹, C. Romero¹ *Autor para correspondencia

instituto de Biotecnolog�a de las Plantas. Universidad Central 'Marta Abreu' de Las Vilias. Carretera a Camajuan� km 5. 5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: idalmis@ibp.co.cu

²Escuela de Ingenier�a Agroindustrial, Instituto Universitario de la Paz. Carretera a Bucaramanga km 15. Barrancabermeja, Colombia

³Centro de Estudios de Biotecnolog�a Vegetal. Universidad de Granma. Carretera v�a Manzanillo, km17.5, Peralejo, Bayamo, Granma, Cuba. CP 85 100

RESUMEN

En el cultivo de la soya para desarrollar nuevos programas de mejoramiento gen�tico, es necesario contar con sistemas eficientes de regeneraci�n de plantas, sin embargo por su condici�n genotipo dependiente no es posible aplicar los desarrollados previamente. El presente trabajo tuvo como objetivo: determinar el efecto de la concentraci�n de �cido 2,4 diclorofenoxiac�tico (2,4-D) en la formaci�n de embriones som�ticos en las variedades cubanas de soya (Incasoy-1, Incasoy-24, Incasoy-27e Incasoy-35). Como material vegetal se utilizaron cotiledones inmaduros. Se establecieron tres tratamientos seg�n la concentraci�n de 2,4-D (30, 40 y 50 mg l¹). A los 30 d�as se cuantific� el n�mero de embriones som�ticos formados por cotiled�n inmaduro. La concentraci�n de 2,4-D requerida para obtener la mayor formaci�n de embriones som�ticos en las variedades cubanas de soya vari� en dependencia del qenotipo (30 mg �¹ para Incasoy-24' 40 mg M para Incasoy-27 e Incasoy-35' 40 y 50 mg l¹ para Incasoy-1) Sobre la base de los resultados se seleccion� la concentraci�n de 40 mg l*¹ para las variedades cubanas con excepci�n de la Incasoy-24 que respondi� mejor a una concentraci�n de 30 mgr¹. Estos resultados pueden contribuir al desarrollo de nuevos programas para el mejoramiento gen�tico de la soya en Cuba.

Palabras clave: embriog�nesis som�tica, Glycine max, regeneraci�n de plantas

ABSTRACT

Developing new breeding programs of soybean crops needs an efficient systems for plants regeneration. Eventhough due this is impossible taking into account its genotype dependent condition. This study aimed to: determine the effect of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) concentration in the formation of somatic embryos in soybean Cuban varieties (Incasoy-1, Incasoy-24, Incasoy-27 and lncasoy-35). .mmature cotyledons were used as plant material. Three treatmentswere established according tothe concentrations of 2,4-D (30, 40 and 50 mg l¹). The number of somatic embryos per immature cotyledon were evaluated after 30 days. The necessary concentration of 2,4-D to obtain the mayor formation of embryos depended on the genotypes (30 mg l¹ for Incasoy-24; 40 mg l^- for lncasoy-27 and lncasoy-35; 40 and 50 mg M for rIcasoy-1). Dependdng oo the results obtained the concentration 40 mg �¹ forthe cuban varieties was selected The lncasoy-24 was the exception since it responded betterwith a concentration of 30 mg r¹. These results favorthe development of new programs for genetic breedig of soybeans in Cuba.

Keywords: somatic embryogenesis, Glycine max, plants regeneration

INTRODUCCI�N

La soya [Glycine max (L.) Merril] es uno de los cultivos m�s importantes en el mundo por su alto contenido de prote�nas y aceite (Wiebke-Strohm etal., 2011). En Cuba, representa una alternativa econ�mica importante para la alimentaci�n humana y animal (Marrero etal.,

2004). Por tales motivos, el blanco principal para los mejoradores en la familia de las leguminosas se ha encaminado al mejoramiento de las variedades para la resistencia a factores bi�ticos, abi�ticos, condiciones de estr�s e incremento de la calidad nutricional de las semillas, que limitan sus rendimientos especialmente en los pa�ses tropicales y subtropicales (Angenon y Thu., 2011). No obstante, uno de los factores limitantes para desarrollar estos programas de mejoramiento gen�tico ha sido no contar con un sistema eficiente de regeneraci�n de plantas v�a embriog�nesis som�tica, por su condici�n genotipo-dependiente (Parrott et al., 1989; Hiraga et al., 2007), lo cual limita el empleo de los protocolos ya existentes. Es por ello imprescindible, el desarrollo de protocolos de regeneraci�n de plantas en variedades cubanas con importancia para el mejoramiento gen�tico.

Por todo lo antes expuesto el presente trabajo tuvo como objetivo: determinar el efecto de la concentraci�n de �cido 2,4 diclorofenoxiac�tico (2,4-D) en la formaci�n de embriones som�ticos en las variedades cubanas de soya.

MATERIALES Y M�TODOS

Se emplearon las variedades cubanas de soya, Incasoy-1, Incasoy-24, Incasoy-27 e Incasoy-35. Como control se utiliz� el genotipo Williams-82, en consideraci�n a que se ha probado en los protocolos empleados como referencia en este estudio (Bailey et al., 1993; Saymolov et al., 1998). Las semillas de todas las variedades fueron aportadas por el Instituto Nacional de Ciencias Agr�colas de Cuba (INCA).

Como explante para el inicio del proceso de embriog�nesis som�tica se emplearon cotiledones inmaduros provenientes de semillas de vainas cosechadas entre 12 y 15 d�as despu�s de la antesis. Las vainas se lavaron con una soluci�n de agua y detergente comercial, luego se desinfectaron sumergi�ndolas en alcohol al 70% (v/v) durante 20 segundos seguido de una segunda desinfecci�n en una soluci�n de hipoclorito de sodio (NaClO al 3 0 % (v/v) y seis gotas de Tween-20durante diez minutos. Al t�rmino de este tiempo, y en c�mara de flujo laminar se enjuagaron qpk veces con agua destilada est�ril. Las semillas inmaduras fueron separadas de las vainas \i el pytremn rlonrle se enrnntmba el eje embrionario fuTcortado descartado Los dos wtiledones fueron unaores^ corte Par_S^Teltab^^LZ d7lol m Pdnn Inmaduros _SP n n el nmcPd^miPnt� decrito por Rp m Hp Caraba tos et al (2010 Bermúdez-

Se establecieron tres tratamientos seg�n la concentraci�n de 2,4-D (30, 40 y 50 mg M) en las variedades cubanas y el control (Williams-82). Cada tratamiento estuvo conformado por cinco r�plicas cada una con cuatro explantes, con dise�o completamente al azar.

Los frascos fueron incubados en c�maras de crecimiento, provista por l�mparas fluorescentes, con fotoper�odo 16/8 horas luz/oscuridad, 26±2°C e intensidad luminosa de 5-10 uE rrr² s¹ seg�n lo propuesto por Lazzeri et al. (1987).

A los 30 d�as de cultivo se cuantific� el n�mero de embriones som�ticos formados por cotiled�n inmaduro.

An�lisis estad�stico

Para el procesamiento de los datos se us� el programa estad�stico Statistic Package for Social Science (SPSS) versi�n 16.0 sobre Windows. La comparaci�n de los datos se realiz� mediante la prueba no param�trica de Kruskall Wallis previa comprobaci�n de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.

RESULTADOS Y DISCUSI�N

La concentraci�n de 2,4-D tuvo un efecto significativo en la formaci�n de embriones som�ticos en las variedades cubanas de soya. De las variedades Incasoy-27 e Incasoy-35 se logr� el mayor n�mero de embriones som�ticos en el medio de cultivo que conten�a 40 mg M de 2,4-D. Los resultados con esta concentraci�n difirieron significativamente en estas variedades con las concentraciones de 30 y 50 mg M de 2,4-D (Figura 1).

En las variedades Incasoy-1 y Williams-82 el mayor n�mero de embriones som�ticos formados se logr� en las concentraciones de 40 y 50 mg M de 2,4-D sin diferencias significativas. En contraste, en la variedad Incasoy-24 los valores m�s altos se obtuvieron con 30 mg l¹ de 2,4-D en el medio de cultivo, con diferencias significativas con las otras concentraciones estudiadas. Este resultado evidencia la condici�n genotipo-dependiente de la especie en lo que respecta a la capacidad de respuesta de las diferentes variedades a la concentraci�n de la auxina ex�gena requerida para inducir la respuesta embriog�nica (Figura 1 y 2).

En estudios similares, Hiraga et al. (2007), encontraron que la mejor respuesta embriog�nica, asociada al n�mero de embriones som�ticos formados en variedades japonesas de soya, se logr� con concentraciones de auxina que fluctuaron entre 40 y 80 mg I"¹ de 2,4-D. Estos autores sugirieron que las diferencias en la respuesta se debieron posiblemente tanto a la sensibilidad de cada variedad al 2,4-D como a los niveles end�genos de auxina presentes en el explante. El nivel end�geno de hormonas vegetales, es considerado uno de los factores cruciales que influyen en el potencial embriog�nico de los explantes Por ejemplo en Arabidopsss thaliana i se ha encontrado que tanto los primordios cotiledonales como los cotiledones tienen altos niveles de auxina end�gena los cuales se correlacionan con la alta comnetencia embrioa�nica exhibida �or H y H estos tejidos (Gaj 2004)

La alta eficiencia del 2,4-D para inducir la respuesta embriog�nica en diferentes variedades de soya tambi�n fue demostrada por Yang et al. (2009), quienes encontraron diferencias altamente significativas en la respuesta embriog�nica de 98 variedades chinas de soya (0.0% hasta 85.7% de cotiledones inmaduros con embriones som�ticos), asociadas al empleo de 40 mg r¹de 2,4-D en el medio de cultivo para la formaci�n de embriones som�ticos. Seg�n estos autores, los resultados pudieron estar asociados a diferencias en la sensibilidad de los genotipos a esta auxina sint�tica.

Aunque generalmente, se ha manifestado que para inducir la embriog�nesis som�tica en soya se requieren concentraciones relativamente altas de 2,4-D (40 mg l-¹). En este sentido, Lazzeri et al. (1985), obtuvieron m�s del 90% de cotiledones inmaduros con respuesta embriogénica cuando emplearon 5.0 mg M de 2,4-D. Resultados similares, se encontraron en Beversdorf y Bighman (1977); Christianson et al. (1983); Lippman y Lippmman (1984). En contraste, Loganathan et al. (2010), no obtuvieron respuesta embriogénica en una variedad taiwanesa de soya cuando emplearon un amplio rango de concentraciones de 2,4-D (9.06; 18.12; 27.19; 36.26 y 45.32 mg V).

El 2,4-D es una de las auxinas m�s empleadas para la inducci�n de la embriog�nesis som�tica en soya y se ha demostrado que puede tanto inhibir la elongaci�n de las c�lulas (Saymolov etal., 1998) como promover su divisi�n (Griga, 2002), a trav�s de un est�mulo en la divisi�n celular asim�trica (Schnabely Frugolicol., 2004) y afectar la regulaci�n y balance end�geno de hormonas (Moon e Hildebrand, 2003). Las diferencias en el efecto inductor, usualmente son asociadas a la capacidad de cada genotipo para programar y reprogramar gen�ticamente las c�lulas competentes embriog�nicamente en respuesta al efecto que ejercen los factores externos.

La concentraci�n de 2,4-D requerida para obtener la mayor formaci�n de embriones som�ticos en las variedades cubanas de soya evaluados, vari� en dependencia del genotipo (30 mg M para Incasoy-24; 40 mg M para Incasoy-27 e Incasoy-35; 40 y 50 mg V para Incasoy-1). Sobre la base de los resultados, se seleccion� la concentraci�n de 40 mg f¹ para las variedades cubanas con excepci�n del Incasoy-24 que respondi� mejor a una concentraci�n de 30 mg M.

Por otra parte, se considera que el 2,4-D puede regular adecuadamente el metabolismo end�geno del �cido indol-3-ac�tico (AIA), comparado con otros reguladores de crecimiento vegetal sint�ticos empleados para la embriog�nesis som�tica. En otras especies como la zanahoria (Daucus carota L), el incremento en la respuesta embriog�nica como resultado de la exposici�n al 2,4-D ex�geno, estuvo asociada con un incremento de los niveles de AIA end�geno, lo cual sugiere que la auxina sint�tica 2,4-D tiene un efecto indirecto significativo sobre la embriog�nesis som�tica posiblemente debido a disturbios causados sobre el metabolismo de la auxina end�gena. Igualmente se ha considerado que el 2 4-D promueve �a producci�n de AIA asociado a prote�nas, lo que incrementa la sensibilidad de las c�lulas al AIA y les confiere competencia embriog�nica (Sharma etal. 2007).

En el mismo sentido, Jim�nez (2005) plant� que la sensibilidad de un tejido al cambio en la concentraci�n de hormonas (probablemente percibida por un receptor en particular) es m�s importante que el cambio en la concentraci�n por s� misma. Esta sensibilidad puede ser evidenciada por el hecho de que el tejido responde solamente en presencia de reguladores de crecimiento presentes en el medio de cultivo. La sensibilidad a las auxinas podría explicarse, al menos parcialmente, sobre la base de las diferentes respuestas entre las especies de plantas, genotipos o células en el mismo explante o entre diferentes explantes en la misma especie, en su capacidad de convertirse en embriogénico. Por tanto, las diferencias en la sensibilidad probablemente son la consecuencia de la variación en la habilidad de ciertos explantes en producir los receptores apropiados.

CONCLUSIONES

Los resultados mostraron que la concentraci�n de 2,4-D influy� en la formaci�n de embriones som�ticos en las variedades cubanas de soya estudiadas. Se demostr� la condici�n genotipo dependiente de este cultivo. Estos resultados pueden contribuir al desarrollo de nuevos Programas para el Mejoramiento gen�tico de la soya en Cuba.

REFERENCIAS

Angenon, G ThuTT(2001)Grain legume ieprovomene through genetic transformation. En: Pratap A and Kumar J. (Ed) Biology of food legumes pp 178-192 CABI. Kanpur, India Bailey, MA, BoermaHR, ParrottWA(1993)Genotype effects on proliferative embryogenesis and plant regeneration of soybean. In Vitro Cellular & Developmental Biology 29:102-108 Berm�dez-Caraballoso, I, Del Socorro Blanco T, P�rez-P�rez J, Garc�a LR, Veit�a N, Collaad o, Torres D, Romero C, Roque B (2010) Efecto de la orientaci�n y la longitud del cotileed� inmaduro sobre la formaci�n de embriones som�ticos en dos genotipos cubanos de soya. Biotecnolog�a Vegetal 10(2):121-128 Beversdorf, WD, Bingham ET (1977) Degrees of differentiation obtained in tissue cultures of Glycine species. Crop Sci. 17:307-311 Christianson, ML, Warnick DA, Carlson PS (1983) A morphogenetically competent soybean suspensi�n culture. Science 222: 632-634 Gaj, MD (2004) factors influencing somatic embryogenesis induction and plant regeneration with particular reference to Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Growth Regulation 43: 27-47 Griga M (2002) Morphology and anatomy of Pisum sativum somatic embryos. Biolog�a Plantarum 45 (2): 173-182 Jim�nez, VM (2005) Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryogenesis. Plant Growth Regulation 47: 91-110 Hiraga, S, Minakawa H, Takahashi K, Takahashi R, Hajika M, Harada K, Ohtsubo N (2007) Evaluation of somatic embryogenesis from immature cotyledons of Japanese soybean cultivars. Plant Biotechnology 24: 435-440 Lazzeri, PA, Hildebrand DF, Collins GB (1985) A procedure for plant regeneration from immature cotyledon tissue of soybean. Plant Molecular Biology Reports 3:160-167 Lazzeri, PA, Hildebrand DF, Collins GB (1987) Soybean somatic embryogenesis: effects of nutritional, physical and chemical factors. Plant Cell Tissue and Organ Culture 10:197-208 Lippmann, B, LippmannG(1984) Induction of somatic embryos in cotyledonary tissue of soybean, Glycine max L. Merr. Plant Cell Reports 3:215-218 Loganathan, M, Maruthasalam, S, Shiu, LY, Lien, WC, Hsu, WH, Lee, PF, Yu, CW, Lin, CH (2010)Regeneration of soybean {Glycine max L. Merril) throught direct somatic embryogenesis from the immature embryonic shoottip. In vitro Cell. Dev. Biol. 46(3): 265-273 Moon, H, Hildebrand D (2003) Effects of proliferation, maturation and desiccation methods on conversi�n of soybean somatic embryos. In vitro Cellular and Development Biology-Plant 39: 623-628 Samoylov, VM, Tucker DM, Parrott WA (1998) Soybean [Glycine max (L.) Merrill] Embryogenic cultures: the role of sucrose and total nitrogen conten� on proliferation. In Vitro Cellular and Developmental Biology 34: 8-13 Schnabel, EL, Frugoli J (2004) The PIN and LAX families of auxin transport genes in Medicago truncatula. Mol Gen Genomics 272: 420-432 Sharma, SK, Bryan GJ, Millam S (2007) Auxin pulse treatment holds the potential to enchance efficiency and practicability of somatic embryogenesis in potato. Plant Cell Rep. 26:945-950 Wiebke-Strohm B, Droste A, Pasquali Q Borges MO, Bucker-Neto L, Pereira LMP, Bencke M, Schenkel MH, Margis-Pinheiro M, Bodanese-Zanettini MH (2011) Transgenic fertile soybean plants derived from somatic embryos transformed via the combined DNA-free particle bombardment and Agrobacterium system. Euphytica 177(3): 343-354 Yang, C, Zhao T, Yu D, Gai J (2009) Somatic embryogenesis and plant regeneration in chinese soybean {Glycine max (L.) Merr.): impacts of mannitol, abscisic acid, and explant age. In Vitro CellDevBiol-Plant45:180-188

(Recibido 12-1-2012; Aceptado 27-2-2012)

Biotecnología Vegetal eISSN 2074-8647, RNPS: 2154. ISSN 1609-1841, RNPS: 0397 Editada por: Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba CP 54 830 Tel: 53 42200124, e-mail: info@ibp.co.cu

Biotecnología Vegetal está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial 4.0 Internacional.